一種皺紋盤(pán)鮑精優(yōu)質(zhì)精子誘導(dǎo)和采集方法
【專利摘要】本發(fā)明屬海洋生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地講是一種皺紋盤(pán)鮑優(yōu)質(zhì)精子的誘導(dǎo)和采集方法。包括：優(yōu)質(zhì)雄性親鮑的選擇,親鮑陰干刺激,臭氧海水的制備,收集、檢測(cè)精子的活力,受精率、孵化率的測(cè)定。該方法選擇性腺成熟飽滿的3-4齡雄性親鮑，陰干刺激，置于紫外線照射的海水中，放于安靜、黑暗環(huán)境，使之排精，采用離心收集高濃度的精子。將采集到的鮑魚(yú)精子進(jìn)行人工授精，受精率達(dá)到95%以上。證明采用這種精液收集方式所收集的鮑魚(yú)精液可應(yīng)用于生產(chǎn)時(shí)間和研究當(dāng)中。本發(fā)明的皺紋盤(pán)鮑優(yōu)質(zhì)精子的誘導(dǎo)和采集方法對(duì)于皺紋盤(pán)鮑的人工繁育、種質(zhì)保存及遺傳多樣性保護(hù)等方面有著重要意義。
【專利說(shuō)明】一種皺紋盤(pán)鮑精優(yōu)質(zhì)精子誘導(dǎo)和采集方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬海洋生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)是一種皺紋盤(pán)鮑精優(yōu)質(zhì)精子誘導(dǎo)和采集方法。
【背景技術(shù)】
[0002]皺紋盤(pán)鮑(Haliotis discushannai)屬于腹足綱,原始腹足目，鮑科。是藻類食性的海洋大型原始腹足類，我國(guó)北方海水養(yǎng)殖貝類的主要品種之一，其個(gè)體較大。鮑肉肥美，為海產(chǎn)中的珍品，多供應(yīng)高級(jí)賓館和出口。除鮮食外，可加工成罐頭或鮑魚(yú)干，售價(jià)昂貴。鮑貝殼即有名的中藥石決明，又是制作貝雕畫(huà)的重要材料，市場(chǎng)對(duì)皺紋盤(pán)鮑的需求較大。近年來(lái)，由于養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，加之皺紋盤(pán)鮑人工育苗的不斷擴(kuò)大，以及科研中大規(guī)模家系的構(gòu)建等，不論在生產(chǎn)中還是科研工作中對(duì)皺紋盤(pán)鮑優(yōu)質(zhì)精液的需求也不斷擴(kuò)大。由于皺紋盤(pán)鮑解剖取得的精子活力弱，無(wú)法進(jìn)行人工授精，另外皺紋盤(pán)鮑自然排放精液，時(shí)間不固定，不易控制，嚴(yán)重制約了皺紋盤(pán)鮑的養(yǎng)殖繁育。皺紋盤(pán)鮑優(yōu)質(zhì)精子的人工誘導(dǎo)和采集方法的建立可以在雄性皺紋盤(pán)鮑繁殖期隨時(shí)誘導(dǎo)促使其排精，并且對(duì)親鮑傷害小，可以多次利用，克服了親鮑排精時(shí)間不固定的缺點(diǎn)，有利于皺紋盤(pán)鮑的雜交、選育及基因多樣性的保護(hù)。同時(shí)獲得優(yōu)質(zhì)高濃度的鮮精是建立其精子超低溫冷凍保存方法的前提，建立皺紋盤(pán)鮑優(yōu)質(zhì)精子的誘導(dǎo)及采集方法為皺紋盤(pán)鮑精子冷凍保存奠定基礎(chǔ)。因此，建立皺紋盤(pán)鮑精液采集方法對(duì)海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展以及生物多樣性的保護(hù)具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種皺紋盤(pán)鮑精優(yōu)質(zhì)精子誘導(dǎo)和采集方法。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:`[0005]一種皺紋盤(pán)鮑精優(yōu)質(zhì)精子誘導(dǎo)和采集方法:
