一種巨大芽孢桿菌及其固體發(fā)酵制備菌劑的方法和應用的制作方法
【專利摘要】一種巨大芽孢桿菌及其固體發(fā)酵制備菌劑的方法和應用，屬于微生物制劑【技術(shù)領域】。本發(fā)明一種巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）JSSW-JD-2F5，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNO.8045。采用固體發(fā)酵，公開了巨大芽孢桿菌JSSW-JD-2F5固體發(fā)酵菌劑的制備方法，及該固體發(fā)酵菌劑的應用，用作畜禽漁業(yè)養(yǎng)殖飼料的添加劑，按質(zhì)量百分比0.01%～0.05%的比例將菌劑添加入飼料中。該菌劑產(chǎn)品含有高濃度活菌、活性酶及生理活性物質(zhì)，活菌濃度達1.0×1010CFU/g以上，能滿足飼用微生物添加劑對活菌數(shù)的要求；該菌劑的應用不僅可改善養(yǎng)殖環(huán)境，而且對提高飼料利用率，促進動物生長具有重要意義，因此在畜禽漁養(yǎng)殖中應用廣泛。
【專利說明】一種巨大芽孢桿菌及其固體發(fā)酵制備菌劑的方法和應用
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種巨大芽孢桿菌及其固體發(fā)酵制備菌劑的方法和應用，屬于微生物制劑【技術(shù)領域】。
【背景技術(shù)】
[0002]巨大芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬，它能依靠多種碳源生長，因而分布十分廣泛。巨大芽孢桿菌分泌的多種酶系具有應用價值，如淀粉酶應用于面包生產(chǎn)，青霉素酰胺酶應用于合成新型人工抗生素等。另外，一些巨大芽孢桿菌能產(chǎn)生具有抑菌作用的蛋白質(zhì)，可進一步提純抑菌蛋白作為農(nóng)用抗生素，或者克隆其編碼基因用于抗真菌病害的轉(zhuǎn)基因植物的研究等方面。可以說，巨大芽孢桿菌是一種具有多種功能的安全高效，無殘留、無毒副作用的優(yōu)良菌種。目前，在實際應用方面，巨大芽孢桿菌大多作為生產(chǎn)菌種用于生物有機肥的生產(chǎn)。
[0003]本專利涉及一種巨大芽孢桿菌及其固體發(fā)酵制備菌劑的方法，目前尚無巨大芽孢桿菌此方面的專利。目前巨大芽孢桿菌的生產(chǎn)主要采用液體發(fā)酵方法，例如專利CN101619302A 一種巨大芽孢桿菌的液體發(fā)酵工藝，需要全套的發(fā)酵罐裝置，糖類、蛋白胨等精細原料，發(fā)酵原料和生產(chǎn)方式成本高，使得產(chǎn)品價格較貴，畜禽漁養(yǎng)殖用戶難以接受；且液體產(chǎn)品運輸和貯存上都不太方便，若要制備成固體菌劑則需要通過離心、過濾、吸附干燥等工序，工藝程序多；此外，目前市場上的巨大芽孢桿菌制劑主要用作生物肥料，應用領域較窄，且有效活菌數(shù)較低。
[0004]本發(fā)明中的巨大芽孢桿菌JSSW-JD-2F5具有豐富的酶系，如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶等，對有機物具有良好的同化利用能力；其優(yōu)異的纖維素分解能力，使其能直接發(fā)酵利用麩皮、豆柏、食用菌菌糠等粗纖維含量高的農(nóng)副產(chǎn)品，制備的固體發(fā)酵菌劑作為飼料添加劑，能提高飼料利用率，促進消化吸收，促進養(yǎng)殖動物生長，增強動物免疫力和抗病力，提高成活率；減少畜禽糞便中氮、磷及氨氣、吲哚等有害氣體排放，改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境；在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應用，能分解水體中的殘餌、水生生物排泄物及尸體等，改善水質(zhì)，節(jié)水減排，提高水產(chǎn)動物免疫力、抗病力。此外，巨大芽孢桿菌JSSW-JD-2F5具有解磷作用，能降解一些頑固的難降解的殺蟲劑和土壤中的有機磷，可以用來生產(chǎn)解磷固鉀肥，對改善土壤環(huán)境具有十分重要的作用。
[0005]本發(fā)明采用固體發(fā)酵方法制備巨大芽孢桿菌菌劑，與巨大芽孢桿菌液體發(fā)酵相比，直接發(fā)酵麩皮、豆柏、食用菌菌糠等農(nóng)副產(chǎn)品，不需要添加糖類、蛋白胨等精細原料，成本低廉，沒有大量高濃度COD發(fā)酵廢水排出，菌體生長過程中產(chǎn)生的活性酶及生理活性物質(zhì)可以保留在菌劑中；發(fā)酵產(chǎn)量高，有效活菌濃度高，芽孢濃度高，且發(fā)酵后不需要離心、過濾、吸附等工序，直接干燥后即可使用，工藝簡單；菌株酶系豐富、尤其是纖維素酶活力強，不僅可用作微生物飼料添加劑廣泛應用于畜禽漁養(yǎng)殖中，還可以作為微生物解磷固鉀肥、池塘水質(zhì)改良劑等用于土壤、水體環(huán)境的改善。
