一種抗植物病毒的復(fù)配增效組合物及用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗植物病毒的復(fù)配增效組合物，具體涉及一種香椿樹皮提取物與寧南霉素的復(fù)配增效組合物，該組合物的有效成分是香椿樹皮提取物與寧南霉素，香椿提取物與寧南霉素的質(zhì)量分數(shù)之比為0.5～8:2，實驗表明香椿樹皮提取物與寧南霉素的復(fù)配物抗煙草花葉病毒活性優(yōu)于單劑的效果。本發(fā)明提供了抗病毒復(fù)配組合物之間的相互增效關(guān)系，這樣可以減少寧南霉素的用量，降低成本，同時可減緩植物病毒抗藥性的產(chǎn)生。
【專利說明】一種抗植物病毒的復(fù)配增效組合物及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗植物病毒的復(fù)配增效組合物，具體涉及一種香椿樹皮提取物與寧南霉素的復(fù)配增效組合物，屬于生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草花葉病毒{Tobacco mosaic virus, TMV)是一種普遍發(fā)生的植物病毒，可侵染65個科885多種植物，有寄主范圍廣、抗逆性強、生產(chǎn)危害大等特點，據(jù)報道，全世界每年僅由煙草花葉病毒病(TMV)項危害造成的經(jīng)濟損失約達I億多美元。由于植物病毒屬于絕對寄主，自身無能量代謝系統(tǒng)，對寄主植物細胞具有高度依賴性，對其防治目前還沒有非常有效的防治方法。已有研究表明，從植物中篩選抗病毒物質(zhì)是開發(fā)植物病毒抑制劑的重要途徑之一。
[0003]寧南霉素是一種胞嘧啶核苷肽型新抗生素，具有高效、低毒、無“三致”和無蓄積的廣譜殺菌劑，對水稻白葉枯病、小麥、蔬菜等白粉病及煙草花葉病毒具有明顯的防治和增產(chǎn)、增值效果。
[0004]香椿樹皮來源于楝科植物香椿(7bo/?a sinensis)的樹皮,香椿皮苦潘、涼,具有除熱、燥濕、止血、殺蟲等功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，香椿屬植物具有抗菌、抗癌、降血脂、降血糖、抗氧化等作用。2008年，本課題組對香椿在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用進行了研究，發(fā)現(xiàn)香椿粗提取物對煙草花葉病毒具有較好的抑制作用，并將粗提取物與寧南霉素以質(zhì)量比1:1進行復(fù)配，發(fā)現(xiàn)其對TMV的抑制活性有增強作用。很多植物中產(chǎn)生的抗病毒活性物質(zhì)具有環(huán)境兼容性好、安全和開發(fā)成本低等優(yōu)點，但是單一的植物活性成分藥效一般不能達到理想效果，將其與其他農(nóng)藥復(fù)配可以適當提高藥效，減少化學(xué)藥劑對人類和環(huán)境的危害，也可減緩植物病毒抗藥性的產(chǎn)生。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)中公開了復(fù)配增效組合物，包含香椿粗提取物與寧南霉素的制劑?？蓞⒁娚暾?zhí)?00810069089.1，該專利的全文引入本文作為參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在原有專利(一種抗植物病毒的藥物及配制方法，申請?zhí)?00810069089.1)香椿粗提取物與寧南霉素復(fù)配的基礎(chǔ)上，進一步對香椿粗提物進行分離提取，發(fā)現(xiàn)具有抗病毒活性較好的組分，開發(fā)了新的不同配比的組合物。
[0007]本發(fā)明通過活性跟蹤法對香椿抗病毒物質(zhì)進行分離，通過復(fù)配試驗，發(fā)現(xiàn)復(fù)配組合物能夠產(chǎn)生料想不到的增效效果。
