基因LOC_Os03g24220在植物育種中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及基因LOC_Os03g24220在植物育種中的應用?；騆OC_Os03g24220來源于稻屬水稻（Oryza?sativa?var.Kitaake），編碼SEQ?ID?NO.1所示的蛋白，序列如SEQ?ID?NO.2或3所示。將基因LOC_Os03g24220導入植物肌動蛋白調節(jié)蛋白異常植物中，可得到植物肌動蛋白調節(jié)蛋白正常的轉基因植物。
【專利說明】基因L0C_0s03g24220在植物育種中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及基因L0C_0s03g24220在植物育種中的應用。
【背景技術】
[0002]水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的糧食作物之一，是全球超過30億人口的主食和熱量來源。隨著我國人口的持續(xù)增長、可用耕地面積的不斷減少，提高水稻單產(chǎn)仍是水稻育種及生產(chǎn)的當務之急。目前對水稻研究已進入基因組水平，挖掘重要農(nóng)藝性狀(如株型、株高、分蘗數(shù)、粒形、耐脅迫(生物脅迫、非生物脅迫)等)關鍵基因，分析基因的功能和利用價值，闡述其對水稻生長發(fā)育的作用機理，創(chuàng)新育種材料，為水稻品種分子改良提供基礎。
[0003]肌動蛋白是細胞骨架蛋白的一種，肌動蛋白調節(jié)蛋白通過對肌動蛋白的調節(jié)作用影響著植物的生長發(fā)育。villin蛋白是一類與F - actin互作的肌動蛋白調節(jié)蛋白，由Gl - G6結構域和VHP結構域組成，功能包括:對F - actin的剪切(nucleating)、成束(bundling)和加蓋(capping)。
[0004]Bretscher和Weber, Matsudaira和Burgess這兩個研究小組最早從雞小腸絨毛中分離到villin蛋白。其后的研究表明，villin蛋白只在近端腎近曲小管和腸吸收細胞的絨毛細胞中表達。villin蛋白表達的局限性說明了其功能的局限性。Hampton等在2008年提出villin成束時的3D結構模型，他認為正是VHP結構域的出現(xiàn)才使得villin具備nucleating、bundling、capping的功能。哺乳動物中的研究表明villin蛋白還受到Ca2+/PIP2/磷酸化的調控。
[0005]Klahre等在2000年報道擬南芥共發(fā)現(xiàn)5個動物villin蛋白的同源蛋白(人僅有一種villin蛋白)，分別命名為AtVLNl -AtVLN5。這些基因與人villin蛋白、gelsolin蛋白序列比對后發(fā)現(xiàn)，AtVLN2、AtVLN3與人villin相似性較高。2008年黃善金報道AtVLNl沒有nucleate、severing、capping功能,只有成束、保護F -actin解聚的功能,并且AtVLNl不受Ca2+的調控。Klahre還對AtVLNl、AtVLN2AtVLN3的表達模式進行研究，與人villin不同的是，AtVLNl - 3在所有部位都有表達，同一部位的表達強度也不同。這就說明植物villin的作用范圍更廣。
[0006]目前在單子葉植物水稻中尚未報道villin蛋白，植蛋白的生理、遺傳功能亦未見報道。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供基因L0C_0s03g24220在植物育種中的應用。
[0008]基因L0C_0s03g24220(MSU/TIGR Locus:L0C_0s03g24220, http://rice,plantbiology.msu.edu/ ；RAP - DB:0s03g0356700, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/。本申請中使用MSU/TIGR Locus)在植物育種中的應用，該基因來源于稻屬水稻(Oryza sativavar.Kitaake)，編碼SEQ ID N0.1所示的蛋白，序列如SEQ ID N0.2或3所示。[0009]所述基因L0C_0s03g24220優(yōu)選在培育肌動蛋白調節(jié)蛋白正常的轉基因植物中的應用。
[0010]一種培育植物肌動蛋白調節(jié)蛋白轉基因植物的方法，是將基因L0C_0s03g24220導入植物肌動蛋白調節(jié)蛋白異常植物中，得到植物肌動蛋白調節(jié)蛋白正常的轉基因植物；所述肌動蛋白調節(jié)蛋白異常的植物為植物肌動蛋白調節(jié)蛋白異常作用的植物，其表現(xiàn)為表型扭曲(圖1);所述植物肌動蛋白調節(jié)蛋白正常的轉基因植物為植物肌動蛋白調節(jié)蛋白正常的轉基因植物，其表現(xiàn)為表型正常(圖8)。具體來說，所述基因通過所述重組表達載體導入肌動蛋白調節(jié)蛋白異常植物中；所述肌動蛋白調節(jié)蛋白部分表達植物可為ostwdl。
[0011]所述的方法優(yōu)選將基因L0C_0s03g24220通過重組表達載體PCAMBIA1305-0sVillin2導入植物肌動蛋白調節(jié)蛋白異常的植物中，所述的重組表達載體pCAMBIA1305-0sVillin2是在pCAMBIA1305中載體的酶切位點EcoRI和SpeI之間插入基因L0C_0s03g24220 所得。
