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一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導(dǎo)方法

文檔序號(hào):221877閱讀:302來源:國知局
一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導(dǎo)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導(dǎo)方法,該方法是先將重樓根莖上未萌發(fā)的芽體進(jìn)行消毒和預(yù)培養(yǎng),然后將預(yù)培養(yǎng)后體積明顯膨大的芽體切去芽鞘,再將芽軸從中央進(jìn)行縱切后接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),接著將由芽軸產(chǎn)生的已愈傷化的組織進(jìn)行培養(yǎng)獲得重樓胚性組織,最后將胚性組織進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生白色圓球形的胚狀體。本發(fā)明為重樓優(yōu)良品種的培育和組培苗的大量快速繁殖提供了一條新途徑,可實(shí)現(xiàn)重樓植物短時(shí)間、低成本的大批量生產(chǎn)。
【專利說明】一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導(dǎo)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重樓植物的組織培養(yǎng)方法,特別是涉及一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導(dǎo)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中國藥典規(guī)定的中藥重樓為漠重樓(Paris polyphylla var.yunnanensis)和華重樓(Paris polyphylla var.chinensis)的地下莖,前者主產(chǎn)于云南,后者主產(chǎn)于四川?!渡褶r(nóng)本草經(jīng)》最早記載的蚤休即華重樓。重樓具有清熱解毒、消炎止痛、活血化淤、涼肝定驚的功效。
[0003]近年來因發(fā)現(xiàn)重樓具有抗病毒、抗腫瘤作用而需求量大增。重樓中藥材歷來以野生資源提供藥用,近年來由于對(duì)野生資源的過度采挖,致使野生重樓資源遭到了毀滅性的破壞,現(xiàn)己瀕臨滅絕,因而大力開發(fā)重樓植物資源具有十分重要的意義。
[0004]目前制約重樓植物規(guī)?;苑N的主要問題是重樓種苗的短缺。重樓種子由于存在種胚發(fā)育不完全,胚乳堅(jiān)硬,胚軸后熟等明顯“雙重休眠”特性,因此播種后通常需要經(jīng)歷兩冬一夏才能萌發(fā)成苗,是典型的“二年生種子”,而且在自然狀態(tài)下,即使經(jīng)過了長時(shí)間休目民,重樓種子的出苗率也不高,因此目前僅靠重樓種子進(jìn)行有性繁殖已無法滿足重樓植物大面積栽種的需要。
[0005]植株胚狀體是由構(gòu)成植物體的細(xì)胞在組織培養(yǎng)條件下,通過類似于受精卵形成的合子發(fā)育成胚的過程而形成的體細(xì)胞胚體。胚狀體具有植物胚的特性,在條件允許的情況下可快速生長為再生植株,可有效解決重樓種苗短缺的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導(dǎo)方法,該方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚狀體,在適當(dāng)?shù)臈l件下可快速生長為再生植株,從而可實(shí)現(xiàn)重樓再生植株的快速繁殖。
[0007]本發(fā)明提供的以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導(dǎo)方法包括下列步驟:
[0008](I)取重樓根莖上生長健壯、且未萌發(fā)的芽體,先用自來水沖洗干凈后陰干,然后進(jìn)行消毒處理,接著用無菌水震蕩洗滌后,用已滅菌的濾紙反復(fù)吸干芽體表面的水分,然后接種于預(yù)培養(yǎng)基MS+6-BA0.5~3.0mg.L-1+水楊酸20~80mg.L4中,在培養(yǎng)溫度為16~22°C、每天光照6~14小時(shí)、光照強(qiáng)度為1000~20001x的條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng);