[0008]本發(fā)明所述一種抗植物病毒的復(fù)配增效組合物，包括申請專利號200810069089.1所述的由香椿樹皮乙醇浸膏，加少量水，在超聲儀中分散，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，所得的各種萃取液，減壓濃縮得到相應(yīng)浸膏，其特征在于乙酸乙酯萃取浸膏或正丁醇萃取浸膏與寧南霉素復(fù)配，質(zhì)量比0.5~8:2時，抗植物病毒活性在相同濃度下高于單獨乙酸乙酯萃取浸膏或正丁醇萃取浸膏，質(zhì)量比為1:2時，高于寧南霉素；乙酸乙酯萃取浸膏經(jīng)柱層析分離，分離物Frl的抗植物病毒活性在相同濃度下比乙酸乙酯萃取浸膏大幅度提高，F(xiàn)rl與寧南霉素復(fù)配質(zhì)量配比1:1~4時，抗植物病毒活性在相同濃度下，高于單獨Frl或?qū)幠厦顾兀徽〈驾腿〗嘟?jīng)柱層析分離，分離物Frll、Frl3的抗植物病毒活性在相同濃度下比正丁醇萃取浸膏大幅度提高，F(xiàn)rl I或Fr 13與寧南霉素復(fù)配質(zhì)量配比1:1~3時，抗植物病毒活性在相同濃度下，高于單獨Frll、Frl3或?qū)幠厦顾亍?br> [0009]本發(fā)明所述的乙酸乙酯萃取浸膏柱層析分離物Frl是指將乙酸乙酯萃取浸膏用乙酸乙酯溶解，200~300目硅膠拌樣，用200~300目硅膠裝柱，進行柱層析分離，以石油醚/乙酸乙酯=1:1~10 (V: V)的洗脫液梯度洗脫，用TLC點板跟蹤，收集相同極性的洗脫液，得Frl到FrS 8個組分，F(xiàn)rl是第一份洗脫液減壓濃縮后得到的產(chǎn)物；所述的正丁醇萃取浸膏柱層析分離物Frll、Frl3是指將正丁醇浸膏用含10%甲醇的水溶液溶解，經(jīng)DlOl大孔吸附樹脂吸附，靜置過夜，然后用甲醇與水配制的洗脫劑:甲醇、80%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液、40%甲醇水溶液、20%甲醇水溶液及純水6種洗脫液進行梯度洗脫，以洗脫液的顏色接近無色為止，收集相同極性的洗脫液，得到6個組分Fr9到Frl4，其中Frll和Frl3是其第三組分和第五組分洗脫液減壓濃縮后得到的產(chǎn)物。
[0010]本發(fā)明所述的的一種抗植物病毒的組合物，其特征是組合物的原料為香椿樹皮乙醇浸膏的乙酸乙酯萃取浸膏、乙酸乙酯萃取浸膏的柱層析分離物Frl、香椿乙醇浸膏的正丁醇萃取浸膏、正丁醇萃取浸膏的柱層析分離物Frll和Frl3和寧南霉素，復(fù)配增效組合物的最佳質(zhì)量配比為:
乙酸乙酯萃取浸膏:寧南霉素等于1:2，
正丁醇萃取浸膏:寧南霉素等于1:2，
Frl:寧南霉素等于1:1，
Frll:寧南霉素等于1:2，
Frl3:寧南霉素等于1:1。
[0011]本發(fā)明該提供所述的抗病毒復(fù)配增效組合物在防治農(nóng)作物病害方面的應(yīng)用。
[0012]所述的農(nóng)作物包括煙草、蔬菜和禾谷類作物。
[0013]所述的農(nóng)作物病害包括煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、玉米條紋葉枯病毒和水稻矮縮病毒病。
[0014]本發(fā)明的方法具有以下突出的有益效果:
根據(jù)生物活性跟蹤法，我們對香椿樹皮抗植物病毒活性成分進行了有效提取，并制備了香椿樹皮提取物與寧南霉素的復(fù)配增效組合物。生物活性研究表明，本發(fā)明提供的復(fù)配增效組合物之間形成相互增效的關(guān)系，與單劑相比，藥效高，持效期長、減緩植物病毒抗藥性的產(chǎn)生，這樣施用降低了農(nóng)藥的用量，降低了成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1乙酸乙酯和正丁醇萃取物與寧南霉素的復(fù)配劑對TMV的治療活性
從圖1可以看出，香椿乙酸乙酯萃取浸膏或正丁醇萃取浸膏與寧南霉素按不同質(zhì)量分數(shù)比復(fù)配后對煙草花葉病毒具有明顯的增效作用，并且在復(fù)配比為1:2時，其增效作用最佳，抑制率高于寧南霉素。
[0016]圖2組分Frl、Frll和Frl3與寧南霉素的復(fù)配劑對TMV的治療活性從圖2得出，復(fù)配劑在0.5 mg/mL供試濃度下,組分Frl、組分Frll或組分Frl3分別與寧南霉素復(fù)配后，配比在1:1~1:4之間時，復(fù)配劑的抗TMV治療效果明顯增強。組分Frll在配比為1:2和1:4時，其對TMV的抑制活性優(yōu)于單劑，配比為1:2時，治療抑制率達到68.20%,增效作用最佳；組分Frl或組分Frl3在配比為1:1~1:2之間時，抗TMV活性明顯優(yōu)于單劑，配比為1:1時，其治療抑制率分別為:66.58%,74.23%，增效作用最佳。
【具體實施方式】
