一種麻瘋樹基因、重組質(zhì)粒及在提高植物抗鹽、耐旱性中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，提供了一種從麻瘋樹克隆得到的基因JcSnRK2、含所述基因的真核重組質(zhì)粒及植物轉(zhuǎn)化體，實驗表明：JcSnRK2基因的表達(dá)能夠促進(jìn)擬南芥SnRK2.8缺失型植株根系的生長，明顯提高其耐高鹽及抗干旱能力，降低葉片的失水率，能夠激發(fā)響應(yīng)滲透脅迫的下游基因的表達(dá)。因此，本發(fā)明所述JcSnRK2基因和真核重組質(zhì)?？稍谔岣咧参锟果}、耐旱性中應(yīng)用。
【專利說明】一種麻瘋樹基因、重組質(zhì)粒及在提高植物抗鹽、耐旱性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種從麻瘋樹克隆得到的基因、含所述基因的真核重組質(zhì)粒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在植物的生長和發(fā)育過程中，經(jīng)常會遭遇到各種環(huán)境壓力，譬如干旱、鹽堿、高溫或寒冷、氧化、營養(yǎng)缺乏、病原體侵入等等，特別是全球水資源緊張以及近一半農(nóng)業(yè)灌溉土地受到高鹽脅迫的影響，造成農(nóng)作物產(chǎn)量下降甚至引起植物死亡。近年來，通過基因工程手段進(jìn)行人工育種已經(jīng)成為賦予植物逆境耐受能力的主要生物手段。
[0003]SnRK2 (鹿糖非酵解型蛋白激酶 2，sucrose non-fermentingl-related proteinkinase2)與植物的逆境脅迫應(yīng)答關(guān)系密切，目前認(rèn)識相對全面的是擬南芥和水稻，均各有 10 個家族成員，前者命名為 SnRK2.1 -SnRK2.10 (Hrabak EM, et al.,2003, TheArabidopsis CDPK - SnRK superfamily of protein kinases, Plant Physiology,132,666 - 680)，后者命名為 SAPKl -SAPK10 (Kobayashi Y, et al.,2004, Differentialactivation of the rice sucrose nonfermentingl-related protein kinase2familyby hyperosmotic stress and abscisic acid, The Plant Cell,16(5):1163-1177)。最近也有關(guān)于小麥TaSnRK2.4和玉米ZmSAPK8基因功能的分析，其在擬南芥中的過量表達(dá)均能提高轉(zhuǎn)基因植株的多種抗脅迫能力(Mao XG, et al.,2010, TaSnRK2.4, an SNFl-typeserine/threonine protein kinase of wheat(Triticum aestivum L.)，confersenhanced multistress tolerance in Arabidopsis, Journal of Experimental Botany,61 (3):683 - 696 ;Ying S, et al.,2011, Cloning and characterization of a maizeSnRK2protein kinase gene conf`ers enhanced salt tolerance in transgenicArabidopsis, Plant Cell R印，30:1683 - 1699)。雖然SnRK2家族受到關(guān)注和研究，但在木本植物中卻鮮有研究，在麻瘋樹(Jatropha curcas L.)的研究中也尚未見報道。通過克隆技術(shù)篩選出更多的SnRK2基因，對于提高植物抗性，培育出能夠在高鹽、干旱條件下仍能正常生長的植物具有重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是提供一種從麻瘋樹克隆得到的基因、含所述基因的真核重組質(zhì)粒及植物轉(zhuǎn)化體，本發(fā)明的目的之二是將所述基因和真核重組質(zhì)粒在提高植物抗鹽、耐旱性中應(yīng)用，以培育出具有高鹽、干旱抗性的植株。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]利用現(xiàn)有草本植物SnRK2基因的保守序列設(shè)計擴(kuò)增中間片段的簡并引物，根據(jù)所得中間片段序列進(jìn)行5' Race和3' Race分別獲得上、下游序列，然后根據(jù)拼接序列設(shè)計特異引物，以麻瘋樹葉片總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到基因全長，命名為JcSnRK2。序列分析顯示，所述JcSnRK2基因的mRNA包含1017個堿基的開放閱讀框，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示,其基因組DNA核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示,所述JcSnRK2基因編碼的多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:3所示。生物信息學(xué)分析和基因表達(dá)模式分析顯示，JcSnRK2基因?qū)儆赟nRK2家族成員。
