一種小菜蛾溶菌酶Ⅱ及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小菜蛾溶菌酶Ⅱ及制備方法與應(yīng)用。所述小菜蛾溶菌酶Ⅱ（lysozymeⅡ）基因的核苷酸如SEQIDNO:1～2所示；其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。將小菜蛾溶菌酶Ⅱ基因的序列或其成熟肽序列利用基因重組技術(shù)在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，通過腸激酶切割獲得對蘇云金芽孢桿菌具有殺菌活力的小菜蛾溶菌酶Ⅱ。在不久的將來應(yīng)用溶菌酶Ⅱ來控制蘇云金芽孢桿菌的危害，并將很有意義和推廣應(yīng)用價值。
【專利說明】一種小菜蛾溶菌酶II及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種小菜蛾溶菌酶II及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]Fleming首次報道了溶菌酶(Fleming, 1922)。溶菌酶(Lysozyme)全稱為1，4-β-Ν-溶菌酶，又稱粘肽N-乙?；邗Ｋ饷?，是一種小分子堿性蛋白，專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，廣泛存在于人、動物、植物和微生物中。它是一種作用于微生物細(xì)胞，根據(jù)作用的微生物的種類不同，可分為細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶和真菌細(xì)胞壁溶菌酶。根據(jù)作用位點不同，細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶可分為:水解肽聚糖主鏈的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間β_1，4糖苷鍵的胞壁質(zhì)酶，作用于肽聚糖側(cè)鏈酰胺鍵的酰胺酶，和作用于肽鏈尾端的內(nèi)肽酶(Salazar and Asenjo, 2007)。根據(jù)來源不同可分為:T4曬菌體溶菌酶(Arisaka et al., 2003)、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和動物溶菌酶(Callewaert andMichiels, 2010),其中動物溶菌酶又細(xì)分為:C 型(chicken-lysozyme type) (Chandanet al., 1965)、G 型(goose-type)(Canfield and McMurry, 1967; Huang et al., 2011;Whang et al., 2011)和 I 型(invertebrate-type)溶菌酶(Joskovd et al., 2009;Olsen et al., 2003; Yue et al., 2011; Zhang et al., 2010; Zhao et al., 2007)。大部分溶菌酶都屬于C型，從人乳汁、尿和胎盤中提取的溶菌酶也屬C型(Canfield andMcMurry, 1967)。
[0003]目前已知的幾種溶菌酶有:內(nèi)-N-乙酰己糖胺酶、酰胺酶、β-1，3、β_1，6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、磷酸甘露糖酶、脫乙酰殼多糖酶(劉瑩等，2006)。參與細(xì)菌細(xì)胞壁溶解作用的溶菌酶大致可分為作用于糖苷鍵和作用于肽和酰胺部分的兩類。內(nèi)-N-乙酰己糖胺酶、β-1，3、β-1，6葡聚糖酶等主要作用于糖苷鍵，使糖苷鍵斷裂，破壞細(xì)胞壁的分子結(jié)構(gòu)，而酰胺酶等則主要作用于多肽，使多肽斷裂。以內(nèi)-N-乙酰己糖胺酶為例，內(nèi)-N-乙酰己糖胺酶能夠催化水解細(xì)胞壁肽聚糖分子中的N-乙酰胞壁酸(NAM)與N-乙酰葡萄糖氨(MG)之間的β-1，4糖苷鍵，破壞肽聚糖支架，在內(nèi)部滲透壓的作用下細(xì)胞脹裂開，引起細(xì)菌裂解。有些革蘭氏陰性菌，如埃希氏大腸桿菌、傷寒沙門氏菌，也會受到溶菌酶的破壞。