一種誘導茄子花藥再生單倍體植株的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種誘導茄子花藥再生單倍體植株的方法，主要步驟如下：（1）選取合適時期的花藥低溫預處理；（2）外植體表面消毒，接種；（3）高溫黑暗處理；（4）光照培養(yǎng)，誘導愈傷組織產生；（5）愈傷組織培養(yǎng)增殖；（6）愈傷組織分化不定芽；（7）芽苗轉接、植株擴繁與繼代培養(yǎng)；8）無根小苗生根成為完整植株。本方法獲得愈傷組織的幾率高，愈傷組織分化頻率高，培養(yǎng)效果好。將本發(fā)明應用于茄子遺傳育種中，可以大大提高茄子花藥培養(yǎng)效率，豐富茄子優(yōu)良基因型個體，完善茄子單倍體育種途徑，縮短育種周期，為加快茄子及其它茄科作物遺傳育種和花藥離體培養(yǎng)研究提供技術和理論依據(jù)。
【專利說明】一種誘導茄子花藥再生單倍體植株的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物【技術領域】，具體涉及一種誘導茄子花藥再生單倍體植株的方法。
【背景技術】
[0002]爺子(Solanummelongena Linn),屬于爺科(Solanaceae)爺屬(2n=2x=24),起源于亞洲東南亞熱帶地區(qū)，是歐洲、亞洲和北美洲的重要蔬菜品種之一。它不僅具有較高的營養(yǎng)價值，且食用方法多樣，是一種可以干鮮結合、周年供應、經濟實惠的大宗蔬菜，深受廣大生產者和消費者的歡迎。中國是世界上最大的茄子生產國，因此，茄子的遺傳育種工作對于實際生產意義重大。
[0003]在茄子雜交育種工作中，自交系的選育是非常重要的工作，但往往存在選育周期長、選擇效率低等問題。單倍體育種可以大大提高后代選擇的效率，縮小育種群體規(guī)模，縮短育種年限，加快育種進程。
[0004]花藥離體培養(yǎng)是以花藥為外植體，通過無菌操作技術，接種在人工培養(yǎng)基上，誘導其分化出愈傷組織或胚狀體，隨后使愈傷組織分化成完整的植株。花藥培養(yǎng)不需要分離出花粉，程序比較簡化，因而是誘導人工單倍體的主要方法之一。
[0005]利用花藥培養(yǎng)可快速獲得純系和突變體，創(chuàng)新種質資源，對茄子遺傳育種及品種改良具有重要意義。70年代初，Riana等成功通過茄子花藥培養(yǎng)經愈傷組織途徑成苗。茄子不論是花藥還是花粉培養(yǎng)，都已有一些成功的報道。目前，有關茄子花藥培養(yǎng)的研究大多集中在如何提高愈傷組織和胚狀體的誘導頻率上.而對從愈傷組織誘導產生單倍體植株的研究則很少。許多愈傷組織不能正常的生長發(fā)育而只產生根，不分化芽，成苗率低。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有花藥培養(yǎng)技術中愈傷組織誘導率和分化率低，培養(yǎng)效果差的問題，是在于提供了一種誘導茄子花藥再生單倍體植株的方法，應用本方法獲得愈傷組織的幾率高，愈傷組織分化頻率高，培養(yǎng)效果好。將本發(fā)明花藥培養(yǎng)方法及配套培養(yǎng)基應用于茄子遺傳育種中，可以大大提高了茄子花藥培養(yǎng)效率，豐富了茄子優(yōu)良基因型個體，完善了茄子單倍體育種途徑，縮短了育種周期，為加快茄子遺傳育種和茄科作物花藥離體培養(yǎng)研究提供技術和理論依據(jù)。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案:
[0008]一種誘導茄子花藥再生單倍體植株的方法，其步驟是:
[0009]I)從茄子花期開始，于晴天上午9:00-10:00從健壯植株上選取發(fā)育正常，表面無損傷，經顯微鏡鏡檢小孢子處于單核中期至單核靠邊期的花蕾用于花藥培養(yǎng)，對應花蕾外部形態(tài)為花冠低于花萼裂基部至花冠高于花萼裂基部lmm-2mm，花藥為黃綠色；
[0010]2)將花蕾裝于自封袋內置于4°C -5°c冰箱預處理24h_72h ；
[0011]3)將花蕾外萼剝掉，再用75% (體積百分比)的酒精表面消毒28s_32s，之后用5%(質量百分比)的次氯酸鈉溶液消毒15min-20min，然后用無菌水沖洗3_4次；
[0012]4)在無菌濾紙上用鑷子剝取花藥，將花藥柄去除干凈，接種于裝有愈傷組織誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(90mm)中，每皿接種3-5個花蕾的花藥；
[0013]5)花藥接種后，置于35°C -37°C高溫黑暗條件下處理6d_7d ；
[0014]6)于光照強度15001x-20001x、光照時間12h_16h、溫度25°C _28°C下繼續(xù)培養(yǎng)，3周左右產生愈傷組織；
[0015]7)待愈傷組織長到直徑為時，切下并接種到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)增殖；
[0016]8)兩周后，選取大小一致，色澤新鮮，淡黃色，質地緊密的愈傷組織轉移至愈傷組織分化培養(yǎng)基上，誘導不定芽發(fā)生；
[0017]9)待芽苗長至lcm-3cm長時，切下無根小苗，轉接到植株擴繁與繼代培養(yǎng)基上，每30d擴繁繼代一次；
