一種防治擬松材線蟲病的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種防治擬松材線蟲病的方法，該方法是將羅紅霉采用注射法注入松樹木質(zhì)部，每年春、秋各一次。本發(fā)明對擬松材線蟲病的防治效果顯著。
【專利說明】一種防治擬松材線蟲病的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物學領(lǐng)域，尤其涉及的是一種防治擬松材線蟲病的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來在我國的許多非松材線蟲疫區(qū)(重慶南山、福建邵武、四川等)的馬尾松發(fā)生大面積死亡，但是死樹中沒有發(fā)現(xiàn)松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus),而是大量擬松材線蟲(Bursaphelenchus mucronatus),確認了擬松材線蟲對松樹具有致病性,但它的致病機理目前還尚未有研究，其防治方法借簽松材線蟲病。
[0003]研究表明體表消毒后的擬松材線蟲單獨致病性很弱，而擬松材線蟲體表有大量附生微生物，這些微生物對馬尾松的致病作用，特別是擬松材線蟲體表攜帶的杓蘭果膠桿菌產(chǎn)生非蛋白液對馬尾松有強烈致病作用，杓蘭果膠桿菌和線蟲的共生是擬松材線蟲致病的必要因素，也是杓蘭果膠桿菌保持活力的必要條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種防治擬松材線蟲病的方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]一種防治擬松材線蟲病的方法，是采用注射法將羅紅霉素注入松樹，每年春、秋各一次。
`[0007]所述的方法，羅紅霉素濃度為50-100 μ g/ml。
[0008]所述的方法，在松樹1.3m高處注射羅紅霉素。
[0009]所述的方法，羅紅霉素注入深度達松樹木質(zhì)部。
[0010]所述的方法，每株松樹注入羅紅霉素100mL。
[0011]所述的方法，在松樹的東、南、西、北方向各注射25ml羅紅霉素。
[0012]本發(fā)明對擬松材線蟲病的防治效果顯著。
【具體實施方式】
[0013]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
[0014]1、擬松材線蟲的獲得與培養(yǎng)
[0015]取某地云南松瀕臨枯死樣木，利用貝爾曼漏斗分離法，分離得到線蟲，運用形態(tài)學和分子生物學相結(jié)合的方法進行鑒定。將線蟲接入生長有擬盤多毛孢(Pestalotiopsisheterocornis)的培養(yǎng)基中，25°C恒溫培養(yǎng),待該菌被吃光后，線蟲置于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0016]2、線蟲體表可培養(yǎng)微生物的分離、純化
[0017]對I中所得擬松材線蟲進行體表微生物的分離。線蟲用滴管吸I滴于玻片上，在顯微鏡下用移液器吸取單條線蟲，將5-10條線蟲置于凹玻片中用3%過氧化氫消毒Imin (除去腐生菌)，在顯微鏡下將線蟲用滅菌的去離子水清洗3次后用移液槍接于PDA培養(yǎng)基上，置于25°C培養(yǎng)。細菌菌落出現(xiàn)，用平板劃線分離法純化細菌。將純化的細菌移至NA (牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂粉15-20g，蒸餾水1000ml，pH7.0，混勻分裝后121°C高壓滅菌30min)斜面上于4°C保存。真菌菌落出現(xiàn)時，挑取不同的菌落轉(zhuǎn)接于PDA (土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000ml，混勻分裝后121°C高壓滅菌30min)平板純化。將純化的真菌移至PDA斜面上于4°C保存。
[0018]3、細菌16S RNA分類鑒定
[0019]3.1DNA 提取
[0020]利用TIANamp Bacteria DNA Kit細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取DNA。提取的DNA用1.5mLEP管置于-20°C保存。
[0021]3.2PCR 反應(yīng)
[0022]選取細菌通用引物I 和 2，引物 1:5’ -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，引物 2:5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3’，總 PCR 反應(yīng)體系共 50 μ L，其中模板 6 μ L，引物 4 μ L，2XTCP PCR master mix25 μ L，去離子水15 μ L。設(shè)空白對照。反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C 30s, 55°C lmin,72°C 2min，30 個循環(huán)，72°C延伸 IOmin0
[0023]3.3電泳檢測
[0024]取PCR產(chǎn)物5 μ L在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，180V, lh。凝膠成像系統(tǒng)觀察照相，檢測PCR產(chǎn)物大小。
[0025]3.4測序鑒定
[0026]將PCR產(chǎn)物直接送于天根生物檢測公司，進行純化，雙向測序。將所得序列通過與NCBI數(shù)據(jù)庫序列比對，構(gòu)建遺傳樹，鑒定細菌。
[0027]4、真菌ITS序列分析鑒定
[0028]4.1DNA 提取
[0029]菌絲長滿平板后，用TIANamp Plant DNA Kit植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取DNA。DNA置于-20°C保存。
[0030]4.2PCR 反應(yīng)
[0031]采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)通用引物。ITSl:5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ 和 ITS4:5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’?？?PCR 反應(yīng)體系共50 μ L，其中模板 2 μ L，引物 4 μ L，2 X TCP PCR master mix25yL，去離子水 19 μ L。設(shè)空白對照。反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C 30s, 55°C lmin，72°C 2min，30個循環(huán)，72°C延伸IOmin0
[0032]4.3測序鑒定
[0033]電泳檢測PCR產(chǎn)物后，將PCR產(chǎn)物直接送于英駿生物公司，進行純化，單向測序。將所得序列通過與NCBI序列比對，鑒定真菌。
[0034]通過分離純化鑒定，從擬松材線蟲體表共分離得到細菌26種，真菌4種，同一菌種由于基因型不同，命名為1、I1、III等，如枯草芽胞桿菌1、枯草芽胞桿菌I1、枯草芽胞桿菌II1、枯草芽胞桿菌IV、枯草芽胞桿菌V、枯草芽胞桿菌V1、枯草芽胞桿菌VII，詳見表1。
[0035]表1擬松材線蟲體表可培養(yǎng)微生物體系
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種防治擬松材線蟲病的方法，其特征是，采用注射法將羅紅霉素注入松樹，每年春、秋各一次。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，羅紅霉素濃度為50-100μ g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，在松樹1.3m高處注射羅紅霉素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，羅紅霉素注入深度達松樹木質(zhì)部。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，每株松樹注入羅紅霉素100mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是，在松樹的東、南、西、北方向各注射25ml羅紅霉素O
【文檔編號】A01G13/00GK103493811SQ201310493103
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月21日
【發(fā)明者】朱天輝, 朱涵明月, 李姝江, 張靜, 韓珊, 譙天敏, 張麗娜 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學