一種伊枯草菌素a水劑及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種伊枯草菌素A水劑及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所述的伊枯草菌素A水劑是樟樹(shù)內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌CC09菌株發(fā)酵液離心所得的上清液，經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附、濃縮所制備的活性浸膏與自來(lái)水、助劑按照一定配比所得的均一、穩(wěn)定的溶液。本發(fā)明所述的伊枯草菌素A水劑具有油水兩親的表面活性、對(duì)熱、堿穩(wěn)定、貯存期長(zhǎng)、殺菌譜廣、不易產(chǎn)生抗藥性、無(wú)副作用、生物安全和環(huán)境友好等特點(diǎn)，對(duì)土傳植物根腐病和葉部白粉病等有很高的防效。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種伊枯草菌素A水劑及其制備方法與應(yīng)用
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種伊枯草菌素A水劑及其制備方法與應(yīng)用。
二、【背景技術(shù)】
[0002]人口與糧食問(wèn)題是21世紀(jì)人類(lèi)面臨的重要挑戰(zhàn)之一。世界主要糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物每年因病害損失達(dá)20%(0erke et al.2004)。中國(guó)的情況至少在10%~15%之間，如果完全不使用農(nóng)藥，正常年份的黃瓜損失約為55%—75%、蘿卜為40%、甘藍(lán)為25%、蘋(píng)果為30%、甜菜為24% (陳萬(wàn)義1998)
[0003]然而，由于化學(xué)農(nóng)藥的大量使用和不正確使用，在獲得較大經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益的同時(shí)，也給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了一系列問(wèn)題，如3R問(wèn)題，即害蟲(chóng)抗藥性(Resistance)、殘留(Residue)、害蟲(chóng)再娼獗(Resurgence)(金衛(wèi)根2002)。另外,化學(xué)農(nóng)藥的生物毒性、研制新品種的費(fèi)用昂貴以及環(huán)境相容性差等缺點(diǎn)也日趨嚴(yán)重(Ler0UX1996)。因此，開(kāi)發(fā)研制更加安全、高效、環(huán)境友好的農(nóng)藥制劑已成為農(nóng)藥行業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。
[0004]相對(duì)于化學(xué)農(nóng)藥，生物農(nóng)藥最大的優(yōu)勢(shì)在于能克服化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境的污染和減少在農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量，是提高我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的關(guān)鍵因素之一。目前使用最多的生物農(nóng)藥是微生物農(nóng)藥，包括以菌體為有效成分的殺菌劑類(lèi)以及以微生物代謝產(chǎn)物為有效成分的農(nóng)用抗生素類(lèi)(如井R霉素、瀏陽(yáng)霉素等)。其中研究和應(yīng)用較多的是芽孢桿菌，如枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等。芽孢桿菌能夠合成多種抗菌物質(zhì)，如短肽和環(huán)脂肽，其中環(huán)脂肽(伊枯草菌素)是該類(lèi)細(xì)菌最重要的殺菌成分之一。然而由于芽孢桿菌代謝產(chǎn)物中該類(lèi)物質(zhì)較少，目前尚無(wú)環(huán)脂肽類(lèi)殺菌劑產(chǎn)品。
[0005]本發(fā)明報(bào)道一種利用樟樹(shù)內(nèi)生菌解淀粉芽孢桿菌CC09代謝產(chǎn)物(Cai etal.2013)生產(chǎn)的新殺菌劑——伊枯草菌素A水劑及其在防治小麥白粉病中的應(yīng)用。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明需要解決的問(wèn)題是利用分離自樟樹(shù)莖桿的內(nèi)生菌，開(kāi)發(fā)一種可以用于植物白粉病防治的髙效、安全、環(huán)境友好、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的微生物農(nóng)藥制劑。本發(fā)明提供來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌CC09的伊枯草菌素A水劑的制備工藝；提供伊枯草菌素A水劑在防治小麥白粉病中的應(yīng)用及使用方法。