[0007]本發(fā)明所述真核重組質(zhì)粒，由序列表中SEQ ID No:1所示的核苷酸序列與真核表達(dá)載體構(gòu)成，序列表中SEQ ID No:1所示核苷酸序列正向插入真核表達(dá)載體的Xba I和BamH I雙酶切位點，所述真核表達(dá)載體為pBI121、pBI221或pBin438。
[0008]本發(fā)明所述植物轉(zhuǎn)化體，是將上述真核重組質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌侵染花序法導(dǎo)入擬南芥SnRK2.8缺失型植株形成，經(jīng)過卡那霉素抗性篩選、⑶S染色及PCR鑒定，得到JcSnRK2基因穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子。實驗表明:JcSnRK2基因的表達(dá)能夠促進(jìn)擬南芥SnRK2.8缺失型植株根系生長，明顯提高其耐高鹽及抗干旱能力，降低葉片的失水率，能夠激發(fā)響應(yīng)滲透脅迫的下游基因的表達(dá)。因此，本發(fā)明所述JcSnRK2基因和真核重組質(zhì)粒可在提高植物抗鹽、耐旱性中應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明具有以下有益效果: [0010]1、本發(fā)明通過Race法克隆了一個新的麻瘋樹基因JcSnRK2，將該基因與真核表達(dá)載體構(gòu)建真核重組質(zhì)粒，為提高植物抗鹽、耐旱性提供了一種新的真核重組質(zhì)粒。
[0011]2、本發(fā)明通過實驗證明所述真核重組質(zhì)粒能夠提高植物耐高鹽及抗干旱的能力，能夠降低葉片的失水率，能夠激發(fā)響應(yīng)滲透脅迫的下游基因的表達(dá)，因而可將所述重組質(zhì)粒在人工抗性育種中應(yīng)用，以培育出具有高鹽、干旱抗性的植株。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為實施例1中麻瘋樹葉片總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中，M泳道:分子量標(biāo)記(AL2000DNAMarker，購自艾德萊公司)，I泳道:麻瘋樹葉片總RNA。
[0013]圖2為實施例1中JcSnRK2中間片段的PCR擴(kuò)增電泳圖，圖中，M泳道:分子量標(biāo)記(AL2000DNAMarker)，I泳道:JcSnRK2中間片段的擴(kuò)增結(jié)果。
[0014]圖3為實施例1中3’ Race擴(kuò)增JcSnRK2基因的下游片段電泳圖，圖中，M泳道:分子量標(biāo)記(AL2000DNAMarker)，I泳道:JcSnRK2下游片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0015]圖4為實施例1中5’ Race擴(kuò)增JcSnRK2基因的上游片段電泳圖，圖中，M泳道:分子量標(biāo)記(AL2000DNAMarker)，I泳道:JcSnRK2上游片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0016]圖5為實施例1中JcSnRK2基因ORF的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖，圖中，M泳道:分子量標(biāo)記(AL2000DNAMarker)，1、2泳道:JcSnRK2基因ORF的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0017]圖6為實施例1中JcSnRK2基因ORF的菌落PCR結(jié)果電泳圖，圖中，M泳道:分子量標(biāo)記(AL2000DNAMarker)，1-10泳道:10個轉(zhuǎn)化子的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0018]圖7為實施例1中JcSnRK2基因組DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖，圖中，M泳道:分子量標(biāo)記(AL15000DNAMarker，購自艾德萊公司)，泳道1、2為JcSnRK2基因組DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0019]圖8為實施例1中JcSnRK2基因組DNA的序列結(jié)構(gòu)分析圖。
