鐵線蓮貝蒂·里斯登的組織培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種鐵線蓮栽培品種“貝蒂·里斯登”的組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：1）外植體消毒處理；外植體消毒處理，2）芽誘導(dǎo)和芽增殖，具體包括：①誘導(dǎo)培養(yǎng)，②不定芽增殖培養(yǎng)，③壯苗培養(yǎng)，④生根培養(yǎng)，⑤煉苗和移栽。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：應(yīng)用組織培養(yǎng)方法，能較好地保持母本的觀賞價值，有效地提高“貝蒂·里斯登”鐵線蓮的繁殖系數(shù)；與扦插繁殖相比，生長周期大幅縮短，組織培養(yǎng)法的繁殖系數(shù)為扦插繁殖的50~60倍；品種優(yōu)質(zhì)、產(chǎn)量可觀和便于實地推廣。
【專利說明】鐵線蓮貝蒂.里斯登的組織培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種鐵線蓮“貝蒂.里斯登”的組織培養(yǎng)方法(一種鐵線蓮栽培品蝸Clermtis ‘Betty Risdon’的組織培養(yǎng)方法),屬于植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵線蓮屬(Clematis L.)隸屬于毛茛科(Ranunculaceae)毛茛亞科(Subfam.Ranunculoideae)銀蓮花族(Trib.Anemoneae)鐵線蓮亞族(Subtrib.Clematidinae),常為多年生木質(zhì)藤本。世界約有355種，我國有147種，其中93種為我國特有種，特有率為63.3%。
[0003]其萼片花瓣狀，色彩豐富，形態(tài)多變，莖蔓生，利用葉柄攀援，生長適應(yīng)性強(qiáng)，園藝用途廣泛，觀賞價值高，在垂直綠化中具有重要地位，享有“攀援植物皇后”之美稱。在日本和西方園林中，鐵線蓮已占有十分重要的地位，大部分植物園、公園和家庭花園都能見到它們絢麗多彩的身影。此外，該屬植物中的許多種如女萎{Clematis、威靈仙(Cchinensis)等作為藥用植物使用已久。
[0004]其種子較難發(fā)芽，多用扦插繁殖。采取組織培養(yǎng)法進(jìn)行鐵線蓮“貝蒂.里斯登”(英文商品名為:Clematis ‘Betty Risdon’)的快速繁殖,建立叢生芽生根的無性繁殖體系，有利于增大繁殖系數(shù)，對于鐵線蓮“貝蒂.里斯登”走向園藝應(yīng)用具有較強(qiáng)的生產(chǎn)應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提出的是一種 鐵線蓮栽培品種‘Betty Risdon’的組織培養(yǎng)方法，其目的是針對鐵線蓮“貝蒂.里斯登”現(xiàn)有繁殖技術(shù)較為陳舊的問題，提高其繁殖系數(shù)以適應(yīng)其引種推廣及園林應(yīng)用的需求。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)解決方案:一種鐵線蓮栽培品種CVeffiaii1S ‘Betty Risdon’的組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
1)外植體消毒處理；
2)芽誘導(dǎo)和芽增殖。
[0007]所述的步驟I)外植體消毒處理，具體包括:
取鐵線蓮“貝蒂.里斯登”當(dāng)年生的幼嫩莖節(jié)和頂芽，依次進(jìn)行自來水沖洗lh，毛筆來回刷洗20次，于超凈工作臺上用質(zhì)量濃度75%乙醇滅菌20 S，無菌水沖洗2次，之后用質(zhì)量濃度0.1%氯化萊滅菌7 min,立即用無菌水沖洗4次；用滅菌濾紙吸干外植體表面水分,切除葉柄和兩端受傷部位，實驗統(tǒng)計的污染率分別為62%、49%，褐化率為24%、31% ；
所述的步驟2)芽誘導(dǎo)和芽增殖，具體包括:
①誘導(dǎo)培養(yǎng)，
沖洗后將外植體置于培養(yǎng)皿中，用剪刀、鑷子切除葉柄、兩端受傷部位后，將芽接種于已滅菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+TDZ 1.0 mg/L上5周，質(zhì)量濃度為3 %的蔗糖2(T30 g/L，質(zhì)量濃度為0.7 %的瓊脂7 g/L, pH 5.7，培養(yǎng)溫度25°C ;光照條件:光照/黑暗，其中光照16 h/d，光照度為2400 Ix ；
