一種北美冬青的組織培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種北美冬青的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：1）從雌株選取外植體：2）外植體處理，包括消毒：3）芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：4）芽增殖培養(yǎng)：5）根誘導(dǎo)培養(yǎng)。該組織培養(yǎng)方法成活率高、繁殖速度快，增殖系數(shù)達(dá)到6.1，生根率達(dá)到95.2%，得到品質(zhì)純正的北美冬青雌株苗，本發(fā)明的方法不受季節(jié)限制，可常年、快速繁殖北美冬青，實(shí)現(xiàn)北美冬青的規(guī)?；a(chǎn)，為北美冬青快速推廣提供可行的方法。
【專利說明】一種北美冬青的組織培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說是一種適合北美冬青的組織培養(yǎng)方法.【背景技術(shù)】
[0002]北美冬青(Ilex verticillata)又名輪生冬青、美洲冬青，為冬青科冬青屬(Ilexlinn.)多年生灌木。原產(chǎn)美國東北部，為浙江省新引進(jìn)品種，引種栽培發(fā)現(xiàn)，該植物抗性強(qiáng)，適應(yīng)性廣，且冬季紅果經(jīng)久不落，是秋冬切枝、環(huán)境美化和盆栽的優(yōu)良觀賞樹種。
[0003]目前北美冬青僅采用播種和扦插繁殖。采用種子繁殖，其后代性狀分離很大，不能保持母本優(yōu)良性狀，且實(shí)生繁殖童期較長，開花結(jié)果時間較晚；采用扦插繁育，則成活率較低，嚴(yán)重影響了具有優(yōu)良性狀植株的繁育系數(shù)，繁育技術(shù)的不成熟成為北美冬青廣泛應(yīng)用的障礙，在一定程度上限制了其大面積推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種不受季節(jié)限制，可常年、快速繁殖北美冬青，實(shí)現(xiàn)北美冬青規(guī)?；a(chǎn)及廣泛應(yīng)用的組織培養(yǎng)方法。采用該方法繁殖北美冬青，增殖率可達(dá)6.1，生根率達(dá)95.2%，成功解決了北美冬青現(xiàn)有技術(shù)繁殖系數(shù)低的問題，
[0005] 北美冬青的組織培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟:
[0006]I)在晴天的上午，從北美冬青雌株苗中選取健康、觀賞性狀表現(xiàn)典型的植株作為外植體材料，該材料必須為生長健壯且葉片完整，整批材料均勻一致；
[0007]2)在超凈工作臺上，將清洗干凈的外植體截成2.5cm左右單芽莖段，依次用酒精溶液、升汞溶液浸泡消毒并沖洗處理；
[0008]3)外植體滅菌后用無菌刀切去莖段上下兩端0.2cm左右的死亡組織，將處理后的莖段按植物形態(tài)學(xué)下端插入配置好的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，該過程中死亡組織的去除是為了避免該組織影響其它健康組織，從而抑制芽的分化；
[0009]4)在莖段接入培養(yǎng)基15-25d后，腋芽萌發(fā)生長，并長出嫩莖，將嫩莖從腋芽基部切割，將長于0.5cm的嫩莖切割成至少含一個葉片的0.5cm左右的莖段，轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，該過程中嫩莖的切割必須遵循一葉一芽的原則，嫩莖多選取粗壯莖段，少選取細(xì)弱莖段，以利于后期的增殖培養(yǎng)；
[0010]5)莖段在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-30d后，莖段增殖形成不定芽，并抽生嫩莖，將莖段分化生長出的長度為2-3cm的嫩莖切下，接入生根培養(yǎng)基進(jìn)行根誘導(dǎo)培養(yǎng)，莖段分化生長出的嫩莖不可過長，過長將會影響根的誘導(dǎo)。
[0011]所述的采集的外植體為當(dāng)年生半木質(zhì)化的枝條，采集后剪除葉片，同時保留1.0cm左右的葉柄，自來水沖洗干凈后，洗潔精溶液浸泡5-10min，再用自來水沖洗l_2h備用。所述的外植體的消毒方法具體操作為:，先用濃度為70-75%的酒精，浸泡30-50s，經(jīng)無菌水沖洗3-5次后，再加入0.5-1%。升汞溶液，浸泡4-8min，并不斷晃動，最后用無菌水沖洗7-8次。[0012]所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的配方為WPM+0.5-1.5mg.L_16-BA+0.05-0.2mg.1ΝΑΑ+2-4%蔗糖+0.7%卡拉膠，用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH值，至培養(yǎng)基PH值為 5.4-5.8。
[0013]所述的增殖培養(yǎng)基配方為WPM+0.5-1.5mg.L_16-BA+0.05-0.2mg.L_1IBA+2-4% 蔗糖+0.7%卡拉膠，用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH值，至培養(yǎng)基PH值為5.4-5.8，其中培養(yǎng)室中培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照時間為12-14h/d，光強(qiáng)為1500-2000LX。
[0014]所述的生根培養(yǎng)基的配方為1/2WPM (大量元素減半)+0-0.2mg.'ΒΑ+Ο.1-0.3mg.1ΝΑΑ+2-4%蔗糖+0.7%卡拉膠+0.2g.L—1活性炭，用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH值，至培養(yǎng)基PH值為5.4-5.8:培養(yǎng)30-40d后形成健壯的生根苗。
