一種創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法，該方法包括以下步驟：以春油菜區(qū)白菜型油菜主栽品種“浩油11號”為母本，以抗跳甲芥菜型油菜品種“嚴小村芥菜”為父本，進行白菜型油菜ArAr×芥菜型油菜AjAjBB的種間雜交；通過幼胚拯救，獲得F1，即ArArAjB；選擇具有38條染色體同時花粉育性不少于50％的F1植株進行剝蕾自交，獲得F2，即AjAr；通過細胞學觀察選擇染色體數(shù)目為20的單株再進行跳甲抗性鑒定，獲得抗跳甲白菜型油菜資源。本發(fā)明創(chuàng)建的雜種F1花粉育性達到50％以上，可自交結(jié)實，保證芥菜型油菜遺傳成分向后代滲入；縮短資源創(chuàng)新年限，加快育種進程；把抗跳甲相關(guān)基因?qū)氚撞诵陀筒?，?chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源，具有重要的市場應用價值。
【專利說明】一種創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)作物遺傳成分導入領(lǐng)域，尤其涉及一種創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]白菜型油菜為油菜三大類型之一，學名Brassia rapa。包括原產(chǎn)中國的蕓薹和油白菜。中國又稱小白菜、矮油菜、甜油菜等。染色體組為ΑΑ，η = 10。
[0003]芥菜型油菜，學名Brassica juncea俗稱油辣菜，籽粒細小，多為金黃色或暗紅色，含油量高，芥菜型油菜具有耐瘠性強等特點，其基因組組成為ΑΑΒΒ，η = 36。
[0004]跳甲，俗稱“土崩子” “土跳搔”，以危害十字花科蔬菜幼苗為主，亦危害茄果類、瓜類、豆類蔬菜，春季發(fā)生嚴重。
[0005]芥菜型油菜和白菜型油菜屬于蕓薹屬兩個不同的栽培種，其中芥菜型油菜為異源四倍體，基因組為Af ΒΒ，白菜型油菜為二倍體，基因組為兩個栽培種的A染色體屬于同源染色體，但是在長期的進化過程中產(chǎn)生了較大的遺傳差異。青藏高原是芥菜型油菜的起源中心之一，境內(nèi)分布著非常豐富的芥菜型油菜種質(zhì)資源，其中一些資源具有早熟、抗旱、黃籽、大粒、抗蟲等特性，比如爐霍小油菜具有早熟性，牛尾梢具有抗旱性，嚴小村芥菜具有抗跳甲特性。目前一些高海拔、高緯度的春油菜區(qū)生產(chǎn)上種植的還是上世紀八十年代培育的白菜型油菜常規(guī)品種，如門源小油菜、浩油11號、青油241等少數(shù)幾個品種。
[0006]白菜型油菜的抗逆性、產(chǎn)量和品種更新速度遠遠落后于甘藍型油菜，這一情況嚴重阻礙了白菜型油菜產(chǎn)區(qū)的農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增收。
[0007]造成這一問題的其中一個原因是長期種植少數(shù)幾個白菜型油菜品種導致專一性病蟲害發(fā)生逐年嚴重，例如跳甲是春油菜區(qū)油菜苗期主要害蟲之一，而現(xiàn)有白菜型油菜品種普遍不抗跳甲，這也是導致其減產(chǎn)的主要原因。
[0008]傳統(tǒng)的通過芥白種間雜交創(chuàng)建白菜型油菜種質(zhì)資源的方式主要是以染色體數(shù)目多的芥菜型油菜(2η = 36)作母本，以染色體數(shù)目少的白菜型油菜(2η = 20)作父本進行種間雜交。以此方式獲得的雜種Fl基因組SAnAlrC,其表現(xiàn)為雄性高度不育，雌性部分可育，以自交的方式不能獲得種子，即使以白菜型油菜親本對Fl回交，僅能得到少量種子。回交后代往往育性差，穩(wěn)定慢，大約回交后再自交兩代才能獲得新型白菜型油菜，全過程至少需要四個年度才能夠達到改良目標，因此需要的育種周期較長。
[0009]黃條跳甲成蟲俗稱蹦蹦蟲、菜蚤、土跳蚤、地蹦子等， 幼蟲稱白蛆。在青海、新疆等干旱地區(qū)，危害最為嚴重，該跳甲對春油菜的幼苗造成危害，蟲害可導致減產(chǎn)10%~30%，是影響高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的一個關(guān)鍵因素。跳甲開始危害一般發(fā)生在4月下旬(溫度在15~200C )，此時油菜正處于幼苗期(子葉期到2片真葉之間)，跳甲可將子葉和生長點全部吃掉，常造成成片枯死，大面積缺苗，植株畸形、主莖缺失、導致大幅度減產(chǎn)甚至全田毀種。