[0009](2)選取預(yù)培養(yǎng)后體積明顯膨大的芽體,在超凈工作臺(tái)上先將芽鞘切去,然后將芽軸進(jìn)行縱切,將切開的芽軸的縱切面接入愈傷化誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA0.5~2.0mg.L、NAA0.5 ~2.0mg.L_1+2,4-Dl.0 ~4.0mg.L-1 中,在培養(yǎng)溫度為 12 ~26。。、每天光照4~16小時(shí)、光照強(qiáng)度為1000~20001x的條件下進(jìn)行培養(yǎng);
[0010](3)將由 芽軸產(chǎn)生的已愈傷化的組織切成I~3cm3的大小接入LS+6-BA0.5~
2.0mg.L-'+ΝΑΑΟ.5~4.0mg.L-1培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度為16~28°C、每天光照8~12小時(shí)、光照強(qiáng)度為1200~25001x的條件下進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)25~45天繼代一次,連續(xù)進(jìn)行2~4次繼代培養(yǎng),獲得重樓胚性組織;
[0011](4)將重樓胚性組織切成0.5~2.5cm3的大小接入LS+6-BA2.0~
4.0mg.+IAA0.5~2.0mg.L—1+頭孢噻肟鈉100~400mg.L—1培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度為5~10°C、每天光照2~6小時(shí)、光照強(qiáng)度為400~1000lx的條件下進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)50~70天后,在胚性組織表面產(chǎn)生白色圓球形的胚狀體。
[0012]上述所有培養(yǎng)基還包括瓊脂5.0~7.0g.L-1和蔗糖20~60g.?Λ培養(yǎng)基的pH值為5.6~6.5、
[0013]上述步驟(1)中所述消毒處理是指在超凈臺(tái)上先用濃度為70%~75%的酒精消毒10~60s,再用濃度為0.1%~0.15%的升汞消毒4~lOmin。
[0014]本發(fā)明首次提出了以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導(dǎo)方法,該方法在一定程度上解決了重樓植物大規(guī)模栽種時(shí)對(duì)種源需求的問題,為重樓優(yōu)良品種的培育和組培苗的大量快速繁殖提供了一條新途徑,可實(shí)現(xiàn)重樓短時(shí)間、低成本、大批量生產(chǎn)。
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1
[0017](I)預(yù)培養(yǎng):取重樓根莖上生長健壯、芽體直徑在0.5cm以上、且未萌發(fā)的芽體,先用自來水沖洗干凈后陰干,然后在超凈臺(tái)用濃度為70%的酒精消毒10s,再用濃度為0.1%的升汞消毒4min,接著用無菌水震蕩洗滌3次后,用已滅菌的濾紙反復(fù)吸干芽體表面的水分,然后接種于預(yù)培養(yǎng)基MS+6-BA0.5mg.I71+水楊酸20mg.L4中,在培養(yǎng)溫度為16°C、每天光照6小時(shí)、光照強(qiáng)度為lOOOlx的條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),培養(yǎng)20天統(tǒng)計(jì),芽體膨大率為78.93%,染菌率為20.23% ;
[0018](2)芽軸細(xì)胞愈傷化誘導(dǎo):選取預(yù)培養(yǎng)后體積明顯膨大的芽體,在超凈工作臺(tái)上先將芽鞘切去,然后將芽軸從中央進(jìn)行縱切,再將切開的芽軸的縱切面接入愈傷化誘導(dǎo)培養(yǎng)基 MS+6-BA0.5mg.I^+NAA0.5mg.^+2,4-01.0mg.L-1 中,在培養(yǎng)溫度為 12°C、每天光照 4小時(shí)、光照強(qiáng)度為lOOOlx的條件下培養(yǎng)50天,觀察并統(tǒng)計(jì)出有72.84%的芽軸產(chǎn)生了愈傷化;
[0019](3)胚性組織的產(chǎn)生:將由芽軸產(chǎn)生的已愈傷化的組織切成Icm3的大小接入LS+6-BA0.5mg.L-'+ΝΑΑΟ.5mg.L-1培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度為16°C、每天光照8小時(shí)、光照強(qiáng)度為12001x的條件下進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)25天繼代一次,連續(xù)進(jìn)行2次繼代培養(yǎng),有41.31%的培養(yǎng)材料產(chǎn)生了胚性組織;