人和動物細(xì)胞無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)亦無肽聚糖，故溶菌酶對人體細(xì)胞無毒性作用(Blake et al., 1965; Canfield and McMurry, 1967)。溶菌酶可選擇性地分解微生物細(xì)胞壁，能抑制某些細(xì)菌而不能降解真菌的細(xì)胞壁，溶菌酶對革蘭氏陽性菌(G+)有很好的殺滅作用，對革蘭氏陰性菌(G_)大腸桿菌也具有一定程度溶解，溶菌酶對兩者溶菌作用的區(qū)別是由于兩者微生物的細(xì)胞壁中肽聚糖含量不同而存在差異，G+細(xì)胞壁含80%肽聚糖，而G—細(xì)胞壁只有在內(nèi)壁層含有少量肽聚糖。因此，溶菌酶能有效殺死G+菌，而對G—細(xì)胞破壞很小(葉丹和連賓，2003)。溶菌酶一方面具有胞壁質(zhì)酶活性，即能水解肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1，4糖苷鍵，引起細(xì)胞裂解。另一方面，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，溶菌酶具有陽離子抗菌肽活性(Abdou et al., 2007; Herbert et al., 2007;Ibrahim et al., 2001; Thammasirirak et al., 2010),它獨立于胞壁質(zhì)酶活性而存在，主要與溶菌酶的結(jié)構(gòu)，電荷分布，表面疏水性有關(guān)。
[0004]隨著環(huán)境的污染日益嚴(yán)重，科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和人民生活水平的提高，人們對食品和醫(yī)藥的安全性要求越來越高，許多國家對某些化學(xué)防腐劑已限制使用，因此高效、安全、具有天然活性成分的溶菌酶勢必倍受人們的關(guān)注。目前，國外對溶菌酶進(jìn)行了較深入的研究，我國對溶菌酶的研究、應(yīng)用起步較晚，雖然相繼開展了一些有關(guān)溶菌酶提取和應(yīng)用方面的研究工作，但與發(fā)達(dá)國家相比溶菌酶制造業(yè)規(guī)模小、設(shè)備和生產(chǎn)技術(shù)相對落后。當(dāng)前，國內(nèi)外主要從蛋清中提取溶菌酶，因為從蛋清中提取溶菌酶，是一項生產(chǎn)相對簡單、投資較少、見效快的工程，對于畜產(chǎn)品深加工、綜合利用，均有巨大的經(jīng)濟(jì)價值。蛋清溶菌酶在國外已于20世紀(jì)80年代進(jìn)入規(guī)模化生產(chǎn)，上世紀(jì)90年代末以來，已形成近千噸的市場規(guī)模，溶菌酶生產(chǎn)廠家主要分布在歐美亞等地。其中丹麥、加拿大占世界市場的一半以上，由于我國生物酶工程研究起步比較晚，我國于20世紀(jì)80年代對蛋清溶菌酶技術(shù)開始研究，已多次列為國家/863計劃及/十五計劃等的重點科研攻關(guān)項目。目前國內(nèi)已投產(chǎn)的蛋清溶菌酶企業(yè)有許多家，全國年產(chǎn)量不足50噸，溶菌酶的生產(chǎn)尤其是高活性的溶菌酶供應(yīng)還不能滿足我國日益增長的需求。
[0005]小菜蛾，屬于鱗翅目菜蛾科，別名:小青蟲、兩頭尖，英文名:Diamond back moth ；學(xué)名jnutelhi xylostella (L.);是一種世界性遷飛害蟲。目前生產(chǎn)實際中對小菜蛾的防治多以化學(xué)防治為主，且隨著化學(xué)藥劑的大量使用，帶來了環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留超標(biāo)影響食品安全等一系列問題，更為嚴(yán)重的是造成小菜蛾的抗性不斷增強(qiáng)，給化學(xué)防治帶來更大困難。目前已經(jīng)報道了小菜蛾有機(jī)氯、有機(jī)磷；氨基甲酸酯、酰基脲、阿維菌素；蘇云金桿菌等50 多種殺蟲劑產(chǎn)生嚴(yán)重抗性(Han et al.2010; Schuler et al.2004)。