[0010]研究表明，芥菜型油菜普遍有較強的抗跳甲特性，尤其“嚴小村”芥菜抗性最強，甘藍型油菜次之，白菜型抗性最差(余青蘭等，2012)。[0011]理論上，通過種間雜交創(chuàng)建白菜型油菜新資源的途徑主要包括細胞質(zhì)替換和核基因組的遺傳物質(zhì)滲入。芥白雜種后代的核基因組遺傳物質(zhì)滲入主要以A基因組轉(zhuǎn)移、A基因組內(nèi)同源重組和A基因組與B基因組間部分同源重組為媒介。
[0012]芥菜型油菜具有A基因組，和白菜型油菜雜交后代自交或與白菜型油菜連續(xù)回交的過程，A染色體在減數(shù)分裂終變期能夠始終處于二價體的配對狀態(tài)，而B染色體在后代的減數(shù)分裂中會逐漸被消除，這為通過芥白種間雜交創(chuàng)建新的白菜型油菜資源提供了可能性。
[0013]芥菜型油菜的V染色體和白菜型油菜Y染色體屬于同源染色體，經(jīng)異源多倍化后在漫長的進化過程中早已發(fā)生了大量的基因組改變，與現(xiàn)有白菜型油菜的Y染色體具有較大的遺傳差異，因此在芥白雜種及其后代的減數(shù)分裂中A基因組同源重組是促進遺傳物質(zhì)向白菜型油菜滲入的重要因素(Chen等，2007)。Choudhary等在芥菜型油菜和白菜型油菜雜種Fl (AAB)減數(shù)分裂中發(fā)現(xiàn)了由A、B染色體部分同源配對引起的終變期多價體和后期I的染色體橋。以上研究表明，A、B染色體之間具有一定的親緣關(guān)系，這為通過部分同源重組促進遺傳物質(zhì)向白菜型油菜滲入提供了可能。
[0014]以芥白種間雜交創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的研究至今尚未見報道。以向白菜型油菜轉(zhuǎn)移芥菜型油菜優(yōu)異基因為目的的芥白種間雜交目前能查到兩篇文獻，一篇是王丹等于2006年在中國農(nóng)學通報上發(fā)表的《芥菜型油菜與白菜種間雜種的獲得與鑒定》，另一篇是牛妍等于2013年在植物遺傳資源學報上發(fā)表的《芥菜型油菜和白菜型油菜種間雜種的遺傳分析》。
[0015]以上兩個研究技術(shù)方案的共同之處是全部以染色體數(shù)目多的芥菜型油菜為母本，以染色體數(shù)目較少的白菜型油菜或大白菜為父本進行有性種間雜交，通過子房培養(yǎng)或者收獲自然種子而成功獲得雜種Fl代，通過細胞學觀察Fl植株的染色體數(shù)目均為28條，F(xiàn)l植株均雄性不育。王丹等的研究內(nèi)容僅截止到創(chuàng)建出Fl植株，并對Fl植株進行了形態(tài)學、細胞學和花粉育性的分析，未見白菜型油菜資源創(chuàng)新方面的后續(xù)報道；牛妍等的研究僅限于對以芥菜型油菜為母本獲得的雜種F`UBC1F1和BC1F2群體的細胞遺傳學、自交親和性及花粉育性方面的分析，并沒有提及白菜型油菜資源創(chuàng)新結(jié)果。
[0016]歸納以上兩個研究，可以總結(jié)出芥白種間雜交現(xiàn)有技術(shù)方案如下:
[0017]1、以染色體數(shù)目多的芥菜型油菜為母本，以染色體數(shù)目少的白菜型油菜或白菜為父本，進行種間有性雜交；
[0018]2、通過自然收獲種子或者通過子房培養(yǎng)獲得雜種Fl植株；
[0019]3、通過細胞學檢測Fl植株的體細胞染色體數(shù)目為28條；
[0020]4、利用父本白菜型油菜對雄性不育的Fl植株回交獲得BClFl群體；
[0021]5, BClFl植株繼續(xù)自交獲得新型白菜型油菜資源。
