鐵線蓮奶油的組織培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種鐵線蓮栽培品種“奶油”的組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：1）外植體消毒處理；2）芽誘導(dǎo)和芽增殖，包括①誘導(dǎo)培養(yǎng)；②不定芽增殖培養(yǎng)；③壯苗培養(yǎng)；④生根培養(yǎng)；⑤煉苗和移栽。本發(fā)明的有益效果：應(yīng)用組織培養(yǎng)方法，能較好地保持母本的觀賞價(jià)值，有效地提高鐵線蓮“奶油”的繁殖系數(shù)；與扦插繁殖相比，生長(zhǎng)周期大幅縮短，組織培養(yǎng)法的繁殖系數(shù)為扦插繁殖的50~60倍；快速繁殖、品種優(yōu)質(zhì)、產(chǎn)量可觀和便于實(shí)地推廣。
【專利說明】鐵線蓮奶油的組織培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種鐵線蓮“奶油”(英文商品名為:Clematis ‘GuernseyCream’ )的組織培養(yǎng)方法，屬于植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵線蓮屬(Clematis L.)隸屬于毛茛科(Ranunculaceae)毛茛亞科(Subfam.Ranunculoideae)銀蓮花族(Trib.Anemoneae)鐵線蓮亞族(Subtrib.Clematidinae),常為多年生木質(zhì)藤本。世界約有355種，我國(guó)有147種，其中93種為我國(guó)特有種，特有率為63.3%。
[0003]其萼片花瓣?duì)?，色彩豐富，形態(tài)多變，莖蔓生，利用葉柄攀援，生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng)，園藝用途廣泛，觀賞價(jià)值高，在垂直綠化中具有重要地位，享有“攀援植物皇后”之美稱。在日本和西方園林中，鐵線蓮已占有十分重要的地位，大部分植物園、公園和家庭花園都能見到它們絢麗多彩的身影。此外，該屬植物中的許多種如女萎{Clematis)、威靈仙(Cchinensis)等作為藥用植物使用已久。
[0004]其種子較難發(fā)芽，多用扦插繁殖。采取組織培養(yǎng)法進(jìn)行鐵線蓮“奶油”(英文商品名為:Clematis ‘Guernsey Cream’)的快速繁殖,建立叢生芽生根的無(wú)性繁殖體系，有利于增大繁殖系數(shù)，對(duì)于鐵線蓮“奶油”走向園藝應(yīng)用具有較強(qiáng)的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。·
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提出的是一種鐵線蓮“奶油”的組織培養(yǎng)方法，其目的是克服鐵線蓮“奶油”現(xiàn)有繁殖技術(shù)存在的缺陷，提高其繁殖系數(shù)以適應(yīng)其引種推廣及園林應(yīng)用的需求。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)解決方案:一種鐵線蓮栽培品種Clematis ‘Proteus’的組織培養(yǎng)方法，其特征是包括如下步驟:
1)外植體消毒處理；
2)芽誘導(dǎo)和芽增殖。
[0007]所述的步驟I)外植體消毒處理，具體包括:
取鐵線蓮“奶油”當(dāng)年生的幼嫩莖節(jié)和頂芽，依次用自來(lái)水沖洗I h，毛筆來(lái)回刷洗20次，于超凈工作臺(tái)上用質(zhì)量濃度為75%乙醇滅菌20 S，無(wú)菌水沖洗2次，之后用質(zhì)量濃度為
0.1%氯化汞滅菌7 min，立即用無(wú)菌水沖洗4次。用滅菌濾紙吸干外植體表面水分，切除葉柄和兩端受傷部位。實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的污染率分別為70%、64%，褐化率為25%、22%。
[0008]所述的步驟2)芽誘導(dǎo)和芽增殖，具體包括:
①誘導(dǎo)培養(yǎng)
將芽接種于已滅菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2 MS+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)NAA 0.5 mg/L+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)TDZ 1.0 mg/L+質(zhì)量濃度為3%的蔗糖2(T30 g/L +質(zhì)量濃度為0.7%的瓊脂7 g/L，pH值為5.8，培養(yǎng)4周。培養(yǎng)溫度25°C，光照16 h/d，照度2400 Ix ；