[0006]蘇云金芽孢桿菌(ifeci77i/5.簡稱Bt)于1901年由日本生物學(xué)家S.1shiwata從家蠶中發(fā)現(xiàn)，1915年德國Berliner從地中海粉螟分離并命名，蘇云金芽孢桿菌簡稱蘇云金桿菌，是內(nèi)生芽孢的革蘭氏陽性土壤細(xì)菌，在芽孢形成初期會形成殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal protein),對敏感昆蟲有特異性的防治作用。1956年前蘇聯(lián)發(fā)表了用液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)蘇云金桿菌并用于防治菜青蟲的報道，從而揭開了蘇云金桿菌大規(guī)模培養(yǎng)的序幕。中國從上世紀(jì)60年代也開始了規(guī)?；a(chǎn)?，F(xiàn)在已經(jīng)證明Bt對鱗翅目、膜翅目、同翅目等都有作用。已有數(shù)據(jù)表明Bt對16個目3000多種害蟲有效。蘇云金芽孢桿菌制劑和轉(zhuǎn)蘇云金芽孢桿菌基因作物的推廣使用能減少化學(xué)農(nóng)藥的用量。保護(hù)生態(tài)環(huán)境，提高害蟲控制質(zhì)量。但是，蘇云金芽孢桿菌制劑和轉(zhuǎn)蘇云金芽孢桿菌基因作物的推廣所導(dǎo)致的生態(tài)風(fēng)險也不容忽視。其中最主要的生態(tài)風(fēng)險就是害蟲的抗性問題。如同化學(xué)農(nóng)藥的使用一樣，隨著蘇云金芽孢桿菌制劑及轉(zhuǎn)蘇云金芽孢桿菌基因作物的推廣應(yīng)用。害蟲在持續(xù)的選擇壓力下，也將會產(chǎn)生對蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白的抗性，甚至在一些轉(zhuǎn)蘇云金芽孢桿菌基因作物的田間種植以前，某些害蟲已經(jīng)在田間或?qū)嶒炇覘l件下對蘇云金芽孢桿菌的殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生了顯著的抗性(Heckel et al.，1997;Tabashnik, 1994，1997)。1985年Mcgallghey首次報道了印度谷螟在實驗室對蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生抗性，目前已有多種昆蟲如小菜蛾等產(chǎn)生了對蘇云金桿菌毒素的抗性(Heckel et al., 1997; Tabashnik, 1994, 1997;冷欣夫等，1996)。
[0007]本專利是在結(jié)合目前分子生物學(xué)飛躍發(fā)展的基礎(chǔ)上，利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)或轉(zhuǎn)基因植物中，將溶菌酶的活力降低、不表達(dá)或者轉(zhuǎn)抗溶菌酶的植株，目的提高或拓展Bt制劑的殺蟲效果，減少化學(xué)藥劑的大量使用，并能解決由于過多使用化學(xué)農(nóng)藥帶來的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留超標(biāo)影響食品安全等一系列問題。也解決了由于大量使用化學(xué)農(nóng)藥造成小菜蛾的抗性不斷增強(qiáng)，給化學(xué)防治帶來更大困難的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種小菜蛾溶菌酶II基因。
[0009]本發(fā)明另一目的在于提供上述小菜蛾溶菌酶II蛋白。
[0010]本發(fā)明另一目的在于提供上述小菜蛾溶菌酶II的制備方法。
[0011 ] 本發(fā)明還有一個目的在于提供上述小菜蛾溶菌酶II的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
一種小菜蛾抗菌肽lysozyme II基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示。其中SEQ ID NO:1為小菜蛾抗菌肽lysozyme II基因的全基因序列(包括5’端非編碼區(qū)、3’端非編碼區(qū)和編碼區(qū)序列)；SEQ ID NO:2為小采蛾抗囷妝lysozyme II基因的ORF序列；0RF序列能編碼140個氨基酸的蛋白。
[0013]一種小菜蛾抗菌肽lysozyme II,其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。SEQ ID NO:3為小菜蛾抗菌肽lysozyme II編碼蛋白序列，該序列由140個氨基酸組成。