[0006]a.優(yōu)質(zhì)親鮑的選擇，選擇自然海區(qū)人工養(yǎng)殖的性腺飽滿并呈乳白、淡黃色雄性親鮑或?qū)⒂勺匀缓^(qū)人工養(yǎng)殖的雄性親鮑經(jīng)暫養(yǎng)性腺飽滿并呈乳白、淡黃色雄性親鮑；
[0007]b.親鮑陰干刺激，將雄性親鮑從暫養(yǎng)池中撈出，腹面朝上避光陰干刺激1.5-2小時(shí)；
[0008]c.將上述陰干刺激后的雄性親鮑置于經(jīng)紫外線照射過(guò)并升溫至20-21°C的海水中，于黑暗環(huán)境下刺激0.5-1小時(shí)，直至排精；
[0009]d.將上述收集的精子離心收集渾濁液，即得皺紋盤(pán)鮑精子。
[0010]所述步驟a)是于5-6月份，選擇自然海區(qū)人工養(yǎng)殖的翻轉(zhuǎn)觀察性腺飽滿、腫脹，呈現(xiàn)乳白、淡黃色的3-4齡雄性親鮑；或選擇自然海區(qū)人工養(yǎng)殖的3-4齡，選擇殼高12-15cm的雄性親鮑于18-19°C下，以每立方米水體20-25個(gè)的暫養(yǎng)密度進(jìn)行暫養(yǎng)，暫養(yǎng)3-7天，待雄性親鮑性腺飽滿、腫脹，呈現(xiàn)乳白、淡黃色并且雄鮑攝食、運(yùn)動(dòng)正常。
[0011]所述暫養(yǎng)時(shí)每天換水，并投喂海帶和/裙帶菜，平均每只雄鮑10-15g/天。
[0012]所述步驟b)將雄性親鮑從暫養(yǎng)池中撈出，腹面朝上放置，浸潤(rùn)擰至半干的毛巾，固定、避光陰干刺激1.5-2小時(shí)。
[0013]所述將新鮮海水在15W的紫外燈下照射至海水升溫至20_21°C，而后將陰干1.5-2h的雄性親鮑置于其中。
[0014]進(jìn)一步的說(shuō)，取50L新鮮海水用15W的紫外燈下照射2.5h，同時(shí)加熱棒將水溫由18-19°C升至20-21°C，而后將陰干1.5_2h的雄性親鮑置于其中。
[0015]所述步驟d將收集精子以3000-3500r/min的離心速度處理8_10分鐘，棄上清，收集底部渾濁液，即為高濃度的精液，精子密度:106-107，保存于0-4°C。
[0016]將上述收集到的精液經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)輔助分析(CASAS)運(yùn)動(dòng)率高于95%，平均曲線運(yùn)動(dòng)速度高于90.0 μ m/s,且精子曲線運(yùn)動(dòng)速度均高于50 μ m/s, 25%以上的精子曲線運(yùn)動(dòng)速度高于100 μ m/s。
[0017]所述皺紋盤(pán)鮑精液與誘導(dǎo)雌性親鮑的卵子的個(gè)數(shù)比為80-100: 1，混合后置于20°C的新鮮過(guò)濾海水中混合均勻，2h后取受精卵，檢測(cè)受精率；其中新鮮過(guò)濾海水的量為卵子的體積量的10-15倍。
[0018]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0019]1.本發(fā)明選擇性腺發(fā)育良好的成年雄性親鮑，通過(guò)簡(jiǎn)單的誘導(dǎo)即可獲得優(yōu)良的皺紋盤(pán)鮑精子；
[0020]2.通過(guò)本發(fā)明的誘導(dǎo)方式對(duì)親鮑傷害小，親鮑可以重復(fù)利用，降低了成本；
[0021]3.本發(fā)明優(yōu)質(zhì)精子誘導(dǎo)所需儀器、設(shè)備、簡(jiǎn)單，方便可行，易于操作；
[0022]4.本發(fā)明誘導(dǎo)采集方式不受地點(diǎn)限制，在皺紋盤(pán)鮑性成熟期間均可隨時(shí)隨地誘導(dǎo)排精，誘導(dǎo)排出的精子活力高，方便快捷；
[0023]5.通過(guò)該方法可以獲得高濃度、優(yōu)質(zhì)的皺紋盤(pán)鮑精子，方便進(jìn)行大規(guī)模人工授精、家系的構(gòu)建；
[0024]6.受:精的精子質(zhì)量好，人工授精的受:精率、鮮化率聞；
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1:
