一種千層塔水培繁殖及其石杉堿甲誘導(dǎo)提高的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種千層塔水培繁殖及其石杉堿甲誘導(dǎo)提高的方法。本發(fā)明以野生經(jīng)馴化的帶莖尖千層塔枝條為插穗，在含特定配比激素和前體物質(zhì)的營養(yǎng)液中，實現(xiàn)了千層塔的水培快速繁殖，與常規(guī)土壤扦插相比，生根時間短，繁殖系數(shù)大，生根率高達(dá)98%。前體物質(zhì)使水培千層塔較野生植株，石杉堿甲含量提高了70%；一定濃度誘導(dǎo)子對植株葉面或/和根部的噴灑處理，調(diào)節(jié)了千層塔的次生代謝系統(tǒng)，使水培千層塔石杉堿甲含量提高1.3-1.6倍，增加了石杉堿甲的產(chǎn)量，一定程度上緩解了千層塔資源短缺的現(xiàn)狀。并且其生產(chǎn)成本低，培養(yǎng)周期短，不受自然環(huán)境及氣候的制約，具有廣闊的應(yīng)用前景和較高的推廣價值。
【專利說明】一種千層塔水培繁殖及其石杉堿甲誘導(dǎo)提高的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥用植物繁殖及其次生代謝產(chǎn)物增產(chǎn)的方法，尤其涉及水培千層塔快繁與石杉堿甲含量的誘導(dǎo)提高。
【背景技術(shù)】
[0002]千層塔，又名蛇足石杉，為石杉屬珍貴藥用蕨類植物，其體內(nèi)含有的次生代謝產(chǎn)物一石杉堿甲被證明是一種高效、低毒、可逆和高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑。目前，國內(nèi)外已將石杉堿甲制劑列為治療老年癡呆癥的首選藥用于臨床與研究。
[0003]由于石杉堿甲本身特殊的分子結(jié)構(gòu)，其化學(xué)合成步驟繁瑣、成本高、活性低，不具備大規(guī)范商業(yè)化生產(chǎn)的價值。雖然人們對千層塔的近緣植物尋找、孢子繁殖、人工栽培、組織培養(yǎng)及內(nèi)生真菌發(fā)酵等替代資源方面進(jìn)行了有益探索，但收效甚少，基本上處于研發(fā)起步階段。因此，石杉堿甲制劑所需的原料完全依賴于千層塔自然資源提取，但千層塔植株石杉堿甲含量低，生長緩慢，再生周期長，野生資源十分有限，目前千層塔全國商業(yè)可采量已不足200噸。
[0004]近年來，隨著全球人口老齡化進(jìn)程的加速及老年癡呆人群的逐年遞增，國內(nèi)外對石杉堿甲資源的需求量日益增加 ，巨大的經(jīng)濟(jì)利益趨使各地?zé)o節(jié)制過度采挖，使得本來有限的野生資源越發(fā)匱乏，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足目前與未來潛在的醫(yī)療用藥需要，將使千層塔成為石杉堿甲制劑產(chǎn)業(yè)鏈的最大瓶頸。面對石杉堿甲市場供求矛盾的日益凸顯，能否找到一個在短期內(nèi)促使千層塔快速繁殖及其石杉堿甲含量增加的技術(shù)方法顯得至關(guān)重要。為此，
【發(fā)明者】對如何無土繁殖千層塔和提高千層塔中的石杉堿甲含量作了大量的研究工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的，在于針對現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種千層塔水培繁殖及其石杉堿甲誘導(dǎo)提高的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]一種千層塔水培繁殖及其石杉堿甲誘導(dǎo)提高的方法，包括以下步驟:
[0007](I)選取野生根系發(fā)達(dá)、生長狀態(tài)良好的2-5年生千層塔種苗，帶原生境土在溫室培養(yǎng)。
[0008](2)插穗制作與預(yù)處理:將溫室培養(yǎng)的種苗去土并用清水洗凈，預(yù)處理后從頂端處剪取4-5cm帶莖尖枝條作為插穗，將插穗定植后于水培容器中清水培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度800-12001ux，每天照光12-16h;溫度為22_25°C，濕度為80%_90% ；
