一種蛹蟲(chóng)草的培育方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種蛹蟲(chóng)草的培育方法，它包括以下步驟：干蠶蛹粉20g/L、大米粉180g/L、磷酸二氫鉀1.2g/L、磷酸二氫鈉1g/L、余量為水配制培養(yǎng)基，密封、滅菌、冷卻；接種蛹蟲(chóng)草菌種，菌種密度為3～5個(gè)菌球/mL，培養(yǎng)基與菌種體積比為50:1；培養(yǎng)，包括暗培養(yǎng)、光培養(yǎng)；收獲子實(shí)體。使用該方法培育得到的蛹蟲(chóng)草制成藥物，以接種有l(wèi)ewiss肺癌的C57小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，按藥物中蛹蟲(chóng)草給藥劑量為5g/kg的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行給藥，每日給藥1次，連續(xù)10天后，檢測(cè)得lewis肺癌腫瘤的抑制率為19.6%。
【專利說(shuō)明】一種蛹蟲(chóng)草的培育方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛹蟲(chóng)草培育【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種蛹蟲(chóng)草的培育方法，以及使用該方法培育得到的蛹蟲(chóng)草在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蛹蟲(chóng)草(Cordyceps militaris),又名北蟲(chóng)草,隸屬于真菌界的子囊菌亞門(mén)、麥角菌科、蟲(chóng)草屬。它是一種藥用真菌。蛹蟲(chóng)草中含有糖、脂肪和蛋白質(zhì)，此外，還含有多種氨基酸、微量元素和維生素。蛹蟲(chóng)草中的多種生理活性成分具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、保護(hù)肝臟、增強(qiáng)免疫力等藥理作用。而其與腫瘤相關(guān)的活性物質(zhì)包括蟲(chóng)草素、多糖、蟲(chóng)草酸、甾醇類、硒、類胡蘿卜素、蛋白質(zhì)等。
[0003]然而，目前市面上出售的蛹蟲(chóng)草大多只追求蟲(chóng)草素的含量，導(dǎo)致其抗腫瘤的效果不是很明顯，達(dá)不到人們的期望。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種蛹蟲(chóng)草的培育方法，將該方法培育出的蛹蟲(chóng)草應(yīng)用在制備治療肺癌的藥物中，其抗肺癌效果顯著。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
[0006]一種蛹蟲(chóng)草的培育方法，包括以下步驟:
[0007](I)蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基的配制:以純凈水將KH2P04、NaH2PO4溶解、并充分混勻后再加入
干蠶蛹粉、大米粉混合均勻，然后裝入培養(yǎng)瓶，密封、滅菌、冷卻，其中各組分的含量為:
[0008]
干蠶蛹粉20 g/L；
大米粉180 g/L;
磷酸二氫鉀1.2 g/L;
磷酸二氫鈉I g/L;
[0009](2)接種:在步驟(1)所得的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基中接種蛹蟲(chóng)草菌種，所述蛹蟲(chóng)草菌種為Cordyceps militaris (L.) Link.、液體菌種，所述蛹蟲(chóng)草菌種的密度為3~5個(gè)菌球/mL,所述蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基與蛹蟲(chóng)草菌種的體積比為50:1 ；
[0010](3)培養(yǎng):
[0011](a)暗培養(yǎng):在溫度22°C、濕度75~85%條件下避光培養(yǎng)3~5天，至蛹蟲(chóng)草菌絲長(zhǎng)滿所述蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基表面；
[0012](b)第5~20天采用的光照培養(yǎng):白天12小時(shí)日光燈光照，溫度20~22°C、濕度80~85%，光照強(qiáng)度控制在100~150Lx ;晚上12小時(shí)閉光，溫度18~20°C、濕度75~85% ;每天通風(fēng)2次，早晚各一次,每次20~30分鐘；
[0013](c)第21~35天采用的光照培養(yǎng):白天12小時(shí)自然光加日光燈光照，溫度20~22°C、濕度75%~85%，總光照強(qiáng)度控制在1000~1200Lx ;晚上12小時(shí)閉光，溫度18~200C、濕度75~85% ;每天通風(fēng)2次，早晚各一次，每次20~30分鐘；
[0014]本步驟(b)、(C)中培養(yǎng)所用的光源均為散射光，培養(yǎng)過(guò)程中定時(shí)對(duì)培養(yǎng)瓶進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶使光照均勻；
[0015](4)收獲及再培養(yǎng):將經(jīng)過(guò)步驟(3)培養(yǎng)后培養(yǎng)瓶中成熟的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體取出，剩余部分按照步驟(3) (c)的方法繼續(xù)培養(yǎng)至子實(shí)體成熟。