[0014]一對擴(kuò)增小菜蛾抗菌肽lysozyme II的ORF序列的引物，引物的核苷酸序列如SEQID NO:9~10所示。
[0015]一種重組表達(dá)載體 ，由表達(dá)載體的多克隆位點插入如上SEQ ID NO:2所述小菜蛾溶菌酶II基因的ORF序列。
[0016]優(yōu)選地,所述重組表達(dá)載體為pET32a_PxLys。
[0017]一種重組菌株，是由如上所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體菌株構(gòu)建而成的，優(yōu)選地，所述受體菌株為表達(dá)宿主菌BL21。
[0018]一種小菜蛾溶菌酶II重組蛋白的制備方法，包括如下步驟:
51.將如上所述的重組菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600為0.8時，加入終濃度為0.4 mM IPTG，同時加入終濃度為0.2%的葡萄糖，25°C誘導(dǎo)表達(dá)9小時，離心收集菌體；
52.用預(yù)冷的TE緩沖液(pH8.0)洗滌菌體后，再用預(yù)冷的溶液I (300 mM KCl(pH8.0), 50 mM KH2PO4，5 mM咪唑)重懸菌體，超聲破碎菌體，離心收集上清液；
53.上清液經(jīng)Ni2+金屬親和層析HisTrapHP純化，純化的融合蛋白經(jīng)腸激酶酶切，酶切產(chǎn)物先后用HisTrap HP柱和超濾裝置進(jìn)行純化即得小菜蛾溶菌酶II重組蛋白。
[0019]具體地，所述小菜蛾溶菌酶II重組蛋白的制備方法，包括如下步驟:
將重組菌株BL21(DE3)按1: 50體積比接種于新鮮的LB加富培養(yǎng)基(含100 μ g/ml Amp+)中，37°C劇烈振蕩放大培養(yǎng)至OD6tltl =0.8時，加入終濃度為0.4 mM IPTG，同時加入終濃度為0.2%的葡萄糖，降低本底的表達(dá)。在25°C誘導(dǎo)表達(dá)9小時，4 0C>12, OOOg離心2min，收集菌體備用。將收集的菌體，經(jīng)超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，以300W的功率，冰浴下超聲4~5個循環(huán)(超聲4s，間歇4s，重復(fù)90次為一個循環(huán))破碎細(xì)菌細(xì)胞，4°C、12，OOOg離心30min后取上清液。經(jīng)Ni2+金屬親和層析HisTrap HP純化融合蛋白，純化的融合蛋白經(jīng)腸激酶(EK)酶切，酶切產(chǎn)物先用載體上帶有的S-Tag標(biāo)簽進(jìn)行純化，除去沒有切割和載體的污染，收集流出液，流出液再進(jìn)行第二次HisTrap HP (5 mL)柱純化，去除流出液，收集洗脫液，進(jìn)一步用截留分子量為20.0 kDa的超率裝置(Amicon)對重組蛋白進(jìn)行純化，除去20.0kDa以上的大蛋白，進(jìn)一步用截留分子量為10.0 kDa的超率裝置(Amicon)對重組蛋白進(jìn)行純化，除去10.0 kDa以下的小蛋白，除去濾過液，冷凍干燥處理，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0020]如上所述小菜蛾溶菌酶II在制備抑制或殺死蘇云金芽孢桿菌的制劑中的應(yīng)用。
[0021]為了大量表達(dá)和快速純化小菜蛾溶菌酶II，并且保持有活力的溶菌酶。本專利利用原核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)小菜蛾溶菌酶II基因，通過切割和分子量截留獲得的方法獲得具有活力的小肽，為應(yīng)用生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