②不定芽增殖培養(yǎng)，
將誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出的叢生芽分成單芽，接入1/2 MS+生長調(diào)節(jié)物質(zhì)6-BA 0.2 mg/L+生長調(diào)節(jié)物質(zhì)KT 0.5 mg/L+生長調(diào)節(jié)物質(zhì)NAA 0.05 mg/L增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周，光照條件同①誘導(dǎo)培養(yǎng)；
③壯苗培養(yǎng)，
將增殖培養(yǎng)基中葉色濃綠、長度為2 cm左右的不定芽逐個切下，接入MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天，光照條件同①誘導(dǎo)培養(yǎng)；
④生根培養(yǎng)
將壯苗培養(yǎng)后長勢旺盛的芽切去莖基部褐色物質(zhì)后接入生根培養(yǎng)基1/2 MS+生長調(diào)節(jié)物質(zhì)IBA 0.3 mg/L，培養(yǎng)6周后生根，光照條件同①誘導(dǎo)培養(yǎng)；
⑤煉苗和移栽，
將生根植株的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，室溫下煉苗6d后，取出試管苗，洗凈，移栽到由珍珠巖、蛭石、泥炭組成的苗床上，所述的珍珠巖、蛭石、泥炭的重量比為1:1:1，保持溫度20^250C，濕度85%~95%，適當(dāng)遮蔭，成活率達(dá)90%。
[0008]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):應(yīng)用組織培養(yǎng)方法，能較好地保持母本的觀賞價值，有效地提高鐵線蓮“貝蒂.里斯登”的繁殖系數(shù)。與扦插繁殖相比，生長周期大幅縮短，組織培養(yǎng)法的繁殖系數(shù)為扦插繁殖的50-60倍 。品種優(yōu)質(zhì)、產(chǎn)量可觀和便于實地推廣。
【具體實施方式】實施例
[0009]鐵線蓮“貝蒂.里斯登”組織培養(yǎng)方法，其培養(yǎng)步驟如下:
步驟I)外植體消毒處理
選取當(dāng)年生幼嫩莖節(jié)和頂芽，依次沖洗1.5 h，于超凈工作臺上用質(zhì)量濃度為75%乙醇滅菌20 S，用無菌水沖洗2次，之后用0.1%升汞滅菌7 min,立即用無菌水沖洗3_4次。
[0010]步驟2)芽誘導(dǎo)和芽增殖 ①誘導(dǎo)培養(yǎng)
沖洗后將外植體置于培養(yǎng)皿中，用剪刀、鑷子切除葉柄、兩端受傷部位后，將芽接種于已滅菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+TDZ 1.0 mg/L上5周，質(zhì)量濃度為3 %的蔗糖2(T30 g/L,質(zhì)量濃度為0.7 %的瓊脂7g/L，pH 5.7，培養(yǎng)溫度25°C ;光照條件:光照/黑暗，其中光照16 h/d，光照度為24001x。
[0011]②不定芽增殖培養(yǎng)
將誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出的叢生芽分成單芽，接入1/2 MS+生長調(diào)節(jié)物質(zhì)6-BA 0.2 mg/L+生長調(diào)節(jié)物質(zhì)KT 0.5mg/L+生長調(diào)節(jié)物質(zhì)NAA 0.05mg/L增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周光照條件同①誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0012]③壯苗培養(yǎng)
將增殖培養(yǎng)基中葉色濃綠、長度為2 cm左右的不定芽逐個切下，接入MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天，光照條件同①誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0013]④生根培養(yǎng)