[0015]所述的WPM培養(yǎng)基、1/2WPM培養(yǎng)基的成分均參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或文件。
[0016]所述的6-BA為6-芐基氨基嘌呤，IBA為吲哚丁酸，NAA為萘乙酸。
[0017]本發(fā)明中涉及的百分含量除另有說明外，均指質(zhì)量百分含量。
[0018]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0019]本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基針對性強(qiáng)、適用性好，外植體經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)腋芽生長速度快且枝條健壯，莖段經(jīng)增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)后增值系數(shù)大，可達(dá)6.1，經(jīng)生根培養(yǎng)基培養(yǎng)后生根快，根量多且粗壯，生根率達(dá)到95.2%。
[0020]本發(fā)明的方法成活率高、品質(zhì)純正，繁殖速度快，不受季節(jié)限制，可常年繁殖北美冬青，實(shí)現(xiàn)北美冬青的規(guī)?；a(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0021]現(xiàn)結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0022]實(shí)施例1:
[0023]2012年6月13日上午，從北美冬青雌株苗中選取健康、觀賞性狀表現(xiàn)典型的植株，采集當(dāng)年生半木質(zhì)化的枝條。采集后的剪除葉片，同時保留1.2cm的葉柄，自來水沖洗干凈，洗潔精溶液浸泡6min，再用自來水沖洗Ih備用；在超凈工作臺上，將清洗干凈的枝條剪截成2.5cm的單芽莖段，依次進(jìn)行消毒處理，用75%的酒精溶液浸泡30s，無菌水沖洗5次，1%。升汞溶液浸泡6min，并不斷晃動，使消毒完全，最后用菌水沖洗8次；接著用無菌刀切去莖段上下兩端0.2cm的死亡組織，將處理后的莖段植物形態(tài)學(xué)下端插入配置好的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中:誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的配方為WPM+1.0mg.U^-M+0.1mg.Ι^ΝΑΑ+〗。/。蔗糖+0.7%卡拉膠，用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH值，至培養(yǎng)基PH值為5.6 ;接種后進(jìn)入培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)室中培養(yǎng)溫度為25°C，光照時間為12h/d，光強(qiáng)為1500LX:30d后，腋芽萌發(fā)生長，并長出嫩莖，將嫩莖從腋芽基部切割下來，將長于0.5cm的嫩莖切割成至少含一個葉片的0.5
[0024]cm左右的莖段，轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基配方為WPM+1.0mg.L_16-BA+0.05mg.ΒΑ+βο/ο 蔗糖 +0.7% 卡拉膠，用 lmol/L 的 NaOH 或 HCl 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 PH 值，至培養(yǎng)基PH值為5.6 ;培養(yǎng)30d后，莖段增殖形成不定芽，并抽生出嫩莖，將莖段分化生長出的長度超過2cm的嫩莖切下，接入生根培養(yǎng)基培養(yǎng):生根培養(yǎng)基配方為1/2WPM(大量元素減半)+0.2mg'ΙΒΑ+Ο.3mg.L_1NAA+2% 蔗糖 +(λ 7% 卡拉膠 +(λ 2g.1 活性炭，
[0025]用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH[0026]值，至培養(yǎng)基PH值為5.8:40d后形成健壯的生根苗。
[0027]本實(shí)施例生根率達(dá)94.7%，平均生根條數(shù)達(dá)5.7，該方法不受季節(jié)限制，可常年、快速繁殖北美冬青，實(shí)現(xiàn)北美冬青的規(guī)?；a(chǎn)。
[0028]實(shí)施例2:
[0029]2013年5月14日上午，從北美冬青雌株苗中選取健康、觀賞性狀表現(xiàn)典型的植株，采集當(dāng)年生半木質(zhì)化的枝條。采集后剪除葉片，同時保留1.0cm的葉柄，自來水沖洗干凈，洗潔精溶液浸泡8min，再用自來水沖洗Ih備用；在超凈工作臺上，將清洗干凈的枝條剪截成2.2cm的單芽莖段，依次用75%的酒精溶液浸泡30s，倒掉酒精后，用無菌水沖洗5次，然后加入1%。升汞溶液浸泡6min，其間不斷晃動，倒掉升汞溶液后無菌水沖洗8次備用；接著用無菌刀切去莖段上下兩端0.25cm的死亡組織，將莖段植物形態(tài)學(xué)下端插入配置好的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)室中培養(yǎng)溫度為25°C，光照時間為12h/d，光強(qiáng)為1500LX:誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的配方為WPM+0.5mg.U^-M+0.1mg.1ΝΑΑ+2%蔗糖+0.7%卡拉膠，用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH值，至培養(yǎng)基PH值為5.6 ;培養(yǎng)30d后，腋芽萌發(fā)生長，并長出嫩莖，將嫩莖從腋芽基部切割下來，將長于0.5cm的嫩莖切割成至少含一個葉片的