[0022] 為了篩選出對蘇云金芽孢桿菌有活力的抗菌肽，我們做了大量的篩選工作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小菜蛾溶菌酶II蛋白對蘇云金芽孢桿菌有很強(qiáng)的抑制作用，顯示出潛在的應(yīng)用價值。為了在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中提高蘇云金芽孢桿菌殺蟲的效果，本發(fā)明結(jié)合本實驗室的優(yōu)勢，利用生物技術(shù)手段生產(chǎn)了小菜蛾溶菌酶II蛋白，并將蛋白對蘇云金芽孢桿菌進(jìn)行生物活性測定。利用生物活性測定檢測到小菜蛾溶菌酶II對蘇云金芽孢桿菌有很強(qiáng)的殺滅作用。通過本專利，可以利用原核細(xì)胞來表達(dá)小菜蛾溶菌酶II基因，時間短，并能結(jié)合腸激酶切割后，能快速純化重組蛋白，因此，保證了大量溶菌酶II蛋白的來源；而且利用本專利，可以很容易觀察到小菜蛾溶菌酶II對蘇云金芽孢桿菌有很強(qiáng)的作用。在不久的將來應(yīng)用小菜蛾溶菌酶II來控制蘇云金芽孢桿菌的危害，并將很有意義和推廣應(yīng)用價值。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
本發(fā)明從重要農(nóng)業(yè)害蟲小菜蛾中首次克隆得到溶菌酶II基因。在原核系統(tǒng)中得到了高效表達(dá)，通過腸激酶切割獲得具有活性的成熟肽，重組蛋白PxLy對對革蘭氏陽性菌蘇云金芽孢桿菌較強(qiáng)的抑制作用。為減少化學(xué)藥劑的大量使用，并能解決由于過多使用化學(xué)農(nóng)藥帶來的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留超標(biāo)影響食品安全等一系列問題。也解決了由于大量使用化學(xué)農(nóng)藥造成小菜蛾的抗性不斷增強(qiáng)，給化學(xué)防治帶來更大困難的問題。
[0024]說明書附圖
圖1.PxLys融合蛋白的表達(dá)框架。
[0025]圖2.SDS-PAGE電泳和western blot檢測融合蛋白PxLys ;1:原核表達(dá)的未誘導(dǎo)；
2:原核表達(dá)融合蛋白；3-4:純化的的融合蛋白；5:純化蛋白的western blot檢測。
[0026]圖3.SDS-PAGE檢檢測重組蛋白PxLys。
[0027]圖4.抑菌圈檢測重組蛋白PxLys的生物活性；Ck:超純水；1: 5 μδ/μ? Pxlys ；2: lOM-g/M-L Pxlys ；3: 15 M-g/M-L Pxlys ； 4: 20Kg/KL。
[0028]圖5.重組蛋白PxLys對B.thuringiensis的抑制生長曲線。
【具體實施方式】
[0029]下面結(jié)合附圖和具體實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。除非特別說明，實施例中采用的試劑和方法為本領(lǐng)域常規(guī)使用的試劑和方法。
[0030]實施例1小菜蛾溶菌酶II基因的克隆方法
S1.實驗室飼養(yǎng)小菜蛾iPlutella xylostella )幼蟲，用大腸桿菌(Mscherichiacoli)、蘇云金芽孢桿菌(ifeci77i/5.thuringiensis)作為供試菌種。
[0031]S2.小菜蛾轉(zhuǎn)錄組序列的測定:收集小菜蛾I齡到4齡幼蟲，預(yù)蛹、蛹、成蟲，抽取總RNA后進(jìn)行利用RNA-seq技術(shù)測定其轉(zhuǎn)錄組序列，總RNA的提取方法參照Trizol(Invitrogen，USA)試劑盒說明書操作。共測定了 34，522，812 條 clean reads, reads 平均長度為90bp，獲得3，107，053，080個堿基。最后組裝成107710個Unigene，長度范圍為20(T3000bp。COG,GO,KEGG注釋和分析后共獲得68984條具較高注釋可信度的Unigene，與昆蟲免疫直接相關(guān)的Unigenes 725條,其中l(wèi)ysozyme II的Unigene I條,其序列為420bp,如 SEQ ID NO:4 所示。
[0032]S3.根據(jù)lysozyme II的Unigene設(shè)計3'端和5'端RACE末端快速擴(kuò)增反應(yīng)的特異引物，3'端引物序列為:5' - GCCGGCAAGGACTGCAATGTCACGTGT-3'(如 SEQ ID NO:5所示)，5'端引物為 5' - CCCATGCTTCCTCAGCTCCCTCA-3'(如 SEQ ID NO:6 所示)。3'端和Y端RACE分別和UPMs配對進(jìn)行RACE末端快速擴(kuò)增反應(yīng)的特異引物，UPMs引物序列為:UPM-L:5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’(如 SEQ ID NO:7所示)和 UPM-S:5’ -CTAATACGAC TCACTATAGGGC-3’(如 SEQ ID NO:8 所示)。