[0020]圖9為實施例2中麻瘋樹與6種其它植物的SnRK2基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析圖。
[0021]圖10為實施例2中麻瘋樹JcSnRK2與擬南芥SnRK2蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析圖。
[0022]圖11為實施例2中JcSnRK2基因編碼的多肽的氨基酸序列分析。
[0023]圖12為實施例2中JcSnRK2基因的組織特異性表達(dá)分析圖。
[0024]圖13為實施例2中JcSnRK2基因在ABA處理下的表達(dá)情況分析圖。
[0025]圖14為實施例2中JcSnRK2基因在鹽脅迫下的表達(dá)情況分析圖。
[0026]圖15為實施例2中JcSnRK2基因在干旱脅迫下的表達(dá)情況分析圖。
[0027]圖16為實施例2中JcSnRK2基因在冷脅迫下的表達(dá)情況分析圖。
[0028]圖17為本發(fā)明所述真核重組質(zhì)粒的一種示意圖。
[0029]圖18為實施例3中雙酶切電泳圖，圖中，M泳道:分子量標(biāo)記(AL2000DNAMarker)，I泳道:pBI121質(zhì)粒XbaI和BamHI雙酶切產(chǎn)物，2泳道:pBI121質(zhì)粒；3泳道:pET-JcSnRK2質(zhì)粒；4泳道:PET-JcSnRK2質(zhì)粒的XbaI和BamHI雙酶切產(chǎn)物。
[0030]圖19為實施例3中轉(zhuǎn)pBI121-JcSnRK2農(nóng)桿菌菌落PCR電泳圖，圖中，M泳道:分子量標(biāo)記(AL2000DNAMarker)，1-7泳道-J個轉(zhuǎn)化子的擴(kuò)增結(jié)果。
[0031]圖20為實施例3中轉(zhuǎn)JcSnRK2基因擬南芥⑶S染色圖，其中，圖A、B、C分別為幼苗、角果和花的GUS染色圖。
[0032]圖21為實施例3中轉(zhuǎn)JcSnRK2基因擬南芥PCR驗證電泳圖，圖中，圖(A)為轉(zhuǎn)JcSnRK2基因擬南芥基因組PCR鑒定結(jié)果，圖(B)為RNA的RT-PCR鑒定結(jié)果；1-6泳道:轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR結(jié)果；7泳道:非轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR結(jié)果。
[0033]圖22是實施例3中snf2.8和JK2根生長情況分析圖，其中，圖㈧為snf2.8和JK2于MS培養(yǎng)基生長I周后幼苗的根長情況圖，圖(B)為snf2.8和JK2于MS培養(yǎng)基生長I周后幼苗的根長情況統(tǒng)計圖，圖(C)為snf2.8和JK2在土中培養(yǎng)45天的幼苗根系生長情況圖。
[0034]圖23是實施例3中snf2.8和JK2發(fā)芽率統(tǒng)計圖。
[0035]圖24是實施例3中snf2.8和JK2在鹽脅迫下的生長狀況圖，其中，上排和下排分別為snf2.8和JK2在含有不同濃度NaCl的MS培養(yǎng)基上生長I個月后的狀況圖。
[0036]圖25是實施例3中snf2.8和JK2植株抗鹽性分析圖，其中，圖A為生長30天的幼苗被450Mm NaCl溶液脅迫2周和I個月后的生長狀況圖，圖B為生長45天的幼苗被450MmNaCl溶液脅迫2周和I個月后的生長狀況圖。
[0037]圖26是實施例3中snf2.8和JK2在干旱脅迫下的生長狀況圖，其中，圖A為snf2.8和JK2在含不同濃度甘露醇的MS培養(yǎng)基上生長I個月后的概況，圖B為snf2.8和JK2在含不同濃度甘露醇的MS培養(yǎng)基上生長I個月后的具體表型。
[0038]圖27是實施例3中snf2.8和JK2植株抗旱性分析圖，其中，上排和下排分別為生長30天、45天的snf2.8和JK2幼苗停止供水I個月后的生長狀況圖。
[0039]圖28是實施例3中離體葉片失水率檢測結(jié)果圖。
[0040]圖29是實施例3中JcSnRK2及其下游基因AREBl、LEA、RD29A、RD29B在干旱脅迫下的表達(dá)水平檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0041]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。下述實施例中，凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如Sambrook等著的分子克隆:實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),實驗動物常規(guī)手冊(國家實驗動物規(guī)范中心，2004年11月):基本技術(shù)指南第五版(John ffiley&Sons, Inc, 2005)中所述的條件及實驗步驟，或按照制造廠商所建議的條件及實驗步驟。