[0022]現(xiàn)有技術(shù)方案雜種Fl雄性敗育，不能進行自交，需要用白菜型油菜親本進行回交，這個過程會導致芥菜型油菜遺傳成分向后代滲入的比例偏少；資源創(chuàng)新的時間長，至少第四年才能獲得大批新型白菜型油菜資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023]本發(fā)明實施例的目的在于提供一種創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法，旨在解決現(xiàn)有芥菜型油菜與白菜型油菜種間雜交Fl雄性敗育，不能進行自交，需要用白菜型油菜親本進行回交，導致芥菜型油菜遺傳成分向后代滲入的比例偏少；資源創(chuàng)新的時間長，至少四年才能獲得大批新型白菜型油菜資源的問題。
[0024]本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法，該創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法包括以下步驟:
[0025]步驟一、以春油菜區(qū)白菜型油菜主栽品種“浩油11號”為母本，以抗跳甲芥菜型油菜品種“嚴小村芥菜”為父本，進行白菜型油菜kH芥菜型油菜AfBB的種間雜交；
[0026]步驟二、通過幼胚拯救，獲得Fl，即AHjB ；
[0027]步驟三、選擇具有38條染色體同時花粉育性不少于50%的Fl植株進行剝蕾自交，獲得F2，即AjAr ；
[0028]步驟四、通過細胞學觀察選擇染色體數(shù)目為20的單株再進行跳甲抗性鑒定，獲得抗跳甲白菜型油菜資源。
[0029]進一步,步驟一種間雜交的具體操作方法如下:
[0030](4)在白菜型油菜盛花期，將一個白菜型油菜單株已經(jīng)開放的花朵全部摘除，用75%酒精擦拭花蕾殺滅沾染的花粉，將開花前1-2天的花蕾去掉雄蕊，再將小花蕾全部摘除；取嚴小村芥菜套袋內(nèi)新鮮花粉授予白菜型油菜子房柱頭上；
[0031](5)授粉25-30天之間，取回發(fā)育中的角果，將體視顯微鏡放于超凈工作臺中，在無菌條件下，撥開角果，在體式顯微鏡下剝出瀕臨凋亡的裸胚，放置于MS培養(yǎng)基中，待幼胚發(fā)育成苗后，再將其栽于MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA分化培養(yǎng)基中，快繁繼代，將快繁出的雜種苗放于 MS+0.25mg/L NAA培養(yǎng)基生根，生根后，將雜種苗栽于試驗田；
[0032](6)在雜種植株蕾苔期，取子房進行體細胞觀察，選擇染色體數(shù)目為38條的植株掛牌標記；在初花期，對具有38條染色體的植株進行花粉育性觀察。
[0033]進一步，初花期對植株進行花粉育性觀察時用于花粉粒染色的試劑為醋酸洋紅。
[0034]進一步，對可育Fl進行剝蕾自交的具體操作方法如下:
[0035]在開花前將花序套上硫酸紙袋，花開前剝出柱頭，將其自身的花粉授予柱頭上，然后再套上紙袋，10天后取下紙袋，將未授粉的花蕾去掉。
[0036]進一步，進行輔助自交授粉時可進行重復授粉。
[0037]本發(fā)明提供的創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法以種間雜交方式獲得的Fl為非預期雜種，即染色體數(shù)目并非雙親正常配子之和的28條(正常情況下，白菜型油菜配子具有10條染色體，芥菜型油菜配子具有18條染色體)，而是具有38條染色體。
[0038]導致這一結(jié)果的原因是，當以染色體數(shù)目較少的親本作母本時，正常配子形成的受精卵不能夠正常發(fā)育，在發(fā)育早期就會凋亡，而母本白菜型油菜會發(fā)生一定頻率的不減數(shù)分裂，形成具有20條染色體的雌配子，該類型雌配子染色體數(shù)目多于芥菜型油菜雄配子(具有18條染色體)，這樣的雌配子與來自芥菜型油菜的雄配子結(jié)合后形成的合子胚能夠正常發(fā)育25-30天左右，而此時通過幼胚拯救技術(shù)可以獲得具有38條染色體的雜種。
[0039]本發(fā)明以染色體數(shù)目少的白菜型油菜“浩油11號”(AU為母本，以現(xiàn)有抗跳甲芥菜型油菜資源“嚴小村芥菜”(A^V_BB)為父本，進行種間雜交，獲得的Fl代大部分植株具有38條染色體，其基因組為AlrA1^B,花粉粒育性達到50%左右，少部分植株具有28條染色體，其基因組為Alt,表現(xiàn)為完全敗育。通過細胞學和花粉育性觀察，選擇具有38條染色體的植株進行人工剝蕾自交，在下一代即有可能獲得基因組為AlrAn類型的植株。相比傳統(tǒng)的正交方法，大大縮短白菜型油菜種質(zhì)資源創(chuàng)新年限。