[0033]S4.RACE cDNA 第一鏈合成:
首先，提取小菜蛾總RNA:用OD值為0.8~1.0的大腸桿菌菌液刺激小菜蛾4齡幼蟲，進(jìn)行肽聚糖識別蛋白的誘導(dǎo)。取0.5~Ig經(jīng)6小時誘導(dǎo)后的小菜蛾，液氮中研磨，用Trizol法提取小菜蛾總RNA ;總RNA的提取方法參照Trizol (Invitrogen，USA)試劑盒說明書操作。
[0034]按照CL0NTECH公司RACE試劑盒說明書進(jìn)行，分別合成3丨端和5丨端RACE cDNA第一鏈，10微克總RNA，加反應(yīng)液20微升42°C反應(yīng)90分鐘。72°C 10分鐘終止反應(yīng)。反應(yīng)液組成:50毫摩爾氯化鉀，3毫摩爾氯化鎂，10毫摩爾Tris-HCL pH8.3，I毫摩爾DTT，5微摩爾d NTP，25單位RNA酶抑制劑，8單位AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0035]S5.3' RACE和5' RACE反應(yīng):以步驟S4反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈為模板，S3所示的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)試劑與條件如下:
首先將下列試劑混合在一起
【權(quán)利要求】
1.一種小菜蛾溶菌酶II基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示。
2.一種小菜蛾溶菌酶II，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
3.一對擴(kuò)增小菜蛾溶菌酶II的引物，其特征在于，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9~10所示。
4.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，由出發(fā)載體的多克隆位點插入權(quán)利要求1所述小菜蛾溶菌酶II的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體為pET32a-PxlySo
6.一種重組菌株，其特征在于，是由權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體菌株構(gòu)建所得。
7.一種小菜蛾溶菌酶II蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 S1.將如上所述的重組菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600為0.8時，加入終濃度為0.4 mM IPTG，同時加入終濃度為0.2%的葡萄糖，25°C誘導(dǎo)表達(dá)9小時，離心收集菌體； S2.用預(yù)冷的TE緩沖液(pH8.0)洗滌菌體后，再用預(yù)冷的溶液I (300 mM KCl(pH8.0), 50 mM KH2PO4，5 mM咪唑)重懸菌體，超聲破碎菌體，離心收集上清液； S3.上清液經(jīng)Ni2+金屬親和層析HisTrapHP純化，純化的融合蛋白經(jīng)腸激酶酶切，酶切產(chǎn)物先后用HisTrap HP柱和超濾裝置進(jìn)行純化即得小菜蛾溶菌酶II重組蛋白。
8.權(quán)利要求2所述小菜蛾溶菌酶II在制備抑制或殺死蘇云金芽孢桿菌制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01N63/02GK103484487SQ201310411631
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】金豐良, 許小霞, 孫強(qiáng), 黃婉君 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)