[0026]五月份正值皺紋盤(pán)鮑生殖期，與黃島膠南嶗東海珍養(yǎng)殖場(chǎng)取得3-4齡人工養(yǎng)殖的底播皺紋盤(pán)鮑，選擇殼高12-15cm，性腺飽滿、腫脹，呈現(xiàn)淡黃色的雄性親鮑進(jìn)行暫養(yǎng)；暫養(yǎng)溫度18-19°C，暫養(yǎng)密度每立方米水體20個(gè)，投喂海帶和/或裙帶菜，平均每只雄鮑10-15g/天，每天換水一次。并且暫養(yǎng)3-7天，至雄鮑攝食、運(yùn)動(dòng)正常，性腺乳白色、淡黃色并且飽滿。將雄性親鮑從暫養(yǎng)池中撈出，腹面朝上放于30CmX20Cm的塑料鏤空籃中，將用浸潤(rùn)并擰至半干的毛巾附于雄性親鮑上面，固定至不能隨便晃動(dòng)。而后放置于避光安靜的區(qū)域，陰干刺激1.5小時(shí)。
[0027]并將事先準(zhǔn)備好的經(jīng)15W的紫外燈下照射2.5h的50L新鮮海水，同時(shí)升溫2°C，SP水溫由18-19°C升為20-21 °C的海水中。
[0028]然后將陰干1.5h的雄性親鮑置于紫外線照射并升溫的海水中，于安靜、黑暗環(huán)境下誘導(dǎo)0.5小時(shí)，雄性鮑魚(yú)陸續(xù)排精。
[0029]收集排放的海水里面的精液以3000r/min離心10分鐘，收集底部渾濁精液。收集到的精液經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)輔助分析(CASAS)密度為2.6 X 107，運(yùn)動(dòng)率99%%%，平均曲線運(yùn)動(dòng)速度高于97.4.0 μ m/s,且精子曲線運(yùn)動(dòng)速度均高于50 μ m/s, 32%的精子曲線運(yùn)動(dòng)速度高于100 μ m/s0將誘導(dǎo)排出的雄性親鮑的精子與誘導(dǎo)雌性親鮑的卵子按精卵80-100: I的個(gè)數(shù)比混合，混合于20°C新鮮過(guò)濾海水，海水的量約是上述卵子體積的10-15倍。2h后隨機(jī)每次取100多個(gè)卵子，取三次，統(tǒng)計(jì)受精率，14h統(tǒng)計(jì)孵化率，隨機(jī)取幼蟲(chóng)每次100多個(gè)，取三次。其中受精率指開(kāi)始分裂的卵子的數(shù)量占總共卵子的數(shù)量的百分?jǐn)?shù)；孵化率指孵化至擔(dān)輪幼蟲(chóng)的胚胎數(shù)量占總受精卵的百分?jǐn)?shù)。上述收集到的鮑魚(yú)精子受精率達(dá)到98.5%, 97.8%,97.0%,平均 97.8% ;孵化率 95.4%, 90.5%, 94.0%,平均為 93.2%。
[0030]實(shí)施例2:
[0031]六月份在膠南水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)取得殼高9-12cm，性腺飽滿、腫脹，呈現(xiàn)淡黃色的雄性親鮑，從養(yǎng)殖池中撈出15只雄鮑，腹面朝上放于50cmX20cm的白色塑料泡沫盒中，將用紫外海水浸潤(rùn)擰至半干的毛巾附于雄性親鮑上面，使之不能隨便晃動(dòng)。放置于避光安靜的區(qū)域，陰干刺激1.5小時(shí)，取功率為15W紫外燈照射3h的50L新鮮海水，將陰干刺激1.5h的雄性親鮑置于紫外線照射過(guò)并升溫2°C，即20-21°C的海水中，放于安靜、黑暗環(huán)境刺激0.5小時(shí)，觀察到親鮑陸續(xù)排精。收集精液以3000r/min離心10分鐘，收集底部渾濁精液。收集到的精液經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)輔助分析(CASAS)，密度為5.6 X 106，運(yùn)動(dòng)率100%%%，平均曲線運(yùn)動(dòng)速度高于98.7 μ m/s,且精子曲線運(yùn)動(dòng)速度均高于50 μ m/s, 43%%的精子曲線運(yùn)動(dòng)速度高于100 μ m/s。