[0012]利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將編碼所述蛋白的基因導入植物細胞，可獲轉基因細胞系及轉基因植株。攜帶有所述基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如:煙草、百脈根、擬南芥、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。
[0013]本發(fā)明還請求保護含有基因L0C_0s03g24220的重組表達載體。
[0014]所述植物表達載體 包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。
[0015]使用所述基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉錄起始區(qū)域或結構基因。
[0016]為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因,直接以逆境篩選轉化植株。
[0017]所述重組表達載體可為在pCAMBIA1305的酶切位點EcoRI和SpeI用兩次重組在上述位點間插入所述基因(L0C_0s03g24220)得到的重組質粒。
[0018]所述重組表達載體優(yōu)選pCAMBIA1305 -OsVi 11 in2 ;所述 pCAMBIA1305 -OsVi 11 in2是將OsVillin2基因組DNA及其啟動子區(qū)(轉錄起始位點上游4610bp)分兩次(parti和part2)重組克隆入 pCAMBIA1305。用重組酶將 parti ( - 4610bp - 3211bp，總計 7821bp)重組克隆入PCAMBIA1305載體的酶切位點EcoRI和SpeI得到pCAMBIA1305 - parti。再用重組酶將part2 (3217bp - 10258bp)克隆入載體pCAMBIA1305 - parti的酶切位點SpeI得到 pCAMBIA1305 - part1- part2,即 pCAMBIA1305 - 0sVillin2,基因 0sVillin2 (即 L0C_0s03g24220)轉錄方向為從EcoRI至Spel。
[0019]有益效果:
[0020]本發(fā)明的植物肌動蛋白調節(jié)蛋白影響植株幼苗直立生長。植物肌動蛋白調節(jié)蛋白異常將造成根彎曲生長、葉片皺縮、種子形狀變化以及結實率下降。將上述正常蛋白的編碼基因導入肌動蛋白調節(jié)蛋白異常的植株中后，可以使得其表現(xiàn)出正常的表型。所述蛋白及其編碼基因可以應用于植物遺傳改良。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為野生型Kitaake和突變體twdl幼苗期表型比較。
[0022]圖2為野生型Kitaake和突變體twdl抽穗期株高比較。
[0023]圖3為突變基因在第3染色體上的精細定位。
[0024]圖4為L0C_0s03g24220基因克隆引物位點
[0025]圖5為野生型Kitaake和突變體twdlT-DNA插入位點驗證。
[0026]圖6為野生型Kitaake和突變體twdl插入位點上基因表達分析。
[0027]圖7為突變體twdl轉pCAMBIA1305 - 0sVillin2基因PCR分子檢測結果。
[0028]圖8為轉pCAMBIA1305 - 0sVillin2的Ttl代陽性植株的幼苗表型。
[0029]圖9為轉pCAMBIA1305 - 0sVillin2的Ttl代陽性植株的株高表型。
【具體實施方式】
[0030]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0031]實施例1、植物肌動蛋 白調節(jié)蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)
[0032]一、水稻扭曲突變體ostwdl表型及其遺傳分析
[0033]本實驗室在水稻品種Kitaake的T - DNA插入突變體庫中發(fā)現(xiàn)了幼苗扭曲生長的突變體，命名為twdl (Twisted and dwarf I,扭曲矮化突變體)，與野生型相比,twdl突變體在幼苗(6天)表現(xiàn)出極端扭曲表型(圖1)，包括地上部分第一葉的葉鞘和主根都出現(xiàn)扭曲的表型，而野生型則表現(xiàn)正常。在抽穗期，與野生型相比，twdl的株高出現(xiàn)明顯下降。并且部分葉片出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象；穗子散生，非直立(圖2)。對突變體株高進行進一步分析表明，穗子長度、第三和第四節(jié)間長度沒有發(fā)生明顯變化，而第一節(jié)間和第二節(jié)間出現(xiàn)明顯縮短。另外，突變體育性也出現(xiàn)了明顯下降，育性降至0.54±0.11 (野生型結實率為0.95±0.02，差異極顯著)。