[0009](3)插穗水培與誘導(dǎo)生根:將清水培養(yǎng)后插穗的在相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行生長營養(yǎng)液培養(yǎng)；在生長營養(yǎng)液中添加前體物質(zhì)和植物激素誘導(dǎo)生根繁殖；
[0010](4)誘導(dǎo)子的添加:當(dāng)插穗根系發(fā)育完全時，向水培千層塔葉面或/和根部噴灑誘導(dǎo)子，誘導(dǎo)提高石杉堿甲含量。
[0011]上述步驟(2)具體的操作是:將溫室培養(yǎng)的種苗去土并用清水洗凈，全株置于
0.05wt%高錳酸鉀溶液中消毒lOmin，然后用清水沖洗6遍。將洗好的種苗晾干明水，從頂端處剪取4-5cm帶莖尖的枝條作為插穗，切口剪成楔形，并去除基部多余葉片，用陶土粒將其固定于定植杯中，每孔定植一株，再將定植杯插入泡沫板的定植孔內(nèi)。泡沫板上加蓋一層不透明膜避光用，以防止激素失效和藻類滋生。
[0012]將清水倒入水培容器中，水培箱為長80cm，寬50cm，高8cm不透明塑料盒，一側(cè)面底端為進(jìn)液口，與儲液池內(nèi)潛水泵相連，另一側(cè)為出液口與儲液池相連，進(jìn)、出液口存在一定高度差，水培箱上方置1.0cm厚度的泡沫定植板，定植板上均勻打96個定植孔(孔徑3cm)，每孔下方置一定植杯，使用前依次用0.5% (w/v)的高錳酸鉀、75%的酒精對上述器皿消毒。儲液池與氣泵、臭氧發(fā)生器(以定期給儲液池中的液體消毒)亦相連。清水以浸沒插穗底端0.3-0.5cm為宜，通過水泵使水體循環(huán)流動。培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度800-12001uX，每天照光12-16h;溫度為22-25°C，濕度為80%_90%，清水每12小時更換一次，持續(xù)2_3天，清除阻礙生根物質(zhì)。
[0013]步驟(3)插穗水培與誘導(dǎo)生根具體是:于上述相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行營養(yǎng)液水培誘導(dǎo)生根，采用氣泵給營養(yǎng)液通氣，提高體系容氧量，縮短生根時間。所述水培營養(yǎng)液包含有 A 液=Na2-EDTA.2H20 7.46g/L ；FeS04.7H20 5.56g/L ；B 液=MgSO4.7H20 40_60g/L ；CaCl2.2H20 18-40g/L ;K2HP0435_65g/L ;NH4C145_55g/L ；C 液:K10.83g/L ；H3BO3 6.2g/L ；MnSO4.4H20 22.3g/L ；ZnSO4.7H20 8.6g/L ；Na2Mo04.2H200.25g/L ；CuSO4.5H20 0.025g/L ；CoCl2.6H20 0.025g/L ;溶劑均為水；按A液:B液:C液:水=5:1:1:993的比例混合配成水培營養(yǎng)液；且PH為5.2-5.4。在營養(yǎng)液中添加終濃度為80-400mg/L的L-賴氨酸，10mg/L的吲哚丁酸與0.lmg/L的萘乙酸，水培營養(yǎng)液每月更換一次。
[0014]培養(yǎng)40-45天左右，開始出現(xiàn)明顯生根情況，根較粗壯；培養(yǎng)60天后，苗高增長速率達(dá)0.8cm/月，鮮重增率0.2g/月，新葉形成數(shù)約3.7片/月；90天左右根系發(fā)展較為完全，生根率達(dá)98%，平均根長0.59cm，株平均生根量4.6，而且前體L-賴氨酸的作用使得石杉堿甲含量相對于野生苗提高了近70%。
[0015]誘導(dǎo)子的添加:當(dāng)插穗根系發(fā)育完全時，向水培千層塔葉面或根部噴灑誘導(dǎo)子，所述誘導(dǎo)子為水楊酸及其衍生物和硝酸鑭稀土化合物。噴灑誘導(dǎo)子一段時間植株石杉堿甲含量比未噴灑組明顯提高。于收獲前9-15天每天向千層塔葉面噴灑6-10mg/L的水楊酸或其衍生物，石杉堿甲含量提高92% ;于收獲前8-12天向植株根部噴灑2-5mg/L硝酸鑭稀土化合物，可使石杉堿甲含量增加約1.3倍；于收獲前10天將兩種誘導(dǎo)子共同作用于植物，可提聞石杉堿甲含量1.6倍左右。