將誘導(dǎo)排出的雄性親鮑的精子與誘導(dǎo)雌性親鮑的卵子按精卵個(gè)數(shù)80-100: I的比例混合(精子:卵子)，混合后加入至20°C新鮮過(guò)濾海水，海水的量約是卵子的量的10-15倍。2h后隨機(jī)每次取100多個(gè)卵子，取三次，統(tǒng)計(jì)受精率，14h統(tǒng)計(jì)孵化率，隨機(jī)取幼蟲(chóng)每次100多個(gè)，取三次。其中受精率指開(kāi)始分裂的卵子的數(shù)量占總共卵子的數(shù)量的百分?jǐn)?shù)；孵化率指孵化至擔(dān)輪幼蟲(chóng)的胚胎數(shù)量占總受精卵的百分?jǐn)?shù)。上述收集到的鮑魚(yú)精子受精率達(dá)到97.4%, 96.4%, 95.1%,平均 96`.3% ;孵化率 92.4%, 90.3%, 92.7%,平均為 91.8%。
【權(quán)利要求】
1.一種皺紋盤(pán)鮑精優(yōu)質(zhì)精子誘導(dǎo)和采集方法，其特征在于: a.優(yōu)質(zhì)親鮑的選擇，選擇自然海區(qū)人工養(yǎng)殖的性腺飽滿并呈乳白、淡黃色雄性親鮑或?qū)⒂勺匀缓^(qū)人工養(yǎng)殖的雄性親鮑經(jīng)暫養(yǎng)性腺飽滿并呈乳白、淡黃色雄性親鮑； b.親鮑陰干刺激，將雄性親鮑從暫養(yǎng)池中撈出，腹面朝上避光陰干刺激1.5-2小時(shí)； c.將上述陰干刺激后的雄性親鮑置于經(jīng)紫外線照射過(guò)并升溫至20-21°C的海水中，于黑暗環(huán)境下刺激0.5-1小時(shí)，直至排精； d.將上述收集的精子離心收集渾濁液，即得皺紋盤(pán)鮑精子。
2.按權(quán)利要求1所述的皺紋盤(pán)鮑精優(yōu)質(zhì)精子誘導(dǎo)和采集方法，其特征在于:所述步驟a)是于5-6月份，選擇自然海區(qū)人工養(yǎng)殖的翻轉(zhuǎn)觀察性腺飽滿、腫脹，呈現(xiàn)乳白、淡黃色的3-4齡雄性親鮑； 或選擇自然海區(qū)人工養(yǎng)殖的3-4齡，選擇殼高12-15cm的雄性親鮑于18_19°C下，以每立方米水體20-25個(gè)的暫養(yǎng)密度進(jìn)行暫養(yǎng)，暫養(yǎng)至性腺飽滿、腫脹，呈現(xiàn)乳白、淡黃色的3-4齡雄性親鮑。
3.按權(quán)利要求1或2所述的皺紋盤(pán)鮑精優(yōu)質(zhì)精子誘導(dǎo)和采集方法，其特征在于:所述暫養(yǎng)時(shí)每天換水，并投喂海帶和/裙帶菜，平均每只雄鮑10-15g/天。
4.按權(quán)利要求1所述的皺紋盤(pán)鮑精優(yōu)質(zhì)精子誘導(dǎo)和采集方法，其特征在于:所述步驟b)將雄性親鮑從暫養(yǎng)池中撈出，腹面朝上放置，浸潤(rùn)擰至半干的毛巾，固定、避光陰干刺激`1.5-2小時(shí)。
5.按權(quán)利要求4所述的皺紋盤(pán)鮑精優(yōu)質(zhì)精子誘導(dǎo)和采集方法，其特征在于:所述 將新鮮海水在15W的紫外燈下照射至海水升溫至20-21°C，而后將陰干1.5-2h的雄性親鮑置于其中。
6.按權(quán)利要求1所述的皺紋盤(pán)鮑精優(yōu)質(zhì)精子誘導(dǎo)和采集方法，其特征在于:所述步驟d將收集精子以3000-3500r/min的離心速度處理8_10分鐘，棄上清，收集底部渾濁精子，保存于0-4°C。
7.按權(quán)利要求1所述的皺紋盤(pán)鮑精優(yōu)質(zhì)精子誘導(dǎo)和采集方法，其特征在于:所述皺紋盤(pán)鮑精液與誘導(dǎo)雌性親鮑的卵子的個(gè)數(shù)比為80-100: 1，混合后置于20°C的新鮮過(guò)濾海水中混合均勻，2h后取受精卵，檢測(cè)受精率；其中新鮮過(guò)濾海水的量為卵子的體積量的10-15倍。
【文檔編號(hào)】A01K61/00GK103548730SQ201310517084
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】劉清華, 李軍, 韓龍江, 肖志忠, 孔寧 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所