[0016]作為優(yōu)選，所述步驟(1)中蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基的滅菌條件為121°C，1.1Mpa滅菌30~40mino
[0017]本發(fā)明以蠶蛹粉為主要原料、大米為輔料配制蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基，并且通過(guò)梯度實(shí)驗(yàn)最終確定本發(fā)明所述的培養(yǎng)基最優(yōu)配方，然后采用特殊的培養(yǎng)方式:暗培養(yǎng)、然后不同時(shí)間段不同的光照培養(yǎng)方式，再加上光源采用散射光，培養(yǎng)過(guò)程中定時(shí)對(duì)培養(yǎng)瓶進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶使光照均勻，即通過(guò)從整體上優(yōu)化培育方案，最終確定本發(fā)明所述的蛹蟲(chóng)草的培育方法，嚴(yán)格按照該方法培育得到的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體經(jīng)過(guò)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)每Ig蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中腺苷含量為15-20mg、蟲(chóng)草素含量為7.5-8mg、多糖含量為25_33mg,明顯高于米用現(xiàn)有技術(shù)方法所培育得到的蛹蟲(chóng)草。
[0018]本發(fā)明上述方法得到的蛹蟲(chóng)草在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用，即利用本發(fā)明方法培育所得的蛹蟲(chóng)草進(jìn)行制備治療肺癌的藥物，然后進(jìn)行抗腫瘤試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法培育所得的蛹蟲(chóng)草制備成的藥物其抗肺癌效果顯著優(yōu)于目前市場(chǎng)上市售的蛹蟲(chóng)草制成的藥物。以接種有Iewiss肺癌的C57小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將蛹蟲(chóng)草磨粉后制成藥物，按藥物中蛹蟲(chóng)草給藥劑量為5g/kg的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行給藥，每日給藥I次，連續(xù)10天后，檢測(cè)得lewis肺癌腫瘤的抑制率為19.6%。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1所示的是實(shí)施例中各蛹蟲(chóng)草制成的藥物對(duì)小鼠lewis腫瘤生長(zhǎng)抑制作用圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0020]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述，但不局限于此。
[0021]本方法以繅絲后的蠶蛹為主要原料，大米為輔料所培養(yǎng)的蛹蟲(chóng)草可收獲兩季，每瓶每次可獲Ig干重的蛹蟲(chóng)草。
[0022]實(shí)施實(shí)例中所提及的荷瘤鼠為接種有Iewiss肺癌的C57。小鼠C57小鼠為普通級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，雌雄兼用，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào):SCXK-(軍)2007-004。腫瘤瘤源lewis肺癌由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。環(huán)磷酰胺片，鋁塑包裝，每片含環(huán)磷酰胺50mg、人參莖葉總皂苷50mg，天津金世制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H12021006。氯化鈉注射液(生理鹽水)，瓶裝，500mL/瓶，山東齊都藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)1D12052502,國(guó)藥準(zhǔn)字 H37020764。
[0023]一、蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基的配制
[0024]本發(fā)明的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基為水溶液，由如下濃度的成分構(gòu)成:
[0025]干蠶蛹粉20 g/L;
大米粉180 g/L;
磷酸二氫鉀1.2 g/L;
磷酸二氫鈉I g/L。
[0026]具體制備方法如下:
[0027]取如下重量的成分:干蠶蛹粉300g，大米粉2.7kg，磷酸二氫鉀18g，磷酸二氫鈉15g；加純凈水12L先把KH2P04、NaH2PCM先溶解、并充分混勻后再加入干蠶蛹粉、大米粉混合均勻，得到體積為15L的培養(yǎng)基溶液，勻漿，分裝入培養(yǎng)瓶，每瓶裝50ml，蓋好蓋子，121°C，1.1Mpa滅菌30~40min，待其自然冷凝后備用。
[0028]二、蛹蟲(chóng)草的接種、培養(yǎng)