[0007]本發(fā)明采用的細(xì)菌是內(nèi)生細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌CC09 (Bacillusamyloliquefaciens CC09)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為CC09菌株)，該菌株已申請(qǐng)發(fā)明專(zhuān)利“一種防治植物病害的生防菌及其制備方法(專(zhuān)利授權(quán)號(hào):ZL201110073773.9) ”及“利用RNA聚合酶突變提高環(huán)脂肽類(lèi)抗生素產(chǎn)量的突變體及制法和應(yīng)用(專(zhuān)利授權(quán)號(hào):ZL201110386416.8)“。
[0008]本發(fā)明所述伊枯草菌素A水劑是CC09菌株發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體后的上清液，經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附濃縮后所得的浸膏與自來(lái)水和助劑按一定比例配制所得的穩(wěn)定均一溶液，該溶液的抗菌活性物質(zhì)為CC09菌株所產(chǎn)生的環(huán)脂肽類(lèi)物質(zhì)——伊枯草菌素A。[0009]本發(fā)明所述的伊枯草菌素A水劑具有廣譜抗植物病原真菌作用，如尖孢鐮刀菌、大豆炭疽、立枯絲核和鏈格孢菌等。盆栽防病實(shí)驗(yàn)證明，伊枯草菌素A水劑對(duì)小麥白粉病有很高的防效，并且該制劑具備工業(yè)化生產(chǎn)的基本要求。
[0010]本發(fā)明所述的伊枯草菌素A水劑在防治黃瓜白粉病或大豆炭疽病或小麥白粉病或小麥赤霉病或葡萄白粉病多種植物真菌病害農(nóng)藥上具有巨大潛力。可制備成防治黃瓜白粉病或大豆炭疽病或小麥白粉病或小麥赤霉病或葡萄白粉病多種植物真菌病害的新生物農(nóng)藥。
[0011]本發(fā)明所述的伊枯草菌素A水劑的制備方法如下:
[0012](1)CC09菌株發(fā)酵液離心去除菌體，所得上清液用X-5大孔樹(shù)脂吸附濃縮，樹(shù)脂與上清液的體積比為1: 100，流速為4ml/min，洗脫溶劑為95%的乙醇，流速4ml/min，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，即得含伊枯草菌素A的活性浸膏(以下簡(jiǎn)稱(chēng)活性浸膏)。
[0013](2)稱(chēng)取IOg活性浸膏，溶解于適量水中，然后依次加入苯甲酸鈉0.2g、正戊醇
2.0ml、乙二醇2.0ml、纖維素鈉1.0g和苯磺酸鈉0.5g，使其終濃度分別為0.2%、2%、2%、1%和0.5%，補(bǔ)充水至100ml，再用2M的NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5，即為伊枯草菌素A水劑，該水劑中伊枯草菌素A的含量為0.58mg/ml。貯存于棕色細(xì)口瓶中。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果:CC09菌株為樟樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌，具有發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單、抗菌有效成分含量較高和環(huán)境安全的優(yōu)勢(shì)，而且具有廣譜抗菌活性，可用于多種植物病害的防治，尤其對(duì)白粉病有較高的預(yù)防和治療作用。
四、【具體實(shí)施方式】
[0015]下面用實(shí)施例來(lái) 進(jìn)一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0016]實(shí)施例一:伊枯草菌素A活性浸膏的制備方法
[0017]種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，挑取活化的CC09單菌落接種到4ml LB培養(yǎng)基(15ml試管)培養(yǎng)，37°C，120rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)18h。接種的種子液于250mlLB培養(yǎng)基搖瓶(IL)中，37 0C，120rpm搖床培養(yǎng)48h，所得發(fā)酵液經(jīng)12，OOOrpm離心5min去除菌體后，所得上清液用X-5大孔樹(shù)脂吸附濃縮，樹(shù)脂與上清液體積比為1: 100，流速為4ml/min ;洗脫溶劑為95%的乙醇，流速4ml/min，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀80°C減壓濃縮至干，即得棕色含有有效成分伊枯草菌素A的活性浸膏。
[0018]實(shí)施例二:伊枯草菌素A水劑的制備方法