[0040]本發(fā)明提供的創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法創(chuàng)建的雜種Fl花粉育性達到50%以上，可以自交結(jié)實，不需再用白菜型油菜親本回交，從而保證芥菜型油菜遺傳成分更多的向后代滲入；本方法從進行芥白種間雜交第一年開始，第三年就會獲得大批新型白菜型油菜資源，縮短資源創(chuàng)新年限；以具有抗跳甲特性的芥菜型油菜為父本進行雜交，能夠把抗跳甲相關(guān)基因?qū)氚撞诵陀筒?，?chuàng)建一批抗跳甲白菜型油菜資源；此外，獲得的Fl具有可育性，可直接自交形成F2群體，一方面增加芥菜型油菜遺傳成分向后代滲入的可能性，另一方面縮短種質(zhì)資源創(chuàng)新年限，加快育種進程。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1是本發(fā)明實施例提供的創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法流程圖。
【具體實施方式】
[0042]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0043]圖1示出了本發(fā)明實施例提供的創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法流程圖。為了便于說明，僅僅示出了與本發(fā)明相關(guān)的部分。
[0044]下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應用原理作進一步描述。
[0045]以春油菜區(qū)白菜型油菜主栽品種“浩油11號”為母本，以抗跳甲芥菜型油菜品種“嚴小村芥菜”為父本，進行種間雜交。具體操作方法是，在白菜型油菜盛花期，將一個長勢健壯白菜型油菜單株已經(jīng)開放的 花朵全部摘除，用75%酒精擦拭花蕾殺滅沾染的花粉，將開花前1-2天的花蕾去掉雄蕊，再將小花蕾全部摘除。取嚴小村芥菜套袋內(nèi)新鮮花粉授予白菜型油菜子房柱頭上；
[0046]授粉25-30天之間，取回發(fā)育中的角果，將體視顯微鏡放于超凈工作臺中，在無菌條件下，撥開角果，在體式顯微鏡下剝出瀕臨凋亡的裸胚，放置于MS培養(yǎng)基中。待幼胚發(fā)育成苗后，再將其栽于MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/L NAA分化培養(yǎng)基中，快繁繼代，將快繁出的雜種苗放于MS+0.25mg/L NAA培養(yǎng)基生根。生根后，將雜種苗栽于試驗田；
[0047]在雜種植株蕾苔期，取幼嫩的子房進行體細胞觀察，選擇染色體數(shù)目為38條的植株掛牌標記；
[0048]在初花期，對具有38條染色體的植株進行花粉育性觀察，用于花粉粒染色的試劑為醋酸洋紅。
[0049]選擇具有38條染色體同時花粉育性超過50%的植株進行剝蕾自交，具體操作方法是，在開花前將花序套上硫酸紙袋，待花開一定數(shù)量后，將未開放的花蕾剝開，露出柱頭，將其自身的花粉授予柱頭上，然后再套上紙袋。10天后取下紙袋，將未授粉的花蕾去掉。(此步驟要給盡量多的花蕾授粉，以期獲得足夠多的自交種子)
[0050]在F2群體中篩選體細胞染色體數(shù)目為20的植株，同時對其抗跳甲性進行鑒定，獲得抗跳甲的新型白菜型油菜資源。[0051]本發(fā)明實施例提供的創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法以種間雜交方式獲得的Fl為非預期雜種，即染色體數(shù)目并非雙親正常配子之和的28條(正常情況下，白菜型油菜配子具有10條染色體，芥菜型油菜配子具有18條染色體)，而是具有38條染色體。