[0018]10)根據(jù)育種需求和外界環(huán)境條件，在移栽大田前I個月將無根小苗轉移至生根培養(yǎng)基上，誘導生根，再生出完整植株。
[0019]上述步驟4)、7)、8)、9)、10)中培養(yǎng)基的組分及配比如下:
[0020]愈傷組織誘導培養(yǎng)基:1^基本培養(yǎng)基，0.511^/12，4-0，1.011^/1KT，8mg/L VC,30.0g/L蔗糖，7.5g/L瓊脂，加水至1L，滅菌前調整培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0 ；
[0021]愈傷組織增殖培養(yǎng)基:MS基本培養(yǎng)基，30.0g/L蔗糖，7.5g/L瓊脂，加水至1L，滅菌前調整培養(yǎng)基的PH至5.8-6.0 ；
[0022]愈傷組織分化培養(yǎng)基:MS基本培養(yǎng)基，0.01mg/L NAA, 2.0mg/L ZT, 20.0g/L蔗糖，
7.5g/L瓊脂，加水至IL ;滅菌前調整培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0 ；
[0023]植株擴繁和繼代培養(yǎng)基:MS基本培養(yǎng)基，0.01mg/L NAA, 2.0mg/L6_BA，20.0g/L蔗糖，7.0g/L 瓊脂，加水至 1L，ρΗ5.8-6.0
[0024]生根培養(yǎng)基:1/2MS (MS基本培養(yǎng)基大量元素減半)，0.2mg/L IBA，30.0g/L蔗糖，
7.0g/L瓊脂，加水至IL ;滅菌前調整培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0。
[0025]所述的愈傷組織誘導培養(yǎng)基、愈傷組織增殖培養(yǎng)基、愈傷組織分化培養(yǎng)基、植株擴繁和繼代培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基均在121°C，0.1-0.15Mpa下高溫高壓滅菌15_20min。
[0026]為了便于對本發(fā)明的理解， 申請人:對上述各個步驟中所用的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中所用到的植物激素做如下定義:
[0027]培養(yǎng)基包括愈傷組織誘導培養(yǎng)基、愈傷組織增殖培養(yǎng)基、愈傷組織分化培養(yǎng)基、植株擴繁和繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。本發(fā)明所使用基本培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基(參見Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant, 1962, 15:473-497)。
[0028]本發(fā)明中，所述植物激素定義及簡稱如下:萘乙酸(NAA)、2，4_ 二氯苯氧乙酸(2、
4-D)、吲哚丁酸(IBA)，植物激素中的細胞分裂素包括激動素(KT)和玉米素(ZT)。
[0029]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點和積極效果:
[0030](I)本發(fā)明是建立在對茄子花藥培養(yǎng)影響因素包括取蕾時期、溫度處理和培養(yǎng)基配方等系統(tǒng)研究工作基礎上的，從試驗材料選擇、培養(yǎng)到植株移栽大田以及田間表現(xiàn)的觀察，比較全面系統(tǒng)地說明了茄子花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株的過程，方法簡便、易于操作。
[0031](2)與已有技術相比，本發(fā)明具有外植體不易褐化、愈傷組織誘導率和分化率高、培養(yǎng)效率高等優(yōu)點，愈傷組織誘導率最高可達89.71%，愈傷組織分化不定芽率可達70.00%以上，不定芽成苗率達75%以上。
[0032](3)與已有技術相比，本發(fā)明設計愈傷組織增殖和植株擴繁步驟，愈傷組織增殖和植株擴繁效果好，提高了茄子花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株的頻率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為本發(fā)明的一個實施例花藥培養(yǎng)選取花蕾的大小示意圖。
[0034]圖2為本發(fā)明的一個實施例剛接種的花藥示意圖。
[0035]圖3為本發(fā)明的一個實施例膨大的花藥示意圖。
[0036]圖4為本發(fā)明的一個實施例從花藥誘導產生的胚狀體直接再生植株示意圖。
[0037]圖5為本發(fā)明的一個實施例從茄子花藥誘導產生的愈傷組織示意圖。
[0038]圖6為本發(fā)明的一個實施例愈傷組織分化產生不定芽示意圖。
[0039]圖7為本發(fā)明的一個實施例一種不定芽再生出試管苗示意圖。
[0040]圖8為本發(fā)明的一個實施例試管苗生根示意圖。
[0041]圖9為本發(fā)明的一個實施例田間移栽成活的花培單倍體植株示意圖。
[0042]圖10為本發(fā)明的一個實施例供體二倍體植株和花培單倍體植株DNA流式分析圖。
`[0043]a供體二倍體植株DNA流式分析圖