[0016]石杉堿甲含量檢測:將收獲的植株洗凈，置于60°C烘箱烘至恒重，粉碎后精密稱取細(xì)粉2g于具塞三角瓶中，加入40mL、pH=3的鹽酸溶液，浸泡10h，用超聲波洗槽浸提45min,濾出酸液，再分別加入20mL鹽酸溶液重復(fù)提取3次，過濾，合并4次所得提取液并過濾2次；濾液加氨水調(diào)pH=10，加入等體積氯仿萃取3次，靜置IOmin待分層，重復(fù)3次，合并氯仿層并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加3mL甲醇溶解，過0.45 μ m微孔濾膜后進(jìn)行液相色譜分析。
[0017]色譜條件:C18柱(5 μ m, 150mm, 4.6mm,日本島津公司),檢測波長310nm,流動相為
0.0211101/1磷酸二氫鉀-乙腈溶液(90:10)，流速lmL/min，進(jìn)樣量10μ 1，柱溫40°C。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品采用外標(biāo)法，計算石杉堿甲的含量。
[0018]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明以野生經(jīng)馴化的帶莖尖千層塔枝條為插穗，在含特定配比激素和前體物質(zhì)的營養(yǎng)液中，既實現(xiàn)了千層塔的水培快速繁殖，又提高了石杉堿甲含量。與常規(guī)土壤扦插相比，生根時間短，繁殖系數(shù)大，生根率達(dá)到98%。前體物質(zhì)使水培千層塔較野生植株，石杉堿甲含量提高了 70%;通過一定濃度誘導(dǎo)子對植株葉面或/和根部的噴灑處理，調(diào)節(jié)千層塔的次生代謝系統(tǒng)，使水培千層塔石杉堿甲含量提高1.3-1.6倍，增加了石杉堿甲的產(chǎn)量，一定程度上緩解了千層塔資源短缺的現(xiàn)狀。并且其生產(chǎn)成本較低，培養(yǎng)周期短，不受自然環(huán)境以及氣候的制約，其應(yīng)用前景廣闊。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明實施例的石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖；
[0020]圖2是本發(fā)明實施 例的野生千層塔石杉堿甲高效液相色譜圖；
[0021]圖3是本發(fā)明實施例一的水培千層塔石杉堿甲高效液相色譜圖；
[0022]圖4是本發(fā)明實施例二的水培千層塔石杉堿甲高效液相色譜圖；
[0023]圖5是本發(fā)明實施例三的水培千層塔石杉堿甲高效液相色譜圖；
[0024]圖6是本發(fā)明實施例四的水培千層塔石杉堿甲高效液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明技術(shù)方案和有益效果。但不限于如下實施例。
[0026]實施例一:千層塔的水培繁殖
[0027]本實施例包括如下步驟。
[0028]①種苗選取:選取野生根系發(fā)達(dá)、葉片翠綠、生長狀態(tài)良好的2-5年千層塔種苗(湖南洪江雪峰山采挖)，帶原生境土在溫室培養(yǎng)一周。
[0029]②插穗制作與預(yù)處理:將溫室培養(yǎng)的種苗去土并用清水洗凈，全株置于0.05wt%高錳酸鉀溶液中消毒lOmin，然后用清水沖洗6遍。將洗好的種苗晾干明水，從頂端處剪取4-5cm帶莖尖的枝條作為插穗，切口剪成楔形，并去除基部多余葉片，用陶土粒將其固定于定植杯中，每孔定植一株，再將定植杯插入泡沫板的定植孔內(nèi)。泡沫板上加蓋一層不透明膜避光用，以防止激素失效和藻類滋生。
[0030]將清水倒入水培容器中，水培箱為長80cm，寬50cm，高8cm不透明塑料盒，一側(cè)面底端為進(jìn)液口，與儲液池內(nèi)潛水泵相連，另一側(cè)為出液口與儲液池相連，進(jìn)、出液口存在一定高度差，水培箱上方置1.0cm厚度的泡沫定植板，定植板上均勻打96個定植孔(孔徑3cm)，每孔下方置一定植杯，使用前依次用0.5% (w/v)的高錳酸鉀、75%的酒精對上述器皿消毒。儲液池與氣泵、臭氧發(fā)生器(以定期給儲液池中的液體消毒)亦相連。清水以浸沒插穗底端0.3-0.5cm為宜，通過水泵使水體循環(huán)流動。培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度800-12001uX，每天照光12-16h;溫度為22-25°C，濕度為80%_90%，清水每12小時更換一次，持續(xù)2_3天，清除阻礙生根物質(zhì)。
