一種抗玉米矮花葉病RNAi載體的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，發(fā)明人在分析我國甘蔗花葉病毒（SCMV）基因組群體變異的基礎(chǔ)上，將CI、NIb和CP3個基因的部分片段克隆到載體pCambia3301,構(gòu)建了RNAi載體p3301-SCMVCINIb1CPRi。該載體轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌后在中國普通微生物保藏管理中心（CGMCC）保藏，其保藏編號為CGMCC?NO.4356。利用該載體轉(zhuǎn)化玉米可以培育對高抗矮花葉病的轉(zhuǎn)基因玉米植株。
【專利說明】一種抗玉米矮花葉病RNAi載體的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種RNA干擾(RNAi)載體，特別涉及一種抗玉米矮花葉病的RNAi載體。
【背景技術(shù)】[0002]玉米矮花葉病(Maize dwarf mosaic, MDM)在我國玉米上發(fā)生普遍,是玉米生產(chǎn)中面臨的一個重要問題。引起我國玉米矮花葉病的毒原主要是甘蔗花葉病毒(Sugarcanemosaic virus, SCMV)。SCMV屬于馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus),在自然界中主要通過蟲牙蟲和種子傳播，侵染甘蔗和玉米等禾本科作物。SCMV的基因組由一條正單鏈RNA分子組成，有一個大的開放閱讀框(0RF)，可表達(dá)產(chǎn)生一個多聚蛋白，然后經(jīng)翻譯切割成10個成熟蛋白。我國玉米上發(fā)生的SCMV大多屬于MDB株系。但近年在山東、河北等地還出現(xiàn)了一個國內(nèi)外未見報道的新株系，可以侵染我國大多數(shù)主栽玉米品種。
[0003]種植抗病品種是防治玉米矮花葉病最有效的措施。但在培育抗病品種時面臨選育周期長、抗病基因匱乏及病毒變異會導(dǎo)致寄主抗病性喪失等問題。利用RNAi技術(shù)，通過基因工程手段可以在較短時間內(nèi)獲得抗病毒材料。
[0004]RNAi是真核生物體內(nèi)發(fā)生的、基于核酸序列同源性的一種基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)是RNAi起始的關(guān)鍵因子。它首先被Dicer酶降解為 3'-端具有 2nt 突出的 21-26nt 的小干擾 RNA (small interfering RNA，siRNA)，后者整合入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-1nduced silencing complex, RISC),并指導(dǎo)RISC對同源RNA進(jìn)行識別和切割，最終導(dǎo)致RISC降解靶標(biāo)mRNA。
[0005]形成dsRNA的有效途徑之一是將體外構(gòu)建的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)(inverted repeats,IR)轉(zhuǎn)入植株。轉(zhuǎn)入植物的反向重復(fù)序列在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成dsRNA后，啟動RNAi，可有效控制與轉(zhuǎn)基因有同源性的入侵病毒。反向重復(fù)結(jié)構(gòu)由一段間隔序列(spacer)連接兩段反向互補(bǔ)序列構(gòu)成，轉(zhuǎn)錄后會形成發(fā)夾狀RNA(hairpin RNA,hpRNA)。hpRNA由莖(stem,是反向互補(bǔ)序列轉(zhuǎn)錄的RNA配對形成的雙鏈)和環(huán)(loop,是由spacer轉(zhuǎn)錄的RNA單鏈結(jié)構(gòu))組成。hpRNA中的莖是誘發(fā)序列特異性基因沉默的關(guān)鍵部份，莖的長短影響RNA沉默的效率和穩(wěn)定性，植物中50-1000bp的dsRNA同源片段均能高效誘發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默。轉(zhuǎn)化IR獲得的抗病植株比例和抗病程度高于轉(zhuǎn)正義或反義基因。
[0006]RNAi的效率還取決于IR的莖與入侵病毒核酸一致率的高低。轉(zhuǎn)基因與入侵病毒基因組核苷酸一致率越高，則抗病效果越好。植物RNA病毒在自然界中是以準(zhǔn)種形式存在，同一種病毒的基因組可能有一定程度的變異。在構(gòu)建RNAi載體時，需要針對不同病毒找到最保守的基因，篩選最有效的片斷作為靶標(biāo)。
[0007]應(yīng)用RNAi技術(shù)培育抗甘蔗花葉病毒的玉米植株，可為有效控制玉米矮花葉病提供幫助。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]基于上述原因，發(fā)明人在分析引起我國玉米矮花葉病的SCMV基因組群體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，從其Cl、NIb和CP等基因中篩選到誘導(dǎo)RNAi最有效的3個片段，其序列分別如Seq ID N0.2、Seq ID N0.3和Seq ID N0.4所示，其中Cl位于SCMV BD8全序列中的4878-5430bp，NIb位于全序列的7652_7892bp，CP位于全序列的9008_9303bp，具體如下
表:
[0009]
【權(quán)利要求】
1.一種保藏編號為CGMCC N0.4356的RNAi載體p3301_SCMVCINIblCPRi，其特征在于基因序列如Seq ID N0.1所不。
2.如權(quán)利要求1所述的抗玉米矮花葉病RNAi載體在培育抗矮花葉病玉米植株中的應(yīng)用 。
【文檔編號】A01H5/00GK103451229SQ201310435201
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】李向東, 賈金磊, 張春慶 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)