[0020](4)胚狀體的產(chǎn)生:選取步驟(3)產(chǎn)生的淡黃白色、分裂能力強(qiáng)的重樓胚性組織,將其切成0.5cm3的大小后接入LS+6-BA2.0mg.L_1+IAA0.5mg.L-1+頭孢噻肟鈉IOOmg.L-1培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度為5°C、每天光照2小時(shí)、光照強(qiáng)度為4001x的條件下進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)55天后,有61.86%的胚性組織表面產(chǎn)生了白色圓球形的胚狀體;
[0021]上述所有培養(yǎng)基的pH值為5.6,瓊脂5.0g.L—1,蔗糖20g.L'
[0022]實(shí)施例2
[0023](I)預(yù)培養(yǎng):取重樓根莖上生長健壯、芽體直徑在0.5cm以上、且未萌發(fā)的芽體,先用自來水沖洗干凈后陰干,然后在超凈臺(tái)先用濃度為75%的酒精消毒40s,再用濃度為
0.1%的升汞消毒8min,接著用無菌水震蕩洗滌5次后,用已滅菌的濾紙反復(fù)吸干芽體表面的水分,然后接種于pH值為5.8的預(yù)培養(yǎng)基MS+6-BA2.0mg.L—1+水楊酸60mg.L—1+鹿糖^g-T1+瓊脂6.0g -T1中,在培養(yǎng)溫度為20°C、每天光照8小時(shí)、光照強(qiáng)度為15001x的條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),培養(yǎng)20天統(tǒng)計(jì),芽體膨大率為90.3%,染菌率為0% ;
[0024](2)芽軸細(xì)胞愈傷化誘導(dǎo):選取預(yù)培養(yǎng)后體積明顯膨大的芽體,在超凈工作臺(tái)上先將芽鞘切去,然后將芽軸從中央進(jìn)行縱切,再將切開的芽軸的縱切面接入PH值為5.8的愈傷化誘導(dǎo)培養(yǎng)基 MS+6-BA1.0mg.L_1+NAA1.0mg.L_1+2,4-D2.0mg.L-1+ 蔗糖 20g.L-1+ 瓊脂6.0g -L-1中,在培養(yǎng)溫度為20°C、每天光照8小時(shí)、光照強(qiáng)度為15001x的條件下培養(yǎng)60天,觀察并統(tǒng)計(jì)出有85%的芽軸產(chǎn)生了愈傷化; [0025](3)胚性組織的產(chǎn)生:將由芽軸產(chǎn)生的已愈傷化的組織切成2cm3的大小接入pH值為 6 的培養(yǎng)基 LS+6-BA1.0mg.L^+NAA2.0mg.L—1+ 蔗糖 30g.L—1+ 瓊脂 6.0g.L-1 中,在培養(yǎng)溫度為20°C、每天光照10小時(shí)、光照強(qiáng)度為20001x的條件下進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)30天繼代一次,連續(xù)進(jìn)行3次繼代培養(yǎng),經(jīng)顯微觀察,有67.8%的培養(yǎng)材料產(chǎn)生了胚性組織;
[0026](4)胚狀體的產(chǎn)生:選取步驟(3)產(chǎn)生的淡黃白色、分裂能力強(qiáng)的重樓胚性組織,將其切成2.0cm3的大小后接入pH值為6的培養(yǎng)基LS+6-BA3.0mg.L^+IAAl.0mg.L-1+頭孢噻肟鈉200mg.L-1+蔗糖30g.L-1+瓊脂6.0g.L-1中,在培養(yǎng)溫度為6~I (TC、每天光照4小時(shí)、光照強(qiáng)度為6001x的條件下進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)60天后,有87.6%的胚性組織表面產(chǎn)生了白色圓球形的胚狀體,平均每個(gè)胚性組織材料上產(chǎn)生4~8個(gè)胚狀體,經(jīng)顯微切片觀察,形成的胚狀體與母體組織的維管束不連接,有獨(dú)立的維管束系統(tǒng)。
[0027]實(shí)施例3
[0028](I)預(yù)培養(yǎng):取重樓根莖上生長健壯、芽體直徑在0.5cm以上、且未萌發(fā)的芽體,先用自來水沖洗干凈后陰干,然后在超凈臺(tái)用濃度為75%的酒精消毒60s,再用濃度為0.15%的升汞消毒8min,接著用無菌水震蕩洗滌6次后,用已滅菌的濾紙反復(fù)吸干芽體表面的水分,然后接種于預(yù)培養(yǎng)基MS+6-BA3.0mg.L—1+水楊酸80mg.L-1中,在培養(yǎng)溫度為22°C、每天光照14小時(shí)、光照強(qiáng)度為20001χ的條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),培養(yǎng)20天統(tǒng)計(jì),芽體膨大率為82.53%,染菌率為0% ;