[0029]1、在超凈臺(tái)中接種蟲(chóng)草菌體(菌種為Cordyceps militaris (L) Link),液體菌種，密度控制在3-5個(gè)菌球/mL，每培養(yǎng)瓶lmL。
[0030]2、在溫度22°C、濕度75~85%條件下避光培養(yǎng)3~5天，使蟲(chóng)草菌絲迅速長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面，防止其他雜菌在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)。
[0031]3、第5~20天光照培養(yǎng)，白天12小時(shí)日光燈光照，溫度20~22°C(最好為22°C )、濕度80~85%，光照強(qiáng)度控制在100~150Lx ;晚上12小時(shí)閉光，溫度18~20°C (最好18°C )、濕度75~85%。每天通風(fēng)2次，早晚各一次，氣溫相對(duì)低的時(shí)候進(jìn)行每次20~30分鐘。白天晚上溫差有利于原基的分化形成。
[0032]4、第21~35天白天12小時(shí)光照(自然光加日光燈)，溫度20~22°C (最好為22°C)、濕度75%~85%，光照強(qiáng)度控制在1000~1200Lx ;晚上12小時(shí)閉光，溫度18~20°C(最好為18°C )、濕度75~85%。此時(shí)間為子實(shí)體生長(zhǎng)時(shí)期，強(qiáng)光對(duì)子實(shí)體的生長(zhǎng)有利，使其呈棒狀生長(zhǎng)并不斷成熟、健壯、色澤變?yōu)轷r艷的橙黃色，在此生長(zhǎng)階段每天通風(fēng)2次，早晚各一次，氣溫相對(duì)低的時(shí)候進(jìn)行每次20~30分鐘。
[0033]5、收獲及再培養(yǎng)，旋開(kāi)培養(yǎng)瓶蓋，鑷子用75%酒精消毒后，將子實(shí)體取出(只取出培養(yǎng)基上面的部分)，將取出的子實(shí)體置于干凈的不銹鋼盤(pán)中，挑選色澤均勻、粗壯、完整的子實(shí)體，去除殘存的培養(yǎng)基后置于新的不銹鋼盤(pán)中稱重備用；培養(yǎng)瓶中剩余部分按第20~35天的培養(yǎng)條件及方法繼續(xù)培養(yǎng)，再次收獲。
[0034]培養(yǎng)中的注意事項(xiàng):
[0035]A、光照時(shí)要用散射光，而不能用直射光，蟲(chóng)草的生長(zhǎng)有向光性，對(duì)光照均勻的地方的瓶子要進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶，使其光照均勻，子實(shí)體向上生長(zhǎng)。
[0036]B、在培養(yǎng)過(guò)程中要嚴(yán)格控制溫度和濕度，所以要嚴(yán)格控制好溫度。在目前車(chē)間沒(méi)控制溫度設(shè)備的情況下，要用地面灑水來(lái)控制培養(yǎng)室的溫度，一般一天灑水3次，但也要根據(jù)當(dāng)天的氣溫情況來(lái)變，溫度高要多灑，培養(yǎng)室溫度超過(guò)25°C，要開(kāi)空調(diào)降溫。
[0037]C、每天培養(yǎng)室要通風(fēng)換氣一到兩次，時(shí)間選擇在早上和傍晚溫度相對(duì)低的時(shí)候，每次20~30分鐘。
[0038]D、接種后污染的瓶子要及時(shí)的拿出，把里面的培養(yǎng)基倒出重新滅菌后重新接種，不能讓污染的瓶子放在培養(yǎng)室里培養(yǎng)，而造成整個(gè)培養(yǎng)室受雜菌的污染。
[0039]三、蛹蟲(chóng)草制成的藥物對(duì)肺癌的抑制試驗(yàn)[0040]1、腫瘤接種
[0041]取接種腫瘤10-13天狀態(tài)良好的荷瘤鼠脫臼處死，體表酒精消毒，在無(wú)菌(超凈臺(tái))環(huán)境下剝離小鼠腫瘤至盛有生理鹽水的無(wú)菌平皿，剪至小塊，將小塊腫瘤放入組織勻漿器，按體積比1:3左右加入生理鹽水勻漿，勻漿液即腫瘤細(xì)胞混懸液倒入50ml無(wú)菌離心管，備用?；罴?xì)胞計(jì)數(shù)1X 107/ml濃度，2ml注射器針頭套在Iml注射器上，在C57小鼠腋下1.p.接種0.2ml腫瘤細(xì)胞混懸液，腫瘤細(xì)胞混懸液的制備均在無(wú)菌條件下(超凈工作臺(tái)中)完成。從取出腫瘤至腫瘤接種完畢在60分鐘內(nèi)完成。
[0042]2、分組與給藥
[0043]腫瘤細(xì)胞接種后24小時(shí)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組，依實(shí)驗(yàn)要求不同共分為6組，每組動(dòng)物數(shù)量為10~12只不等。實(shí)驗(yàn)分組為:①生理鹽水對(duì)照組(NS組)、②陽(yáng)性藥物(環(huán)磷酰胺)對(duì)照組、③~⑥分別為市售蛹蟲(chóng)草A制成的藥物、市售蛹蟲(chóng)草B制成的藥物、市售蛹蟲(chóng)草C制成的藥物、本發(fā)明方法培育所得蛹蟲(chóng)草Z制成的藥物。
[0044]3、試劑配置:
[0045]取一粒環(huán)磷酰胺片，于硯缽中磨成粉末，加入40ml生理鹽水混勻，分裝，三天配置一次。分別稱取市售蟲(chóng)草A、B、C以及本方法培育蟲(chóng)草Z粉末1.5g,各加入4.5ml生理鹽水，配制成250mg/ml的溶液制成藥物,每天實(shí)驗(yàn)前配制。
[0046]4、給藥方案:
[0047]NS組，灌胃相應(yīng)容積的生理鹽水；③~⑦市售蛹蟲(chóng)草A制成的藥物、市售蛹蟲(chóng)草B制成的藥物、市售蛹蟲(chóng)草C制成的藥物、本發(fā)明方法培育所得蛹蟲(chóng)草Z制成的藥物，分別灌胃給以相應(yīng)劑量的溶液，給藥容積均為0.4mL/20g (活性成分蛹蟲(chóng)草給藥劑量為5g/kg);陽(yáng)性藥物(環(huán)磷酰胺)對(duì)照組，口服環(huán)磷酰胺25mg/kg(0.4mL/20g);各給藥組每日均給藥I次，連續(xù)10天。自腫瘤接種后24小時(shí)開(kāi)始給藥。
[0048]5、療效評(píng)價(jià)
[0049]末次給藥后24小時(shí)，處死動(dòng)物，稱取體重，解剖并取出腫瘤組織，稱取腫瘤重量，以腫瘤生長(zhǎng)抑制率來(lái)評(píng)價(jià)藥物的體內(nèi)抗癌效果，計(jì)算公式為:腫瘤生長(zhǎng)抑制率=(I 一給藥組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)X 100%。
[0050]6、數(shù)據(jù)處理
[0051]全部數(shù)據(jù)均以均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計(jì)分析，組間比較t檢驗(yàn)。結(jié)果如表1和圖1所示。
[0052]表1各蛹蟲(chóng)草制成的藥物對(duì)小鼠lewis腫瘤生長(zhǎng)抑制作用
[0053]
【權(quán)利要求】
1. 一種蛹蟲(chóng)草的培育方法，其特征在于包括以下步驟: (O蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基的配制:以純凈水將KH2P04、NaH2PO4溶解、并充分混勻后再加入干蠶蛹粉、大米粉混合均勻，然后裝入培養(yǎng)瓶，密封、滅菌、冷卻，其中各組分的含量為:干蠶蛹粉20 g/L；大米粉180 g/L;磷酸二氫鉀1,2 g/L;磷酸二氫鈉I g/L; (2)接種:在步驟(1)所得的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基中接種蛹蟲(chóng)草菌種，所述蛹蟲(chóng)草菌種為Cordyceps militaris (L.) Link.、液體菌種，所述蛹蟲(chóng)草菌種的密度為3~5個(gè)菌球/mL,所述蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基與蛹蟲(chóng)草菌種的體積比為50:1 ； (3)培養(yǎng): (a)暗培養(yǎng):在溫度22°C、濕度75~85%條件下避光培養(yǎng)3~5天，至蛹蟲(chóng)草菌絲長(zhǎng)滿所述蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基表面； (b)第5~20天采用的光照培養(yǎng):白天12小時(shí)日光燈光照，溫度20~22°C、濕度80~85%，光照強(qiáng)度控制在100~150Lx ;晚上12小時(shí)閉光，溫度18~20°C、濕度75~85% ;每天通風(fēng)2次，早晚各一次，每次20~30分鐘； (c )第21~35天采用的光照培養(yǎng):白天12小時(shí)自然光加日光燈光照，溫度20~22 °C、濕度75%~85%，總光照強(qiáng)度控制在1000~1200Lx ;晚上12小時(shí)閉光，溫度18~20°C、濕度75~85% ;每天通風(fēng)2次，早晚各一次，每次20~30分鐘； 本步驟(b)、(C)中培養(yǎng)所用的光源均為散射光，培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)培養(yǎng)瓶進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶使光照均勻； (4)收獲及再培養(yǎng):將經(jīng)過(guò)步驟(3)培養(yǎng)后培養(yǎng)瓶中成熟的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體取出，剩余部分按照步驟(3) (c)的方法繼續(xù)培養(yǎng)至子實(shí)體成熟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛹蟲(chóng)草的培育方法，其特征在于:所述步驟(1)中蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基的滅菌條件為121°C，1.1Mpa滅菌30~40min。
3.權(quán)利要求1所述的一種蛹蟲(chóng)草的培育方法培育所得的蛹蟲(chóng)草在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用，其特征在于:以接種有Iewiss肺癌的C57小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將蛹蟲(chóng)草磨粉、制成藥物，按藥物中蛹蟲(chóng)草給藥劑量為5g/kg的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行給藥，每日給藥I次，連續(xù)10天后，檢測(cè)得lewis肺癌腫瘤的抑制率為19.6%。
【文檔編號(hào)】C05G1/00GK103477871SQ201310456846
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】陳劍清, 舒特俊 申請(qǐng)人:浙江理工大學(xué)