②不定芽增殖培養(yǎng)將誘導(dǎo)的叢生芽分成單芽，繼而將單芽接入1/2 MS+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-BA 0.2 mg/L +生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)ΚΤ0.5 mg/L+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)NAA 0.05 mg/L+質(zhì)量濃度為3%的蔗糖2(T30 g/L+質(zhì)量濃度為0.7%的瓊脂7 g/L的培養(yǎng)基，pH值為5.8，培養(yǎng)4周。溫度、光照條件同①叢生芽誘導(dǎo)；
③壯苗培養(yǎng)
將增殖培養(yǎng)基中葉色濃綠、長(zhǎng)度為廣2 cm的不定芽逐個(gè)切下，接入MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)4星期，光照條件同①叢生芽誘導(dǎo)；
④生根培養(yǎng)
將壯苗培養(yǎng)后長(zhǎng)勢(shì)旺盛的芽接入生根培養(yǎng)基1/2 MS+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)IBA 0.5 mg/L中，培養(yǎng)40天。溫度、光照條件同①叢生芽誘導(dǎo)；
⑤煉苗和移栽
將生根的鐵線蓮“奶油”植株的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，溫室下煉苗6 d后，取出試管苗，洗凈，移栽到準(zhǔn)備好的珍珠巖:蛭石:泥炭(1:1:1)的營(yíng)養(yǎng)缽中，保持濕度85%-95%，溫度、光照條件同(2)叢生芽誘導(dǎo)，成活率達(dá)95%。
[0009]本發(fā)明的有益效果:應(yīng)用組織培養(yǎng)方法，能較好地保持母本的觀賞價(jià)值，有效地提高鐵線蓮“奶油”的繁殖系數(shù)。與扦插繁殖相比，生長(zhǎng)周期大幅縮短，組織培養(yǎng)法的繁殖系數(shù)為扦插繁殖的50-60倍?？焖俜敝?、品種優(yōu)質(zhì)、產(chǎn)量可觀和便于實(shí)地推廣。
【具體實(shí)施方式】實(shí)施例
[0010]一種鐵線蓮栽培品種‘Proteus’的組織培養(yǎng)方法,其培養(yǎng)步驟如下: 步驟一、外植體消毒處理
選取當(dāng)年生幼嫩莖節(jié)和頂芽，依次進(jìn)行沖洗1.5 h，于超凈工作臺(tái)上用75%乙醇滅菌20 s,用無(wú)菌水沖洗2次,之后用0.1%升萊滅菌7 min,立即用無(wú)菌水沖洗3_4次。
[0011]步驟二、芽誘導(dǎo)和芽增殖 ①誘導(dǎo)培養(yǎng)
沖洗后將外植體置于培養(yǎng)皿中，用剪刀、鑷子切除葉柄、兩端受傷部位后，將芽接種于已滅菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+TDZ 1.0 mg/L上5周，質(zhì)量濃度為3%的蔗糖2(T30 g/L,質(zhì)量濃度為0.7%的瓊脂7 g/L, pH 5.7，培養(yǎng)溫度25°C ;光照條件:光照/黑暗，其中光照16 h/d，光照度為2400 Ix0
[0012]②不定芽增殖培養(yǎng)
將誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出的叢生芽分成單芽，接入1/2 MS+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-BA 0.2 mg/L+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)KT 0.5 mg/L+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)NAA 0.05 mg/L增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周光照條件同①誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0013]③壯苗培養(yǎng)
將增殖培養(yǎng)基中葉色濃綠、長(zhǎng)度為2 cm左右的不定芽逐個(gè)切下，接入MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天，光照條件同①誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0014]④生根培養(yǎng)將壯苗培養(yǎng)后長(zhǎng)勢(shì)旺盛的芽切去莖基部褐色物質(zhì)后接入生根培養(yǎng)基1/2 MS+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)IBA 0.5 mg/L,培養(yǎng)6周后生根,光照條件同①誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0015]⑤煉苗和移栽
