一種鐵皮石斛蘭離體培養(yǎng)再生植株的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鐵皮石斛蘭離體培養(yǎng)再生植株的方法，包括如下步驟：1)材料預(yù)處理，將鐵皮石斛蘭組培苗暗培養(yǎng)48h，獲得幼嫩莖尖。2)誘導(dǎo)愈傷組織，剝離莖尖接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。3)誘導(dǎo)不定芽，取生長良好的石解蘭愈傷組織，轉(zhuǎn)移到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到叢生不定芽。4)繼代培養(yǎng)，將叢生不定芽接種到繼代培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：25℃恒溫培養(yǎng)30天，每日光照培養(yǎng)16h，光照強度2000lx，暗培養(yǎng)8h。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種高效、安全的育種途徑。通過組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽并進行增殖培養(yǎng)，能夠解決石斛蘭的快速繁殖問題。
【專利說明】—種鐵皮石斛蘭罔體培養(yǎng)再生植株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物離體培養(yǎng)再生植株的方法，尤其涉及一種鐵皮石斛蘭離體培養(yǎng)再生植株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蘭花別名蘭、蘭草，屬被子植物門、單子葉植物綱，蘭科、蘭屬，是多年生的宿根性的常綠草本花卉。蘭科是一個十分進化的大家族，全世界共有800余屬3萬多種原生種，其中只有2000多種才具有觀賞價值，中國約有173個屬1200個種。自古以來，蘭花就是我國最著名的觀賞花木。其優(yōu)美俊逸的葉片，淡雅素潔的花朵，清遠奇絕的幽香，使之成為花中珍品而備受贊譽。
[0003]石斛蘭為蘭屬附生蘭類，株高30~100cm，根圓柱狀，呈線形，肉質(zhì)粗壯，多呈灰白色。在根組織內(nèi)和根際周圍生長著根菌。石斛蘭為復(fù)莖性洋蘭，具根狀莖和假鱗莖，每年從根狀莖上長出新芽，生長季節(jié)結(jié)束時成熟，假鱗莖細長條狀，基部較細中上部粗壯肥大，一般從基部3~4節(jié)開始變粗為長被針形、橢圓形至短圓形，肥厚革質(zhì)，有光澤花多為總狀花序，一個花芽可形成I~3個花梗，色豐富，有紅、白、黃、橙、綠、藍、復(fù)色等，花期長35~56d，有些有香味，花徑多為6~8cm，也有直IOcm以上的大花。依據(jù)花期可將常見石斛分為石斛和秋石斛兩類，春石斛多為落葉類，自然花在2~4月份，花序2~5個，著生在假鱗莖中上部各節(jié)處，開過花的節(jié)位第二年將不再形成花芽；石斛花期在秋季，花序只是在頂部及附近的節(jié)位出，多為常綠類，有時可連續(xù)數(shù)年開花。
[0004]隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們對蘭花的購買力增加，蘭花逐漸形成了一項產(chǎn)業(yè)，但由于蘭花種子細小，且需相關(guān)共生菌共同作用才能萌發(fā)生長，人工培育成苗率低，且分株繁殖周期長，繁殖率低，因此可以將優(yōu)良單株通過組織培養(yǎng)在短期內(nèi)大批量擴繁，獲得品質(zhì)優(yōu)良的群體。蘭花的組織培養(yǎng)始于20世紀60年代。Morel采用大花惠蘭的莖尖，在含有細胞分裂素的Kc培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，莖尖分生組織膨大形成原球莖，并分化出根和葉，首次獲得蘭花無病毒小植株，Wimber對Morel的方法進行了改進，采用液體振蕩培養(yǎng)的方法，大大加快了原球莖增殖的速度，短期內(nèi)可獲得大量再生植株。此后，組織培養(yǎng)技術(shù)在蘭花生產(chǎn)上得到了廣泛應(yīng)用，目前大約已有60余屬數(shù)百種蘭花可以用組織培養(yǎng)的方法進行繁殖。
[0005]組織培養(yǎng)已在蘭花生產(chǎn)中廣泛使用，并且不斷有改進的技術(shù)和新方法推出。直接以組織培養(yǎng)物替代使用原藥材或者生產(chǎn)活性成分也是解決石斛資源短缺的方法之一，但目前涉及到該方面的研究還很少。蘭花種子無菌萌發(fā)育苗技術(shù)使得蘭花品種間、種間及屬間的雜交育種成為可能。離體培養(yǎng)中高濃度的激素可誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生變異。試管開花技術(shù)如能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化組織再生的轉(zhuǎn)基因植株開花結(jié)實或提供獲利較高的花粉。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種高效、安全的育種途徑。通過組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽并進行增殖培養(yǎng)，以解決石斛蘭的快速繁殖問題。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種鐵皮石斛蘭離體培養(yǎng)再生植株的方法。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛蘭離體培養(yǎng)再生植株的方法，包括如下步驟:
[0008]I)、材料預(yù)處理
[0009]將鐵皮石斛蘭組培苗暗培養(yǎng)48h，獲得幼嫩莖尖；
[0010]2)、誘導(dǎo)愈傷組織
[0011]剝離莖尖接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，
[0012]愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:含2，4-Dl.0mg/L、GA31.0mg/L,6-BA3.5mg/L、蔗糖30g/L以及瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基；
[0013]3)、誘導(dǎo)不定芽
[0014]取生長良好的石解蘭愈傷組織，轉(zhuǎn)移到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到叢生不定芽，
[0015]不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:含瓊脂7g/L、蔗糖30g/L、椰汁100ml/L、2，4-D0.5-2.0mg/L 以及 NAA0.1-0.3mg/L 的 MS 培養(yǎng)基，調(diào)整 pH 至 6.2 ;
[0016]4)、繼代培養(yǎng)
[0017]將叢生不定芽接種到繼代培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:25°C恒溫培養(yǎng)30天，每日光照培養(yǎng)16h,光照強度20001x,暗培養(yǎng)8h,
[0018]繼代培養(yǎng)基組成為:添加6-BA1.0mg/L,NAA1.0mg/L、蔗糖30g/L以及瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基。
[0019]優(yōu)選地，所述步驟2)中，培養(yǎng)條件為:25°C恒溫培養(yǎng)30天，每日光照培養(yǎng)16h，光照強度20001x，暗培養(yǎng)8h。
[0020]優(yōu)選地，所述步驟3)中，培養(yǎng)條件為:25°C恒溫培養(yǎng)30天，每日光照培養(yǎng)16h，光照強度20001x，暗培養(yǎng)8h。
[0021]優(yōu)選地，所述步驟3)中，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:含瓊脂7g/L、蔗糖30g/L、椰汁100ml/L、2, 4-D1.0mg/L 以及 NAA0.3mg/L 的 MS 培養(yǎng)基，調(diào)整 pH 至 6.2。
[0022]更優(yōu)選地，所述步驟3)中，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:含瓊脂7g/L、蔗糖30g/L、椰汁 100ml/L、2, 4-D1.0mg/L 以及 NAA0.2mg/L 的 MS 培養(yǎng)基，調(diào)整 pH 至 6.2。
[0023]最優(yōu)選地，所述步驟3)中，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:含瓊脂7g/L、蔗糖30g/L、椰汁 100ml/L、2, 4-D0.5mg/L 以及 NAA0.2mg/L 的 MS 培養(yǎng)基，調(diào)整 pH 至 6.2。
[0024]2，4-D是蘭科植物愈傷組織誘導(dǎo)所必需的外源激素2，4-D在植物組織培養(yǎng)過程中主要起脫分化作用，它雖然可誘導(dǎo)愈傷組織并維持其胚性，但對愈傷組織的傷害作用較大。采用本發(fā)明的技術(shù)方案，愈傷生長狀況較好，分化能力不受影響，長勢快。蔗糖作為培養(yǎng)基的能源物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)劑，對愈傷組織的影響也有影響。當蔗糖濃度較底或較高時，誘導(dǎo)愈傷組織少而小，且生長緩慢；當蔗糖濃度為`3%時，誘導(dǎo)的愈傷組織快而多，且生長旺盛，增殖快。因此選擇蔗糖濃度為3%誘導(dǎo)愈傷組織的濃度。
【具體實施方式】
[0025]實施例1-9[0026]1)、材料預(yù)處理
[0027]將鐵皮石斛蘭組培苗暗培養(yǎng)48h，以便獲得幼嫩的莖尖。
[0028]2)、愈傷組織的誘導(dǎo)
[0029]剝離莖尖接種于添加2，4-D1.0mg/L、GA31.0mg/L,6-BA0.5mg/L、蔗糖 30g/L、瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基上，25°C恒溫培養(yǎng)30天，每日光照培養(yǎng)16h，光照強度20001x，暗培養(yǎng)8h，記錄相關(guān)實驗數(shù)據(jù)。
[0030]3)、不定芽的誘導(dǎo)