[0006]鉄皮、?柏、菌糖等農(nóng)副廣品含有較豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分，是良好的動物飼料來源，但其高纖維、低容量等特征限制了其在飼料資源方面的有效利用。本發(fā)明利用巨大芽孢桿菌的固體發(fā)酵過程提高對這些飼料原料中植物性纖維資源的降解及蛋白質(zhì)的水解，代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)生有益于動物機體的生物活性作用的小分子產(chǎn)物，更利于被動物腸道吸收利用，對動物生長起到促進作用。同時，益生菌以活菌形式進入腸道后，改變腸道微生物區(qū)系，產(chǎn)生的蛋白酶、淀粉酶等活性酶作用，促進對飼料原料的水解，提高氨基酸、礦物元素的吸收利用，從而提高動物生長或生產(chǎn)性能。因此，一種巨大芽孢桿菌及其固體發(fā)酵制備菌劑的方法和應用對綜合循環(huán)利用農(nóng)副產(chǎn)品資源，提高動物生長性能具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種巨大芽孢桿菌及其固體發(fā)酵制備菌劑的方法和應用。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種巨大芽孢桿菌，其分類命名為巨大芽孢桿菌(Mcillusmegaterium) JSSff-JD-2F5,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCC N0.8045，保藏日期2013年8月19日。
[0009]所述巨大芽孢桿菌JSSW-JD-2F5固體發(fā)酵菌劑的制備方法，步驟為:
(O菌種活化:出發(fā)菌株為巨大芽孢桿菌JSSW-JD-2F5，無菌開啟菌株JSSW-JD-2F5的凍干保藏菌種，劃線接種于LB瓊脂試管斜面，28~37°C培養(yǎng)36~48h，然后劃線轉(zhuǎn)接于LB瓊脂茄子瓶斜面，28~37°C培養(yǎng)36~48h ;鏡檢，當90%以上菌體形成芽孢時，即為成熟；
(2)種子菌懸液的制備:將成熟的種子用無菌水從斜面上刮洗下來，放入內(nèi)裝無菌玻璃珠的滅菌三角瓶，振蕩分散菌泥，制成均勻的菌懸液，備用；
(3)固體發(fā)酵培養(yǎng):
固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成:按質(zhì)量百分比計，食用菌菌糠5.0%~10.0%，麩皮15.0%~
30.0%，豆柏1.0%~4.0%, CaO 0.05%~1.0%,自來水調(diào)節(jié)補足至100% ；
將固體發(fā)酵培養(yǎng)基以發(fā)酵瓶容積計10%~20% (w/v)的裝量裝入發(fā)酵瓶中，并用八層紗布封口，121°C滅菌30min ;將步驟(2)制備的菌懸液在80°C水浴中加熱10 min,以固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量計1.0%~10.0% (v/w)的接種量接入發(fā)酵瓶內(nèi)滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵瓶置于恒溫培養(yǎng)箱，28~37°C培養(yǎng)，每隔12h拍打發(fā)酵瓶壁，使瓶中物料疏散、混勻，發(fā)酵培養(yǎng)36~48h，取樣鏡檢，當90%以上菌體形成芽孢時，即發(fā)酵結(jié)束；
(4)巨大芽孢桿菌固體發(fā)酵菌劑的制備:將步驟(3)所得含巨大芽孢桿菌活菌的發(fā)酵產(chǎn)物在40~50°C下烘干，粉碎機粉碎，過40目篩，即制得巨大芽孢桿菌固體發(fā)酵菌劑成品，以系列稀釋法進行平板計數(shù)，芽孢濃度不低于1.0 X 101(lCFU/g。
[0010]用所述方法制備的巨大芽孢桿菌固體發(fā)酵菌劑的應用，用作畜禽漁業(yè)養(yǎng)殖飼料的添加劑，將巨大芽孢桿菌固體發(fā)酵菌劑按質(zhì)量百分比0.01%~0.05%的比例添加入飼料中。
[0011]本發(fā)明的有益效果:
1、巨大芽孢桿菌JSSW-JD-2F5菌株酶系豐富，具有淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶活性，尤其是纖維素酶活力強。
[0012]2、本發(fā)明中巨大芽孢桿菌的固體發(fā)酵方法與現(xiàn)有的巨大芽孢桿菌液體發(fā)酵方法相比，直接發(fā)酵麩皮、豆柏、食用菌菌糠等農(nóng)副產(chǎn)品，不需要添加糖類、蛋白胨等精細原料，成本低廉，沒有大量高濃度COD發(fā)酵廢水排出，菌體生長過程中產(chǎn)生的活性酶及生理活性物質(zhì)可以保留在菌劑中，且發(fā)酵后不需離心、過濾、吸附等工序，直接干燥后即可使用，工藝