[0042]下述實施例中，麻瘋樹成熟種子和麻瘋樹花采自海南省三亞市鳳凰鎮(zhèn)水蚊村，麻瘋樹根、莖、葉取自用麻瘋樹成熟種子培育的麻瘋樹幼苗，培育操作:將麻瘋樹成熟種子播種于花盆中，在溫室(30~35°C)、24h全光照條件下培養(yǎng)一至兩個月。
[0043]實施例1:麻瘋樹JcSnRK2基因的分子克隆
[0044]1、麻瘋樹葉片總RNA的提取
[0045]麻瘋樹葉片總RNA的提取使用Plant RNeasy Kit (Qiagen),具體步驟如下:
[0046]I)取麻瘋樹葉片≤0.lg，液氮充分研磨，加入450 μ I RLC (預(yù)先加入β -巰基乙醇)，劇烈振蕩；
[0047]2)將液體移入紫色濾柱中，置于2ml收集管，室溫，14，OOOrpm離心2min，濾液入
1.5mlEP管，小心勿吸入沉淀；
[0048]3)加入相當(dāng)于濾液1/2體積的無水乙醇，抽打混勻；
[0049]4)將樣品，包括沉淀移入粉色濾柱，室溫，10，OOOrpm離心15s，棄濾液；
[0050]5)加入 700μ1 RWlbuffer,室溫，10，OOOrpm 離心 15s,清洗過柱;
[0051]6)加入500μ1 RPE，室溫，10，OOOrpm離心15s，清洗過柱，重復(fù)該操作一次；
[0052]7)室溫，14, OOOrpm 離心 Imin,棄濾液；
[0053]8)將濾柱放入1.5ml收集管中，加入30~50 μ I RNase-free水，室溫，10, OOOrpm離心Imin即得麻瘋樹葉片總RNA。
[0054]其瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示。
[0055]2、JcSnRK2基因中間片段的獲得
[0056]2.1Reverse Transcriptase M-MLV 合成 cDNA 第一鏈
[0057]按照反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (TaKaRa)的操作說明進(jìn)行，以步驟I所得麻瘋樹葉片總RNA為模板，Olig0(ClT)18S引物。
[0058]在RNase-free 的 0.2ml PCR 管中加入
[0059]麻瘋樹葉片總RNA3 μ I (約500ng)
[0060]01igo(dT)18 (50 μ Μ) I μ I
[0061]用RNase-free ddH20 將體積補(bǔ)充至 6 μ I。
[0062]混勻后，70°C保溫IOmin后迅速在冰上急冷2min以上，然后短暫離心使管中溶液集于EP管底部。在冰上依次加入以下試劑:5XM-MLV Buffer2 μ I ；dNTP (10 μ Μ) 0.5 μ I ；RNaseInhibitor0.3 μ I ；RTase M-MLV0.5 μ I ；RNase-free ddH200.7 μ I?；旌暇鶆蚝笤俅畏湃隤CR儀42°C反應(yīng)lh，70°C反應(yīng)lOmin，存于_20°C備用。
[0063]弓丨物Oligo(ClT)18 序列為:5 ' -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3/
[0064]2.2PCR
[0065]于冰上在一個0.2ml的EP管中加入以下組分:
[0066]
【權(quán)利要求】
1.一種從麻瘋樹克隆得到的基因，其特征在于該基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo:1所示。
2.一種真核重組質(zhì)粒，其特征在于該重組質(zhì)粒由序列表中SEQ ID No:1所示的核苷酸序列與真核表達(dá)載體構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述真核重組質(zhì)粒，其特征在于所述真核表達(dá)載體為PBI121、PBI221 或pBin438。
4.一種植物轉(zhuǎn)化體，其特征在于該轉(zhuǎn)化體是將權(quán)利要求2或3所述真核重組質(zhì)粒導(dǎo)入擬南芥中形成。
5.權(quán)利要求2 或3所述真核重組質(zhì)粒在提高植物抗鹽、耐旱性中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01H5/00GK103451215SQ201310398768
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月4日
【發(fā)明者】淳俊, 王勝華, 陳放 申請人:四川大學(xué)