[0031]以MS為基本培養(yǎng)基，每升添加瓊脂7g、蔗糖30g、椰汁100ml，添加激素后，調(diào)整pH至6.2，取生長良好的石解蘭愈傷組織，分別轉(zhuǎn)移到含不同濃度激素的培養(yǎng)基中(不同處理激素配比如表1所示)，25°C恒溫培養(yǎng)30天，每日光照培養(yǎng)16h，光照強度20001X，暗培養(yǎng)8h，每隔一周觀察一次，并記錄相關(guān)實驗數(shù)據(jù)，據(jù)不定芽的分化率，選出最適的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。表1中編號Al到A9為實施例1到9中的不同的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方(僅激素2,4-D和NAA的含量及配比不同)，結(jié)果如表1所示，石解蘭愈傷組織在不同的培養(yǎng)基中都能誘導(dǎo)出不定芽。不同的培養(yǎng)基存在差異，其中含2，4-D0.5mg/L的A2對愈傷的分化率均高于其它八種培養(yǎng)基。不定芽誘導(dǎo)的數(shù)量最多，長勢良好。結(jié)果表明0.5mg/L2，4-D和0.2mg/LNA為最適不定芽培養(yǎng)基。
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一種鐵皮石斛蘭離體培養(yǎng)再生植株的方法，包括如下步驟: 1)、材料預(yù)處理 將鐵皮石斛蘭組培苗暗培養(yǎng)48h，獲得幼嫩莖尖； 2)、誘導(dǎo)愈傷組織 剝離莖尖接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)， 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:含2，4-Dl.0mg/L、GA31.0mg/L、6_BA0.5mg/L、蔗糖30g/L以及瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基； 3)、誘導(dǎo)不定芽 取生長良好的石解蘭愈傷組織，轉(zhuǎn)移到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到叢生不定芽， 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:含瓊脂7g/L、蔗糖30g/L、椰汁100ml/L、2，4-D0.5-2.0mg/L以及NAA0.1-0.3mg/L的MS培養(yǎng)基，調(diào)整pH至6.2 ; 4)、繼代培養(yǎng) 將叢生不定芽接種到繼代培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:25°C恒溫培養(yǎng)30天，每日光照培養(yǎng)16h,光照強度20001x,暗培養(yǎng)8h, 繼代培養(yǎng)基組成為:添加6-BA1.0mg/L、NAA1.0mg/L、蔗糖30g/L以及瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，`其中所述步驟2)中，培養(yǎng)條件為:25°C恒溫培養(yǎng)30天，每日光照培養(yǎng)16h,光照強度20001x,暗培養(yǎng)8h。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟3)中，培養(yǎng)條件為:25°C恒溫培養(yǎng)30天，每日光照培養(yǎng)16h,光照強度20001x,暗培養(yǎng)8h。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟3)中，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:含瓊脂7g/L、蔗糖 30g/L、椰汁 100ml/L、2，4-D1.0mg/L 以及 NAA0.3mg/L 的 MS 培養(yǎng)基，調(diào)整 pH 至6.2。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟3)中，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:含瓊脂7g/L、蔗糖 30g/L、椰汁 100ml/L、2，4-Dl.0mg/L 以及 NAA0.2mg/L 的 MS 培養(yǎng)基，調(diào)整 pH 至6.2。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟3)中，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:含瓊脂7g/L、蔗糖 30g/L、椰汁 100ml/L、2，4-D0.5mg/L 以及 NAA0.2mg/L 的 MS 培養(yǎng)基，調(diào)整 pH 至6.2。
【文檔編號】A01H4/00GK103583358SQ201310504177
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】朱麗娜, 陳己任, 陳仕貴 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)