將生根植株的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，室溫下煉苗6 d后，取出試管苗，洗凈，移栽到準(zhǔn)備好的珍珠巖、蛭石、泥炭，其重量比為珍珠巖:蛭石:泥炭=1:1:1苗床上，保持溫度20-251:，濕度85%-95%，適當(dāng)遮蔭，成活率達(dá)90%。
[0016]所述的MS基本培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成分所組成。
[0017]所述的大量元素為:硝酸鉀KNO3,1900 mg.Λ硝酸銨NH4NO3,1650 mg1,磷酸二氫鉀 KH2PO4,170 mg.1，硫酸鎂 MgSO4.7 H2O, 370 mg.1，氯化鈣 CaCl2.4 H20,440mg.L 1 ο
[0018]所述的微量元素為:碘化鉀KI, 0.83 mg.L-1,硼酸H3BO3 , 6.2 mg七1,或硫酸猛MnS04.4 H2O, 22.3 mg.1 或硫酸鋅 ZnSO4.7 H20,8.6 mg.1 或鑰酸鈉 Na2MoO4.2 H2O,
0.25 mg.L' 硫酸銅 CuSO4.5 H2O, 0.025 mg.L' 氯化鈷 CoCl2.6 H2O, 0.025 mg.L'
[0019]所述的鐵鹽為:乙二胺二乙酸二鈉Na2.EDTA，37.3 mg.L—1，硫酸亞鐵FeSO4.7H2O, 27.8 mg.L 1O
[0020]所述的有機(jī)成分為:肌醇C6H12O6.2H20,100 mg.L-1，甘氨酸 NH2CH2COOH, 2mg.L—1，鹽酸硫胺素 C12H17C1qS.2Η(:1，0.1 mg.L—1，鹽酸吡哆醇 C8H11O3N.HCl ,0.5 mg.L—1，煙酸 NC5H4COOH, 0.5 mg.L'
[0021]所述的1/2 MS基本培養(yǎng)基的成分為:大量元素是MS的一半，其余成分微量元素、鐵鹽，有機(jī)成分與MS的有機(jī)成分相同。
[0022]所述的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-BA為6-芐基腺嘌呤；NAA為萘乙酸；KT為激動(dòng)素；ΙΒΑ為吲哚丁酸，TDZ為噻二唑苯基脲。
【權(quán)利要求】
1.一種鐵線蓮栽培品種Clematis‘Proteus’的組織培養(yǎng)方法,其特征是包括如下步驟: 1)外植體消毒處理； 2)芽誘導(dǎo)和芽增殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鐵線蓮栽培品種Clematis‘Proteus’的組織培養(yǎng)方法，其特征是所述的步驟1)外植體消毒處理，具體包括: 取鐵線蓮“奶油”當(dāng)年生的幼嫩莖節(jié)和頂芽，依次用自來(lái)水沖洗1 h，毛筆來(lái)回刷洗20次，于超凈工作臺(tái)上用質(zhì)量濃度為75%乙醇滅菌20s，無(wú)菌水沖洗2次，之后用質(zhì)量濃度為0.1%氯化汞滅菌7 min，立即用無(wú)菌水沖洗4次；用滅菌濾紙吸干外植體表面水分，切除葉柄和兩端受傷部位；實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的污染率分別為70%、64%，褐化率為25%、22%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鐵線蓮栽培品種Clematis‘Proteus’的組織培養(yǎng)方法，其特征是所述的步驟2)芽誘導(dǎo)和芽增殖，具體包括: ①誘導(dǎo)培養(yǎng) 將芽接種于已滅菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2 MS+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)NAA 0.5 mg/L+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)TDZ 1.0 mg/L+質(zhì)量濃度為3%的蔗糖20-30 g/L +質(zhì)量濃度為0.7%的瓊脂7 g/L，pH值為5.8，培養(yǎng)4周；培養(yǎng)溫度25°C，光照16 h/d，照度2400 1x ； ②不定芽增殖培養(yǎng) 將誘導(dǎo)的叢生芽分成單芽，繼而將單芽接入1/2 