[0034]遺傳分析:利用突變體twdl與其野生型Kitaake回交三次，所有的雜交F1(BCF1，BC2F1，BC3F1)均表現(xiàn)出正常表型。再利用BC3F1自交得到的F2群體進行遺傳分析。利用F2群體的288個單株進行的遺傳分析表明，twdl扭曲表型受I對隱性基因控制，并且此基因與T - DNA共分尚。
[0035]二、突變基因定位
[0036]1、突變基因定位
[0037]以上遺傳分析的結果，該隱性基因與T-DNA共分離。首先在上述BC3F2群體中選取扭曲表型的單株I株，用葉片提取突變體twdl基因組DNA。利用T-DNA的序列設計特異引物(T-DNA 左臂 3 條引物 LB-SP-1，LB-SP-2，LB-SP-3; T-DNA 右臂的 3 條引物 RB-SP-1，RB-SP-2，RB-SP-3,序列如表1所示)，再利用劉耀光等報道的Tail-PCR技術，我們獲得了T-DNA在twdl基因組中的插入位點附近的水稻基因組序列。通過用上訴序列和水稻日本晴基因組數(shù)據(jù)庫比對，確定插入位點在水稻基因組中的位置。根據(jù)我們的結果，T-DNA插入在第3染色體短臂上，插入位點在L0C_0s03g24220基因尾部(圖3)。我們根據(jù)上訴獲得的序列，設計2對引物(圖4)，用PCR再次驗證T-DNA插入位點(圖5)。
[0038]上述Tail - PCR的方法如下所述:
[0039](I)提取上述選取單株的總DNA作為模板，具體方法如下:
[0040]①取0.2克左右的水稻幼嫩葉片，置于Eppendorf管中，管中放置一粒鋼珠，把裝好樣品的Eppendorf管在液氮中冷凍5min，置于2000型GEN0/GRINDER儀器上粉碎樣品Imin0
[0041]②加入660 μ I 提取液(含 IOOmM Tris - Hcl (ΡΗ8.0),20mM EDTA (PH8.0), 1.4MNaCl,0.2g/mlCTAB的溶 液)，漩渦器上劇烈渦旋混勻，冰浴30min。
[0042]③加入40 μ 120%SDS, 65°C溫浴lOmin，每隔兩分鐘輕輕上下顛倒混勻。
[0043]④加入100 μ 15Μ NaCl，溫和混勻。
[0044]⑤加入100 μ 110XCTAB，65°C溫浴lOmin，間斷輕輕上下顛倒混勻。
[0045]⑥加入900 μ I氯仿，充分混勻，12000rpm離心3min。
[0046]⑦轉移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600 μ I異丙醇，混勻，12000rpm離心5min。
[0047]⑧棄上清液,沉淀用70% (體積百分含量)乙醇漂洗一次,室溫涼干。
[0048]⑨加入100 μ IlXTE (121克Tris溶于I升水中，用鹽酸調PH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。
[0049]⑩取2 μ I電泳檢測DNA質量，并用DU800分光光度儀測定濃度(BechmanInstrument Inc.U.S.A)。
[0050](2)將上述提取的DNA稀釋成約20ng/ μ 1，作為模板進行Tail - PCR擴增:
[0051](3) TAIL - PCR 反應
[0052]①第一輪TAIL - PCR反應體系:[0053]
【權利要求】
1.基因L0C_0s03g24220在植物育種中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于權利要求1所述基因在培育肌動蛋白調節(jié)蛋白正常的轉基因植物中的應用。
3.一種培育植物肌動蛋白調節(jié)蛋白轉基因植物的方法，其特征在于是將基因LOC_0s03g24220導入植物肌動蛋白調節(jié)蛋白異常植物中，得到植物肌動蛋白調節(jié)蛋白正常的轉基因植物；所述植物肌動蛋白調節(jié)蛋白異常的植物為植物肌動蛋白調節(jié)蛋白異常作用的植物；所述植物肌動蛋白調節(jié)蛋白正常的轉基因植物為植物肌動蛋白調節(jié)蛋白正常的轉基因植物。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于基因L0C_0s03g24220通過重組表達載體PCAMBIA1305-0sVillin2導入植物肌動蛋白調節(jié)蛋白異常的植物中，所述的重組表達載體pCAMBIA1305-0sVillin2是在pCAMBIA1305中載體的重組位點EcoRI和SpeI之間插入基因L0C_0s03g24220 所得。
5.含有基因L0C_0s03g24220的重組表達載體。
6.根據(jù)權利要求5所述的重組表達載體，其特征在于:所述重組表達載體是在PCAMBIA1305中載體的重組位點EcoRI和SpeI之間插入基因L0C_0s03g24220所得。
【文檔編號】A01H5/00GK103602704SQ201310451602
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權日:2013年9月27日
【發(fā)明者】萬建民, 吳盛陽, 張俊杰, 吳傳銀, 江玲, 張欣, 王久林, 程治軍, 郭秀平 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學, 中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所