[0031]③插穗水培與誘導(dǎo)生根:于上述相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行營養(yǎng)液水培誘導(dǎo)生根，采用氣泵給營養(yǎng)液通氣，提高體系容氧量，縮短生根時間。所述水培營養(yǎng)液包含有A液:Na2-EDTA.2H20 7.46g/L ；FeS04.7Η205.56g/L ；B 液=MgSO4.7H20 50g/L ；CaCl2.2H2026.5g/L ；K2HP0450g/L ；NH4C150g/L ；C 液:K10.83g/L ；H3B036.2g/L ；MnSO4.4H20 22.3g/L ；ZnSO4.7H20 8.6g/L ；Na2Mo04.2H20 0.25g/L ；CuSO4.5H200.025g/L ；CoCl2.6H20 0.025g/L ;溶劑均為水；按A液:B液:C液:水=5:1:1:993的比例混合配成水培營養(yǎng)液；且pH為5.2-5.4。在營養(yǎng)液中添加終濃度為80-400mg/L的L-賴氨酸，10mg/L的吲哚丁酸與0.1mg/L的萘乙酸，水培營養(yǎng)液每月更換一次。
[0032]培養(yǎng)40-45天左右，開始出現(xiàn)明顯生根情況，根較粗壯；培養(yǎng)60天后，苗高增長速率達(dá)0.8cm/月，鮮重增率0.2g/月，新葉形成數(shù)約3.7片/月；90天左右根系發(fā)展較為完全，生根率達(dá)98%，平均根長0.59cm，株平均生根量4.6。
[0033]④石杉堿甲含量檢測:將野生千層塔與水培千層塔洗凈，分別于60°C烘箱烘至恒重，粉碎后精密稱取細(xì)粉2g于具塞三角瓶中，加入40mL、pH=3的鹽酸溶液，浸泡10h，用超聲波洗槽浸提45min，濾出酸液，再分別加入20mL鹽酸溶液重復(fù)提取3次，過濾，合并4次所得提取液并過濾2次；濾液加氨水調(diào)pH=10，加入等體積氯仿萃取3次，靜置IOmin待分層，重復(fù)3次，合并氯仿層并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加3mL甲醇溶解，過0.45 μ m微孔濾膜后進(jìn)行液相色譜分析。色譜條件:C18柱(5 μ m, 150mm,4.6mm,日本島津公司),檢測波長310nm,流動相為0.0211101/1磷酸二氫鉀-乙腈溶液(90:10)，流速lmL/min，進(jìn)樣量10μ 1，柱溫40°C。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品采用外標(biāo)法，計算石杉堿甲的含量，見圖1。
[0034]添加前體物質(zhì)L-賴氨酸的營養(yǎng)液對植株石杉堿甲含量有較顯著提高。經(jīng)HPLC分析，野生千層塔石杉堿甲含量約0.021%，見圖2 ;水培千層塔石杉堿甲含量達(dá)到0.036%，提高約70%，見圖3。
[0035]實施例二:石杉堿甲含量的誘導(dǎo)提高
[0036]當(dāng)實施例一中插穗根系發(fā)育完全時，選取70棵葉片翠綠、生長狀態(tài)良好植株，于收獲前15天每天向葉面噴灑8mg/L的水楊酸,培養(yǎng)及檢測方法同實施例一④⑤。該誘導(dǎo)子作用對植株的存活及其他生理功能無顯著影響。經(jīng)HPLC分析，水楊酸噴灑處理的水培植株中石杉堿甲含量達(dá)到0.040%，較未噴灑處理的石杉堿甲含量提高了 92%左右，見圖4。
[0037]實施例三:石杉堿甲含量的誘導(dǎo)提高
[0038]當(dāng)實施例一中插穗根系發(fā)育完全時，選取70棵葉片翠綠、生長狀態(tài)良好植株于檢測前10天每天向根部噴灑4mg/L硝酸鑭稀土化合物，培養(yǎng)及檢測方法同實施例一④⑤。硝酸鑭的處理對植株的存活及其他生理功能無顯著影響。經(jīng)HPLC分析，硝酸鑭噴灑過的水培植株中石杉堿甲含量達(dá)到0.048%,較未噴灑的石杉堿甲含量增加約1.3倍,見圖5。
[0039]實施例四:石杉堿甲含量的誘導(dǎo)提高
[0040]當(dāng)實施例一中插穗出現(xiàn)明顯發(fā)達(dá)根系時，選取70棵葉片翠綠、生長狀態(tài)良好植株，于檢測前10天將8mg/L的水楊酸和4mg/L硝酸鑭稀土化合物兩種誘導(dǎo)子，分別向千層塔葉面和根部噴灑，共同作用于植株，培養(yǎng)及檢測方法同實施例一④⑤。兩種誘導(dǎo)子同時處理對植株的存活及其他生理功能無顯著影響。經(jīng)HPLC分析，兩種誘導(dǎo)子共同處理的水培植株中石杉堿甲含量達(dá)到0.055%，較未處理植株石杉堿甲含量提高了 1.6倍左右，見圖6。