MS+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-BA 0.2 mg/L +生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)KT0.5 mg/L+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)NAA 0.05 mg/L+質(zhì)量濃度為3%的蔗糖20-30 g/L+質(zhì)量濃度為0.7%的瓊脂7 g/L的培養(yǎng)基，pH值為5.8，培養(yǎng)4周；溫度、光照條件同①叢生芽誘導(dǎo)； ③壯苗培養(yǎng) 將增殖培養(yǎng)基中葉色濃綠、長(zhǎng)度為1-2 cm的不定芽逐個(gè)切下，接入MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)4星期，光照條件同①叢生芽誘導(dǎo)； ④生根培養(yǎng) 將壯苗培養(yǎng)后長(zhǎng)勢(shì)旺盛的芽接入生根培養(yǎng)基1/2 MS+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)IBA 0.5 mg/L中，培養(yǎng)40天；溫度、光照條件同①叢生芽誘導(dǎo)； ⑤煉苗和移栽 將生根的鐵線蓮“Clematis ‘Proteus’ ”植株的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，溫室下煉苗6 d后，取出試管苗，洗凈，移栽到準(zhǔn)備好的珍珠巖:蛭石:泥炭(1:1:1)的營(yíng)養(yǎng)缽中，保持濕度85%-95%，溫度、光照條件同(2)叢生芽誘導(dǎo)，成活率達(dá)95%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種鐵線蓮栽培品種Clematis‘Proteus’的組織培養(yǎng)方法，其特征是所述的MS基本培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成分所組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種鐵線蓮栽培品種Clematis‘Betty Risdon’的組織培養(yǎng)方法，其特征是所述的大量元素為:硝酸鉀KNO3,1900 mg·L-1,硝酸銨NH4NO3,1650 mg·L-1,磷酸二氫鉀 KH2PO4·170 mg·L—1，硫酸鎂 MgSO4·7 H2O, 370 mg·L-1 氯化鈣 CaCl2·4 H2O,440mg·L-1 ； 所述的微量元素為:碘化鉀KI，0.83 mg·L-1,硼酸H3BO3，6.2 mg·L—1，或硫酸錳MnS04·4 H2O, 22.3 mg·L-1 或硫酸鋅 ZnSO4·7 H20,8.6 mg·L-1 或鑰酸鈉 Na2MoO4·2 H2O,.0.25 mg.L' 硫酸銅 CuSO4.5 H20,0.025 mg.L' 氯化鈷 CoCl2.6 H20,0.025 mg.L-1 ； 所述的鐵鹽為:乙二胺二乙酸二鈉Na2.EDTA, 37.3 mg.L—1，硫酸亞鐵FeSO4.7 H2O,27.8 mg.L 1 ; 所述的有機(jī)成分為:肌醇 C6H12O6.2H20,100 mg.L-1，甘氨酸 NH2CH2COOH, 2 mg.L-1，鹽酸硫胺素 C12H17C10S.2HC1，0.1 mg.L-1，鹽酸吡哆醇 C8H11O3N.HCl，0.5 mg.L-1，煙酸NC5H4COOH, 0.5 mg.L'
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種鐵線蓮栽培品種‘Proteus’的組織培養(yǎng)方法，其特征是所述的1/2 MS基本培養(yǎng)基的成分為:大量元素是MS的一半，其余成分微量元素、鐵鹽，有機(jī)成分與MS的有機(jī)成分相同。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種鐵線蓮栽培品種‘Proteus’的組織培養(yǎng)方法，其特征是所述的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-BA為6-芐基腺嘌呤；NAA為萘乙酸；KT為激動(dòng)素；ΙΒΑ為吲哚丁酸，TDZ為噻二唑苯基脲。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103430854SQ201310428128
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】方炎明, 程瑩, 劉暢, 王磊 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)