[0019]實(shí)施例一所得活性浸膏用于伊枯草菌素A水劑的配制。稱(chēng)取IOg活性浸膏，溶解于適量水中，然后依次加入苯甲酸鈉0.2g、正戊醇2.0ml、乙二醇2.0ml、纖維素鈉1.0g和苯磺酸鈉0.5g，使其終濃度分別為0.2%、2%、2%、1%和0.5%，補(bǔ)充水至100ml，再用2M的NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5，即為伊枯草菌素A水劑，貯存于棕色細(xì)口瓶中。
[0020]實(shí)施例三:伊枯草菌素A水劑中有效成分含量分析
[0021]伊枯草菌素A水劑中的有效成分采用高效液相色譜法分析，流動(dòng)相為45%的乙腈溶液(含5mM乙酸銨),流速lml/min。以購(gòu)買(mǎi)自Sigma公司的伊枯草菌素A (iturin A)為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，定量分析不同濃度水劑中伊枯草菌素A的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)含浸膏10%的伊枯草菌素A水劑中有效成分伊枯草菌素A的含量為0.58mg/mlo
[0022]實(shí)施例四:伊枯草菌素A水劑預(yù)防小麥白粉病實(shí)驗(yàn)[0023]小麥一葉一心期噴施伊枯草菌素A水劑，每盆10株，2天后接種白粉病菌60盆。伊枯草菌素A水劑的噴施濃度梯度分別為稀釋1000倍、2000倍、3000倍、4000倍和5000倍。清水作為對(duì)照(CK);每個(gè)濃度噴施10盆小麥，每盆噴施IOml伊枯草菌素A水劑。噴施后5天、7天、9天、11天、13天、15天分別調(diào)查小麥葉片的病情指數(shù)及防治效果。
[0024]病情指數(shù)及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下:
[0025]O級(jí):無(wú)??；
[0026]I級(jí):病斑面積占整片葉面積的5%以下；
[0027]3級(jí):病斑面積占整片葉面積的6%~15% ；
[0028]5級(jí):病斑面積占整片葉面積的16%~25% ；
[0029]7級(jí):病斑面積占整片葉面積的26%~50% ；
[0030]9級(jí):病斑面積占整片葉面積的50%以上；
[0031]病情指數(shù)=Σ (各級(jí)病葉數(shù)X相對(duì)級(jí)數(shù)值)]X 100/(調(diào)查總?cè)~數(shù)X9)
[0032]防治效果(％ ) = [CK病指數(shù)-PT病指數(shù))/CK病指數(shù)]X 100
[0033]式中:CK病指數(shù)為空白對(duì)照病情指數(shù)；PT病指數(shù)為處理施藥后病情指數(shù)。
[0034]表1噴施伊枯草菌素A水劑不同天數(shù)后對(duì)小麥白粉病的預(yù)防作用
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種伊枯草菌素A水劑，其特征是樟樹(shù)內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌CC09菌株發(fā)酵液離心除去菌體后的上清液，經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附濃縮所得的活性浸膏與自來(lái)水和助劑配制所得的穩(wěn)定均一溶液，該溶液的抗菌活性物質(zhì)為解淀粉芽孢桿菌CC09所產(chǎn)生的環(huán)脂肽類(lèi)物質(zhì)——伊枯草菌素A。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的伊枯草菌素A水劑的制備方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成: (1)解淀粉芽孢桿菌CC09發(fā)酵液離心去除菌體后的上清液，用X-5大孔樹(shù)脂吸附濃縮制備活性浸膏，大孔樹(shù)脂與上清液的體積比為1:100，流速為4ml/min，洗脫溶劑為95%的乙醇，流速4ml/min，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀80°C減壓濃縮至干，即得含伊枯草菌素A的活性浸膏； (2)稱(chēng)取IOg活性浸膏，溶解于適量水中，然后依次加入苯甲酸鈉0.2g、正戊醇2.0ml、乙二醇2.0ml、纖維素鈉1.0g和苯磺酸鈉0.5g，使其終濃度分別為0.2%、2%、2%、1%和0.5%，補(bǔ)充水至100ml，再用2M的NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5，即為伊枯草菌素A水劑，該水劑中伊枯草菌素A的含量為0.58mg/ml。貯存于棕色細(xì)口瓶中。
3.權(quán)利要求1所述的伊枯草菌素A水劑在制`備防治白粉病農(nóng)藥中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01P3/00GK103478146SQ201310455184
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】劉常宏, 蔡勛超, 薛雅蓉, 劉京蘭 申請(qǐng)人:南京大學(xué)