將壯苗培養(yǎng)后長勢旺盛的芽切去莖基部褐色物質(zhì)后接入生根培養(yǎng)基1/2 MS+生長調(diào)節(jié)物質(zhì)IBA 0.3mg/L,培養(yǎng)6周后生根,光照條件同①誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0014]⑤煉苗和移栽
將生根植株的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，室溫下煉苗6 d后，取出試管苗，洗凈，移栽到準(zhǔn)備好的珍珠巖、蛭石、泥炭珍間的重量比1:1:1苗床上，保持溫度2(T25°C，濕度85%~95%，適當(dāng)遮蔭，成活率達(dá)90%。
[0015]所述的MS基本培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成分所組成。
[0016]所述的大量元素為:硝酸鉀KNO3,1900 mg.?Λ硝酸銨NH4NO3,1650 mg-1,磷酸二氫鉀 KH2PO4,170 mg.1，硫酸鎂 MgSO4.7 H2O, 370 mg.1，氯化鈣 CaCl2.4 H20,440mg.L 1 ο
[0017]所述的微量元素為:碘化鉀KI, 0.83 mg.L-1,硼酸H3BO3 , 6.2 mg.!/1,或硫酸猛MnS04.4 H2O, 22.3 mg.1 或硫酸鋅 ZnSO4.7 H20,8.6 mg.1 或鑰酸鈉 Na2MoO4.2 H2O,
0.25 mg.L' 硫酸銅 CuSO4.5 H2O, 0.025 mg.L' 氯化鈷 CoCl2.6 H2O, 0.025 mg.L'
[0018]所述的鐵鹽為:乙二胺二乙酸二鈉Na2.EDTA，37.3 mg.L—1，硫酸亞鐵FeSO4.7H2O, 27.8 mg.L 1O
[0019]所述的有機(jī)成分為:肌醇C6H12O6.2H20,100 mg.L-1，甘氨酸 NH2CH2COOH, 2mg.L—1，鹽酸硫胺素 C12H17C1qS.2Η(:1，0.1 mg.L—1，鹽酸吡哆醇 C8H11O3N.HCl ,0.5 mg.L—1，煙酸 NC5H4COOH, 0.5 mg.L'
[0020]所述的1/2 MS基本培養(yǎng)基的成分為:大量元素是MS的一半，其余成分微量元素、鐵鹽，有機(jī)成分與MS的有機(jī)成分相同。
[0021]所述的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)NAA為萘乙酸，6-BA為6_芐基腺嘌呤，TDZ為噻二唑苯基脲，KT為激動素，IBA為吲哚-3- 丁酸。
【權(quán)利要求】
1.一種鐵線蓮栽培品種‘Betty Risdon’的組織培養(yǎng)方法,其特征是包括如下步驟:. 1)外植體消毒處理； .2)芽誘導(dǎo)和芽增殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鐵線蓮栽培品種‘BettyRisdon’的組織培養(yǎng)方法，其特征是所述的步驟I)外植體消毒處理，具體包括: 取鐵線蓮“貝蒂.里斯登”當(dāng)年生的幼嫩莖節(jié)和頂芽，依次進(jìn)行自來水沖洗lh，毛筆來回刷洗20次，于超凈工作臺上用質(zhì)量濃度75%乙醇滅菌20 S，無菌水沖洗2次，之后用質(zhì)量濃度0.1%氯化萊滅菌7 min,立即用無菌水沖洗4次；用滅菌濾紙吸干外植體表面水分,切除葉柄和兩端受傷部位，實驗統(tǒng)計的污染率分別為62%、49%，褐化率為24%、31%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鐵線蓮栽培品種‘BettyRisdon’的組織培養(yǎng)方法，其特征是所述的步驟2)芽誘導(dǎo)和芽增殖，具體包括: ①誘導(dǎo)培養(yǎng)， 沖洗后將外植體置于培養(yǎng)皿中，用剪刀、鑷子切除葉柄、兩端受傷部位后，將芽接種于已滅菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+TDZ 1.0 mg/L上5周，質(zhì)量濃度為3 %的蔗糖2(T30 g/L， 質(zhì)量濃度為0. 