簡單。
[0013]3、發(fā)酵時間短，發(fā)酵產(chǎn)量高，發(fā)酵36~48h即可獲得高濃度的有益活菌和芽孢。
[0014]4、菌劑產(chǎn)品中含有高濃度活菌、活性酶及生理活性物質(zhì)，活菌濃度達1.0X1010CFU/g以上，能滿足飼用微生物添加劑對活菌數(shù)的要求；將巨大芽孢桿菌固體發(fā)酵菌劑應用于畜禽漁養(yǎng)殖中，不僅可改善養(yǎng)殖環(huán)境，而且對提高飼料利用率，促進動物生長具有重要意義，因此在畜禽漁養(yǎng)殖中應用廣泛。
[0015]生物材料樣品保藏:一種巨大芽孢桿菌，其分類命名為巨大芽孢桿菌megaterium) JSSff-JD-2F5,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.8045，保藏日期為2013年8月19日。
[0016]菌株巨大芽孢桿菌JSSW-JD-2F5的形態(tài)特征為:柱狀到橢圓，單個或呈短鏈排列，(1.2~1.5) X (2.0~4.0)微米，能運動，革蘭氏陽性，芽孢(1.0~1.2) X (1.5~2.0)微米，橢圓形，中生或次端生。菌落圓形或不規(guī)則形，奶油色，可光滑，可起皺褶。
[0017]菌株JSSW-JD-2F5的細胞形態(tài)和生理生化特征見表1:
【權(quán)利要求】
1.一種巨大芽孢桿菌，其分類命名為巨大芽孢桿菌QBacillus megaterium)JSSff-JD-2F5,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.8045。
2.權(quán)利要求1所述巨大芽孢桿菌JSSW-JD-2F5固體發(fā)酵菌劑的制備方法，其特征在于步驟為: (1)菌種活化:出發(fā)菌株為巨大芽孢桿菌JSSW-JD-2F5，無菌開啟菌株JSSW-JD-2F5的凍干保藏菌種，劃線接種于LB瓊脂試管斜面，28~37°C培養(yǎng)36~48h，然后劃線轉(zhuǎn)接于LB瓊脂茄子瓶斜面，28~37°C培養(yǎng)36~48h ;鏡檢，當90%以上菌體形成芽孢時，即為成熟； (2)種子菌懸液的制備:將成熟的種子用無菌水從斜面上刮洗下來，放入內(nèi)裝無菌玻璃珠的滅菌三角瓶，振蕩分散菌泥，制成均勻的菌懸液，備用； (3)固體發(fā)酵培養(yǎng): 固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成:按質(zhì)量百分比計，食用菌菌糠5.0%~10.0%，麩皮15.0%~30.0%，豆柏1.0%~4.0%, CaO 0.05%~1.0%,自來水調(diào)節(jié)補足至100% ； 將固體發(fā)酵培養(yǎng)基以發(fā)酵瓶容積計w/v 10%~20%的裝量裝入發(fā)酵瓶中，并用八層紗布封口，121°C滅菌30min ;將步驟(2)制備的菌懸液在80°C水浴中加熱10 min,以固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量計v/w 1.0%~10.0%的接種量接入發(fā)酵瓶內(nèi)滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵瓶置于恒溫培養(yǎng)箱，28~37°C培養(yǎng)，每隔12h拍打發(fā)酵瓶壁，使瓶中物料疏散、混勻，發(fā)酵培養(yǎng)36~48h，取樣鏡檢，當90%以上菌體形成芽孢時，即發(fā)酵結(jié)束； (4)巨大芽孢桿菌固體發(fā)酵菌劑的制備:將步驟(3)所得含巨大芽孢桿菌活菌的發(fā)酵產(chǎn)物在40~50°C下烘干，粉碎機粉碎，過40目篩，即制得巨大芽孢桿菌固體發(fā)酵菌劑成品，以系列稀釋法進行平板計數(shù)，芽孢濃度不低于1.0 X 101(lCFU/g。
3.用權(quán)利要求2所述方法制備的巨大芽孢桿菌固體發(fā)酵菌劑的應用，其特征在于用作畜禽漁業(yè)養(yǎng)殖飼料的添加劑，將巨大芽孢桿菌固體發(fā)酵菌劑按質(zhì)量百分比0.01%~0.05%的比例添加入飼料中。
【文檔編號】A23K1/18GK103468613SQ201310413693
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】孫梅, 匡群, 陳秋紅, 夏飛, 高亮, 施大林, 張憲中, 何義進, 陳林, 劉俊美 申請人:江蘇省蘇微微生物研究有限公司, 無錫市祖代雞場有限公司, 無錫市水產(chǎn)畜牧技術(shù)推廣總站