[0029](2)芽軸細(xì)胞愈傷化誘導(dǎo):選取預(yù)培養(yǎng)后體積明顯膨大的芽體,在超凈工作臺(tái)上先將芽鞘切去,然后將芽軸從中央進(jìn)行縱切,再將切開的芽軸的縱切面接入愈傷化誘導(dǎo)培養(yǎng)基 MS+6-BA2.0mg.L_1+NAA2.0mg.1^+2,4-D4.0mg.L-1 中,在培養(yǎng)溫度為 26°C、每天光照 16小時(shí)、光照強(qiáng)度為20001x的條件下培養(yǎng)70天,觀察并統(tǒng)計(jì)出有83.54%的芽軸產(chǎn)生了愈傷化;
[0030](3)胚性組織的產(chǎn)生:將由芽軸產(chǎn)生的已愈傷化的組織切成3cm3的大小接入LS+6-BA2.0mg.-1+ΝΑΑ4.0mg -T1培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度為28°C、每天光照12小時(shí)、光照強(qiáng)度為25001x的條件下進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)45天繼代一次,連續(xù)進(jìn)行4次繼代培養(yǎng),有68.26%的培養(yǎng)材料產(chǎn)生了胚性組織;
[0031](4)胚狀體的產(chǎn)生:選取步驟(3)產(chǎn)生的淡黃白色、分裂能力強(qiáng)的重樓胚性組織,將其切成2.5cm3的大小后接入LS+6-BA4.0mg.L^+IAA2.0mg.L-1+頭孢噻肟鈉400mg.-1培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度為10°C、每天光照6小時(shí)、光照強(qiáng)度為lOOOlx的條件下進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)65天后,有84.15%的胚性組織表面產(chǎn)生了白色圓球形的胚狀體;
[0032]上述所有培養(yǎng)基的pH值為6.5,瓊脂7.0g.L-S蔗糖60g.L-1
[0033]實(shí)施例4
[0034]將實(shí)施例2步驟(1)中所述的預(yù)培養(yǎng)基改為pH值為6的MS+6-BA0.5mg.l-1+水楊酸30mg.L-1+蔗糖30g.L-1+瓊脂5.8g.L-1其它步驟同實(shí)施例2 ;培養(yǎng)20天后,芽體膨大率為81.13%。
[0035]實(shí)施例5
[0036]將實(shí)施例2步驟(2)中的芽軸愈傷化誘導(dǎo)培養(yǎng)基改為pH值為5.8的MS+6-BA2.0mg.L -1NAA0.5mg.L-1+2,4-D1.0mg.L-1+ 鹿糖 20g.L-1+ 瓊脂 6.0g.L -1 其它步驟同實(shí)施例2,培養(yǎng)60天后,觀察并統(tǒng)計(jì)出有77%的芽軸產(chǎn)生了愈傷化。
[0037]實(shí)施例6
[0038]將實(shí)施例2步驟(4)中的誘導(dǎo)重樓胚狀體產(chǎn)生的培養(yǎng)基改為pH值為6的LS+6-BA4.0mg.L-1+IAA1.0mg.L-1+ 頭抱噻月虧鈉 400mg.L-1+ 鹿糖 30g.L-1+ 瓊脂 6.0g.L-1,培養(yǎng)60天后,有85.53%的胚性組織表面產(chǎn)生出白色圓球形的胚狀體,平均每個(gè)胚性組織材料上產(chǎn)生5~8個(gè)胚狀體。
[0039]比較實(shí)施例1
[0040]將實(shí)施例2步驟(1)中的芽體改為采用已明顯萌發(fā)的芽體,其它步驟同實(shí)施例2 ;培養(yǎng)20天統(tǒng)計(jì),芽體膨大率40.39%,染菌率為61.71%;
[0041]比較實(shí)施例2
[0042]將實(shí)施例2步驟(1)中所述的預(yù)培養(yǎng)基改為pH值為5的B5+6-BA1.0mg.L-1+2,4-D1.5mg.L-1+ 蔗糖 20g.L-1+ 瓊脂 6g.L—1,其它步驟同實(shí)施例 2 ;培養(yǎng)20天統(tǒng)計(jì),芽體膨大率43.15%。
[0043]比較實(shí)施例3
[0044]在實(shí)施例2步驟(2)中,采用不切去膨大芽體上的芽鞘,而是將帶芽鞘的芽體縱切后接入培養(yǎng)基中,其它步驟同實(shí)施例2 ;培養(yǎng)60天統(tǒng)計(jì),僅有43.52%的芽軸培養(yǎng)材料產(chǎn)生了愈傷化。
[0045]比較實(shí)施例4
[0046]將實(shí)施例2步驟(2)中芽軸的切割方式改為橫切,即將芽軸切為上下兩部分后,再將橫切面接入培養(yǎng)基中,其它步驟同實(shí)施例2 ;培養(yǎng)60天觀察發(fā)現(xiàn),接入的芽軸上部分未出現(xiàn)愈傷化,而是表現(xiàn)為一定程度的抽苗;而接入的芽軸下部有35%產(chǎn)生了愈傷化;