[0044]b花培單倍體植株DNA流式分析圖
【具體實施方式】
[0045]實施例1:
[0046]—種誘導茄子花藥再生單倍體植株的方法，其步驟是:(試驗材料選擇、培養(yǎng)基設計與接種培養(yǎng))
[0047]1、試驗材料來源及其處理:
[0048]本發(fā)明的試驗材料選自茄子的花蕾，采自湖北省武漢市蔬菜科學研究所育種基地大棚，品種代號E83002，為日本雜交一代茄子品種。從茄子花期開始，于晴天上午9:00-10:00從健壯植株上取花蕾，選取發(fā)育正常，表面無損傷，經顯微鏡鏡檢小孢子處于單核靠邊期的花蕾用于花藥培養(yǎng)，對應花蕾外部形態(tài)為花冠低于花萼裂基部至花冠高于花萼裂基部(見圖1)，花藥為黃綠色；將花蕾裝于自封袋內置于5°C冰箱預處理 24h。
[0049]2、培養(yǎng)基制備及設計:
[0050]表I列出了本發(fā)明的最佳培養(yǎng)基組成成分及其用量。
[0051]表I本發(fā)明設計的茄子花藥培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基
【權利要求】
1.一種誘導茄子花藥再生單倍體植株的方法，其步驟是: .1)從茄子花蕾發(fā)育期開始，于晴天上午9:00-10:00從植株上選取發(fā)育正常，表面無損傷，經顯微鏡鏡檢小孢子處于單核中期至單核靠邊期的花蕾用于花藥培養(yǎng)，對應花蕾外部形態(tài)為花冠低于花萼裂基部1-2 mm至花冠高于花萼裂基部l_2mm，花藥為黃綠色； .2)將花蕾裝于自封袋內置于4-5°C冰箱預處理24-72 h； .3)將花蕾外萼剝掉，用75%體積百分比的酒精表面消毒28-32 S，之后用5%質量百分比的次氯酸鈉溶液消毒15 -20 min，然后用無菌水沖洗3_4次； .4)在無菌濾紙上用鑷子剝取花藥，將花藥柄去除干凈，接種于裝有愈傷組織誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每皿接種3-5個花蕾的花藥； .5)花藥接種后，置于35-37°C高溫黑暗條件下處理6-7 d ; .6)在光照強度1500-2000 lx、光照時間12 -16 h、溫度25-28 °C下繼續(xù)培養(yǎng)，3周產生愈傷組織； .7)待愈傷組織長到直徑為5-6 mm時，切下并接種到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)增殖； .8)兩周后，選取大小一致，色澤新鮮，淡黃色，質地緊密的愈傷組織轉移至愈傷組織分化培養(yǎng)基上，誘導不定芽發(fā)生； .9)待芽苗長至1-3 cm長時，切下無根小苗，轉接到植株擴繁與繼代培養(yǎng)基上，每30 d擴繁繼代一次； .10)根據(jù)育種需求和外界環(huán)境條件，在移栽大田前I個月將無根小苗轉移至生根培養(yǎng)基上，誘導生根，再生出完整植株。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種誘導茄子花藥再生單倍體植株的方法，其特征在于: 所述的愈傷組織誘導培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基，0.5 mg/L 2,4-D ,1.0 mg/L KT, 30.0g/L蔗糖，7.5 g/L瓊脂，加水至1L，滅菌前調整培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0 ； 所述的愈傷組織增殖培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基，30.0 g/L蔗糖，7.5 g/L瓊脂，加水至.1L,滅菌前調整培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0 ； 所述的愈傷組織分化培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基，0.01 mg/L NAA ,2.0 mg/L ZT, 20.0g/L蔗糖，7.5 g/L瓊脂，加水至1L，滅菌前調整培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0 ； 所述的植株擴繁和繼代培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基，0.01 mg/L NAA, 2.0 mg/L 6_BA，.20.0 g/L蔗糖，7.0 g/L瓊脂，加水至1L，滅菌前調整培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0 ； 所述的生根培養(yǎng)基為:1/2MS，0.2 mg/L ΙΒΑ，30.0 g/L蔗糖，7.0 g/L瓊脂，加水至1L，滅菌前調整培養(yǎng)基的PH至5.8-6.0。
【文檔編號】A01H4/00GK103444552SQ201310459357
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月28日 優(yōu)先權日:2013年9月28日
【發(fā)明者】王春麗, 談太明, 徐長城, 黃樹蘋, 談杰, 張敏, 陳霞 申請人:武漢市蔬菜科學研究所