7 %的瓊脂7 g/L, pH 5.7，培養(yǎng)溫度25°C ;光照條件:光照/黑暗，其中光照16 h/d，光照度為2400 Ix ； ②不定芽增殖培養(yǎng)， 將誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出的叢生芽分成單芽，接入1/2 MS+生長調(diào)節(jié)物質(zhì)6-BA 0.2 mg/L+生長調(diào)節(jié)物質(zhì)KT 0.5 mg/L+生長調(diào)節(jié)物質(zhì)NAA 0.05 mg/L增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周，光照條件同①誘導(dǎo)培養(yǎng)； ③壯苗培養(yǎng)， 將增殖培養(yǎng)基中葉色濃綠、長度為2 cm左右的不定芽逐個切下，接入MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天，光照條件同①誘導(dǎo)培養(yǎng)； ④生根培養(yǎng) 將壯苗培養(yǎng)后長勢旺盛的芽切去莖基部褐色物質(zhì)后接入生根培養(yǎng)基1/2 MS+生長調(diào)節(jié)物質(zhì)IBA 0.3 mg/L，培養(yǎng)6周后生根，光照條件同①誘導(dǎo)培養(yǎng)； ⑤煉苗和移栽， 將生根植株的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，室溫下煉苗6d后，取出試管苗，洗凈，移栽到由珍珠巖、蛭石、泥炭組成的苗床上，所述的珍珠巖、蛭石和泥炭間的重量比為1:1:1，保持溫度20^250C，濕度85%~95%，適當(dāng)遮蔭，成活率達(dá)90%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種鐵線蓮栽培品種Clematis‘Betty Risdon’的組織培養(yǎng)方法，其特征是所述的MS基本培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成分所組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所 述的一種鐵線蓮栽培品種Clematis‘Betty Risdon’的組織培養(yǎng)方法，其特征是所述的大量元素為:硝酸鉀KNO3,1900 mg - 1,硝酸銨NH4NO3,1650 mg - 1,磷酸二氫鉀 KH2PO4,170 mg.L—1，硫酸鎂 MgSO4.7 H2O, 370 mg.L' 氯化鈣 CaCl2.4 H2O,440 mg.I71 ； 所述的微量元素為:碘化鉀KI，0.83 mg. 1,硼酸H3BO3，6.2 mg.L—1，或硫酸錳MnS04.4 H2O, 22.3 mg. 1 或硫酸鋅 ZnSO4.7 H20,8.6 mg. 1 或鑰酸鈉 Na2MoO4.2 H2O,.0.25 mg.L' 硫酸銅 CuSO4.5 H2O, 0.025 mg.L' 氯化鈷 CoCl2.6 H2O, 0.025 mg.L-1 ； 所述的鐵鹽為:乙二胺二乙酸二鈉Na2.EDTA, 37.3 mg.L—1，硫酸亞鐵FeSO4.7 H2O,.27.8 mg.L 1 ; 所述的有機(jī)成分為:肌醇 C6H12O6.2H20,100 mg.L-1，甘氨酸 NH2CH2COOH, 2 mg.L-1，鹽酸硫胺素 C12H17C10S.2HC1，0.1 mg.L-1，鹽酸吡哆醇 C8H11O3N.HCl ,0.5 mg.L-1，煙酸NC5H4COOH, 0.5 mg.L'
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鐵線蓮栽培品種“貝蒂.里斯登”的組織培養(yǎng)方法，其特征是所述的1/2 MS基本培養(yǎng)基的成分為:大量元素是MS的一半，其余成分微量元素、鐵鹽，有機(jī)成分與MS的有機(jī)成分相同。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的鐵線蓮栽培品種“貝蒂.里斯登”的組織培養(yǎng)方法，其特征是所述的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)NAA為萘乙酸，6-BA為6-芐基腺嘌呤，TDZ為噻二唑苯基脲，KT為激動素，IBA為吲哚-3-丁酸。
【文檔編號】A01H4/00GK103461131SQ201310428130
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】方炎明, 程瑩, 嚴(yán)靖, 王磊 申請人:南京林業(yè)大學(xué)