[0047]比較實(shí)施例5
[0048]將實(shí)施例2步驟(3)中的胚性細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基改為pH值為6.5的MS+6-BA2.0mg.L-1+NAA1.0mg.L-1+ 蔗糖 30g.L-1+ 瓊脂 6.0g.L—1,其它步驟同實(shí)施例 2 ;培養(yǎng)后經(jīng)顯微觀察,只有23.18%的培養(yǎng)材料產(chǎn)生了胚性組織。
[0049]比較實(shí)施例6
[0050]將實(shí)施例2步驟(4)中的誘導(dǎo)重樓胚狀體產(chǎn)生的培養(yǎng)基改為pH值為5的1/2MS+6-BA1.0mg.L-1+ΙΑΑ2.0mg.L—1+ 蔗糖 30g.L—1+ 瓊脂 6.0g.L-1其它步驟同實(shí)施例 2 ;培養(yǎng) 60天后,有9.87%的胚性組織表面產(chǎn)生出白色圓球形的胚狀體,平均每個(gè)胚性組織材料上產(chǎn)生1~3個(gè)胚狀體。
【權(quán)利要求】
1.一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導(dǎo)方法,其特征在于包括如下步驟: (1)取重樓根莖上生長健壯、且未萌發(fā)的芽體,先用自來水沖洗干凈后陰干,然后進(jìn)行消毒處理,接著用無菌水震蕩洗滌后,用已滅菌的濾紙反復(fù)吸干芽體表面的水分,然后接種于預(yù)培養(yǎng)基MS+6-BA0.5~3.0mg ·L-1+水楊酸20~80mg *L_1中,在培養(yǎng)溫度為16~22°C、每天光照6~14小時(shí)、光照強(qiáng)度為1000~20001x的條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng); (2)選取預(yù)培養(yǎng)后體積明顯膨大的芽體,在超凈工作臺(tái)上先將芽鞘切去,然后將芽軸進(jìn)行縱切,將切開的芽軸的縱切面接入愈傷化誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA0.5~2.0mg.L、NAA0.5 ~2.0mg.L_1+2,4-Dl.0 ~4.0mg.L-1 中,在培養(yǎng)溫度為 12 ~26。。、每天光照4~16小時(shí)、光照強(qiáng)度為1000~20001x的條件下進(jìn)行培養(yǎng); (3)將由芽軸產(chǎn)生的已愈傷化的組織切成I~3cm3的大小接入LS+6-BA0.5~2.0mg.L-'+ΝΑΑΟ.5~4.0mg.L—1培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度為16~28°C、每天光照8~12小時(shí)、光照強(qiáng)度為1200~25001x的條件下進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)25~45天繼代一次,連續(xù)進(jìn)行2~4次繼代培養(yǎng),獲得重樓胚性組織; (4)將重樓胚性組織切成0.5~2.5cm3的大小接入LS+6-BA2.0~4.0mg ?L-'+ΙΑΑΟ.5~2.0mg *L-1+頭孢噻廂鈉100~400mg *L_1培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度為5~10°C、每天光照2~6小時(shí)、光照強(qiáng)度為400~lOOOlx的條件下進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)50~70天后,在胚性組織表面產(chǎn)生白色圓球形的胚狀體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導(dǎo)方法,其特征在于:步驟(1)中所述消毒處理是指在超凈臺(tái)上先用濃度為70%~75%的酒精消毒10~60s,再用濃度為0.1%~0.15%的升汞消毒4~lOmin。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103548683SQ201310529396
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】王躍華, 張玨, 王金鵬, 陳燕, 劉銀花, 宋超, 段茂華, 任鵬飛, 楊霞 申請(qǐng)人:成都大學(xué)
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