【權(quán)利要求】
1.一種千層塔水培繁殖及其石杉堿甲誘導(dǎo)提高的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)選取野生根系發(fā)達(dá)、生長狀態(tài)良好的2-5年生千層塔種苗，帶原生境土在溫室培養(yǎng)。 (2)插穗制作與預(yù)處理:將溫室培養(yǎng)的種苗去土并用清水洗凈，預(yù)處理后從頂端處剪取4-5cm帶莖尖枝條作為插穗； (3)插穗水培與誘導(dǎo)生根:將插穗定植后于水培容器中清水培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度800-12001UX，每天照光12-16h;溫度為22_25°C，濕度為80%_90% ;然后在相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行生長營養(yǎng)液培養(yǎng)；在生長營養(yǎng)液中添加前體物質(zhì)和植物激素誘導(dǎo)生根繁殖； (4)誘導(dǎo)子的添加:當(dāng)插穗根系發(fā)育完全時，向水培千層塔葉面或/和根部噴灑誘導(dǎo)子，誘導(dǎo)提高石杉堿甲含量。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在所述步驟(1)中，溫室培養(yǎng)為7-10天。
3.按權(quán)利要求1所 述的方法，其特征是在所述步驟(3)中，所用生長營養(yǎng)液配方為:
A 液=Na2-EDTA.2H20 7.46g/L ；FeS04.7H20 5.56g/L ；B 液=MgSO4.7H20 40_60g/L ；CaCl2.2H20 18-40g/L ;K2HP0435_65g/L ；NH4Cl 45_55g/L ；C 液:KI 0.83g/L ；H3BO3 6.2g/L ；MnSO4.4H20 22.3g/L ；ZnSO4.7H208.6g/L ；Na2Mo04.2H20 0.25g/L ；CuSO4.5H20 0.025g/L ；CoCl2.6H20 0.025g/L ;溶劑均為水；按 A 液:B 液:C 液:水=5-10:1-5:1-5:900-1500 的體積比混合配成生長營養(yǎng)液；生長營養(yǎng)液的PH為5.2-5.4。
4.按權(quán)利要求1所述的方法所述的方法，其特征是在所述步驟(3)中，生長營養(yǎng)液中添加前體物質(zhì)為L-賴氨酸,其濃度為80-400mg/L。
5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在所述步驟(3)中，培養(yǎng)液中添加的植物激素為的吲哚丁酸與的？萘乙酸，其濃度分別為5-10mg/L及0.1-0.5mg/L。
6.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在所述步驟(4)中，葉面噴灑誘導(dǎo)子為水楊酸或其衍生物。
7.按權(quán)利要求6所述的方法，其特征是在所述水楊酸或其衍生物濃度為4-20mg/L，于植株收獲前8-20天每天向千層塔葉面噴灑。
8.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在所述步驟(4)中，根部噴灑誘導(dǎo)子為硝酸鑭稀土化合物。
9.按權(quán)利要求8所述的方法，其特征是在所述硝酸鑭稀土化合物濃度為l-10mg/L，于植株收獲前5-15天每天向千層塔根部噴灑。
10.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在所述步驟(4)中于植株收獲前10天每天向千層塔葉面噴灑濃度為4-20mg/L水楊酸或其衍生物，并且向千層塔根部噴灑濃度為l-10mg/L硝酸鑭稀土化合物。
【文檔編號】A01G31/00GK103518599SQ201310463615
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月8日
【發(fā)明者】曹德華, 皮劍波, 唐愛銘, 伍耀先 申請人:長沙慧日生物技術(shù)有限公司