0.5cm的莖段，轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基配方為WPM+1.0mg.^-ΒΑ+Ο.1mg.'?ΒΑ+βο/ο蔗糖+0.7%卡拉膠，用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH值，至培養(yǎng)基PH值為
5.6 ;30d后，莖段增殖形成不定芽，并抽生出嫩莖，將莖段分化生長出的長度超過2cm的嫩莖切下，接入生根培養(yǎng)基:生根培養(yǎng)基配方為1/2WPM(大量元素減半)+0.2mg.'?ΒΑ+Ο.3mg.1ΝΑΑ+2%蔗糖+0.7%卡拉膠+0.2g.L—1活性炭，用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH值，至培養(yǎng)基PH值為5.8止:培養(yǎng)40d后形成健壯的生根苗:其他步驟同實(shí)例I。
[0030]本實(shí)施例組織培養(yǎng)方法得到的北美冬青生根苗，成活率高、繁殖速度快，平均增殖系數(shù)達(dá)6.1，生根率達(dá)95.8%。
[0031]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳的實(shí)施例，并非對本發(fā)明做任何限制，凡是根據(jù)發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例的任何簡單修改、變更以及等效結(jié)構(gòu)變化，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種北美冬青的組織培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟: 1)在晴天的上午，從北美冬青雌株苗中選取健康、觀賞性狀表現(xiàn)典型的植株作為外植體材料； 2)在超凈工作臺上，將清洗干凈的外植體截成2.2-2.6cm單芽莖段，依次用酒精溶液、升汞溶液浸泡消毒并沖洗處理； 3)外植體滅菌后用無菌刀切去莖段上下兩端0.15-0.25cm的死亡組織，將處理后的莖段按植物形態(tài)學(xué)下端插入配置好的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)； 4)在莖段接入培養(yǎng)基15-25d后，腋芽萌發(fā)生長，并長出嫩莖，將嫩莖從腋芽基部切割，將長于0.5cm的嫩莖切割成至少含一個葉片的0.4-0.6cm的莖段，轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)； 5)莖段在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-30d后，莖段增殖形成不定芽，并抽生嫩莖，將莖段分化生長出的長度為2-3cm的嫩莖切下，接入生根培養(yǎng)基進(jìn)行根誘導(dǎo)培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的北美冬青的組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟I)中，采集的外植體為當(dāng)年生半木質(zhì)化的枝條，采集后剪除葉片，同時保留0.9-1.2cm的葉柄，自來水沖洗干凈后，洗潔精溶液浸泡5-10min，再用自來水沖洗l_2h備用。
3.如權(quán)利要求1所述的北美冬青的組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟2)中，外植體的消毒方法具體操作為:先用濃度為70-75%的酒精，浸泡30-50s，經(jīng)無菌水沖洗3_5次后，再加入0.5-1%。升汞溶液，浸泡4-8min，并不斷晃動，最后用無菌水沖洗7-8次。
4.如權(quán)利要求1所述的北美冬青的組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟3)中，所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的配方為 WPM+0.5 -1.5mg.L_16-BA+0.05-0.2mg.1^^4+2-4%蔗糖+0.7%卡拉膠，用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH值，至培養(yǎng)基PH值為5.4-5.8。
5.如權(quán)利要求1所述的北美冬青的組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟4)中，所述的增殖培養(yǎng)基配方為 WPM+0.5-1.5mg.L_16-BA+0.05-0.2mg.L_1IBA+2-4% 蔗糖 +0.7% 卡拉膠，用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH值，至培養(yǎng)基PH值為5.4-5.8，其中培養(yǎng)室中培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照時間為12-14h/d，光強(qiáng)為1500-2000LX。
6.如權(quán)利要求1所述的北美冬青的組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟5)中，所述的生根培養(yǎng)基的配方為 1/2WPM+0-0.2mg.L_1IBA+0.1-0.3mg.L_1NAA+2-4% 蔗糖 +0.7% 卡拉膠+0.2g.L-1活性炭，用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH值，至培養(yǎng)基PH值為5.4-5.8:培養(yǎng)30-40d后形成健壯的生根苗。
【文檔編號】A01H4/00GK103563745SQ201310476057
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】張俊林, 錢飛, 孫英坤 申請人:杭州市園林綠化股份有限公司