[0052]導致這一結(jié)果的原因是，當以染色體數(shù)目較少的親本作母本時，正常配子形成的受精卵不能夠正常發(fā)育，在發(fā)育早期就會凋亡，而母本白菜型油菜會發(fā)生一定頻率的不減數(shù)分裂，形成具有20條染色體的雌配子，該類型雌配子染色體數(shù)目多于芥菜型油菜雄配子(具有18條染色體)，這樣的雌配子與來自芥菜型油菜的雄配子結(jié)合后形成的合子胚能夠正常發(fā)育25-30天左右，而此時通過幼胚拯救技術(shù)可以獲得具有38條染色體的雜種。
[0053]本發(fā)明實施例以染色體數(shù)目少的白菜型油菜“浩油11號”(AU為母本，以現(xiàn)有抗跳甲芥菜型油菜資源“嚴小村芥菜”(A^V_BB)為父本，進行種間雜交，獲得的Fl代大部分植株具有38條染色體，其基因組為AlrA1^B,花粉粒育性達到50%左右，少部分植株具有28條染色體，其基因組為Alt,表現(xiàn)為完全敗育。通過細胞學和花粉育性觀察，選擇具有38條染色體的植株進行人工剝蕾自交，在下一代即有可能獲得基因組為AlrAn類型的植株。相比傳統(tǒng)的正交方法，大大縮短白菜型油菜種質(zhì)資源創(chuàng)新年限。
[0054]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法，其特征在于，該創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法包括以下步驟: 步驟一、以春油菜區(qū)白菜型油菜主栽品種“浩油11號”為母本，以抗跳甲芥菜型油菜品種“嚴小村芥菜”為父本，進行白菜型油菜WX芥菜型油菜Af BB的種間雜交； 步驟二、通過幼胚拯救，獲得F1，即AlrATB ； 步驟三、選擇具有38條染色體同時花粉育性不少于50%的Fl植株進行剝蕾自交，獲得F2，即 AjAr ； 步驟四、通過細胞學觀察選擇染色體數(shù)目為20的單株再進行跳甲抗性鑒定，獲得抗跳甲白菜型油菜資源。
2.如權(quán)利要求1所述的創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法，其特征在于，步驟一種間雜交的具體操作方法如下: (1)在白菜型油菜盛花期，將一個白菜型油菜單株已經(jīng)開放的花朵全部摘除，用75%酒精擦拭花蕾殺滅沾染的花粉，將開花前1-2天的花蕾去掉雄蕊，再將小花蕾全部摘除；取嚴小村芥菜套袋內(nèi)新鮮花粉授予白菜型油菜子房柱頭上； (2)授粉25-30天之間，取回發(fā)育中的角果，將體視顯微鏡放于超凈工作臺中，在無菌條件下，撥開角果，在體式顯微鏡下剝出瀕臨凋亡的裸胚，放置于MS培養(yǎng)基中，待幼胚發(fā)育成苗后，再將其栽于MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA分化培養(yǎng)基中，快繁繼代，將快繁出的雜種苗放于MS+0.25mg/L NAA培養(yǎng)基生根，生根后，將雜種苗栽于試驗田； (3)在雜種植株蕾苔期，取子房進行體細胞觀察，選擇染色體數(shù)目為38條的植株掛牌標記；在初花期，對具有38條染色`體的植株進行花粉育性觀察。
3.如權(quán)利要求2所述的創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法，其特征在于，初花期對植株進行花粉育性觀察時用于花粉粒染色的試劑為醋酸洋紅。
4.如權(quán)利要求1所述的創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法，其特征在于，對可育Fl進行剝蕾自交的具體操作方法如下: 在開花前將花序套上硫酸紙袋，花開前剝出柱頭，將其自身的花粉授予柱頭上，然后再套上紙袋，10天后取下紙袋，將未授粉的花蕾去掉。
5.如權(quán)利要求4所述的創(chuàng)建抗跳甲白菜型油菜資源的方法，其特征在于，進行輔助自交授粉時可進行重復授粉。
【文檔編號】A01H1/02GK103477973SQ201310429673
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】趙志剛, 牛妍, 余青蘭, 星曉蓉, 肖麓, 王瑞生, 杜德志 申請人:青海省農(nóng)林科學院