[0017]本發(fā)明通過活性跟蹤法對香椿抗病毒物質(zhì)進行分離，通過復(fù)配試驗，發(fā)現(xiàn)復(fù)配組合物能夠產(chǎn)生料想不到的增效效果。
[0018]本具體實施實例僅僅是對本發(fā)明的解釋，但不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域及時人員在閱讀完本說明書后可以根據(jù)需要對本實施實例做出沒有創(chuàng)造性貢獻的修改，但只要在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)的都受到專利法的保護。
[0019]實施實例一 香棒粗提物的制備:
稱取香椿樹皮10 kg粉碎并過40目篩后，用5倍量的95%乙醇做溶劑浸泡提取三次，每次7 d，合并三次濾液，減壓濃縮，干燥，得到乙醇粗提取物1.9 kg;乙醇粗提取物加入少量水，在超聲儀中分散，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取，直至萃取液為無色，并分別將萃取液減壓濃縮，分別得到約0.03 kg的香椿石油醚萃取浸膏、約0.06 kg的香椿氯仿萃取浸膏、約0.5 kg的香椿乙酸乙酯萃取浸膏、約0.6 kg的香椿正丁醇萃取浸膏，備用。
[0020]實施實例二
香椿抗病毒活性成分的制備:
生物活性跟蹤發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯萃取浸膏和正丁醇萃取浸膏對煙草花葉病毒的抑制活性較好，故采用柱層析對其進一步的分離。取乙酸乙酯萃取浸膏10 g，適量乙酸乙酯溶解，200~300目硅膠拌樣，用200~300目的硅膠200 g裝柱，進行柱層析分離，以石油醚/乙酸乙酯=1:1~10(V:V)為洗脫劑，用TLC點板跟蹤，收集相同極性的洗脫液，減壓濃縮，得8個組分Frl到Fr8 ;取正丁醇層萃取浸膏(10 g)，用適量的含10%甲醇的水溶液溶解，經(jīng)20 g DlOl大孔樹脂吸附,靜置過夜,用甲醇與水配制的水溶液:甲醇、80%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液、40%甲醇水溶液、20%甲醇水溶液、純水6種洗脫液進行梯度洗脫，以洗脫液的顏色接近無色為止，收集相同極性的洗脫液，得6個組分Fr9到Frl4。
[0021]實施實例三
香椿樹皮提取物與寧南霉素復(fù)配增效組合物的制備:
一種抗病毒復(fù)配農(nóng)藥，它是由香椿樹皮提取物與寧南霉素為有效成分復(fù)配而成的水劑，其中，供試的總濃度為0.5 mg/mL,復(fù)配組合物是以香椿樹皮提取物(香椿樹皮乙醇浸膏的乙酸乙酯萃取浸膏、乙酸乙酯萃取浸膏的柱層析分離物Frl、香椿樹皮乙醇浸膏的正丁醇萃取浸膏、正丁醇萃取浸膏的柱層析分離物Frll和Frl3)與寧南霉素按質(zhì)量分數(shù)比為4:1、2:1、1: 1、1:2、1:4進行復(fù)配，以含1%吐溫20的水溶液為溶劑。
[0022]實施實例四
香椿樹皮提取物及復(fù)配組合物的抗病毒室內(nèi)生物活性測定實驗方法:
I)活體治療試驗
采用半葉枯斑法測定。選著長勢一致的心葉煙，先用毛筆蘸取病毒汁液，在全葉摩擦接種病毒，30 min后,用清水沖洗掉金剛砂，待葉片干后，在左半葉涂抹藥劑，右半葉涂抹對應(yīng)劑量的溶劑作對照。隨后在光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，光照10000 Lux，控制溫度23± I°C，每株處理接種4~5片葉，實驗重復(fù)三次，2~3 d后觀察并記錄產(chǎn)生枯斑的數(shù)目，計算抑制率。
[0023]2)活體鈍化試驗
選著長勢一致的心葉煙，用磷酸緩沖溶液將TMV稀釋至6 X 10_3 mg/mL,將化合物與等體積的病毒液混合鈍化30 min，用毛筆人工摩擦接種于撒有金剛砂的適齡心葉煙左半葉，對應(yīng)的溶劑與病毒液混合接種于撒有金剛砂的適齡心葉煙右半葉。隨后在光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，光照10000 Lux，控制溫度23±1°C，每株處理接種4~5片葉，實驗重復(fù)三次，2~3 d后觀察并記錄產(chǎn)生枯斑的數(shù)目，計算抑制率。
【權(quán)利要求】
1.一種抗植物病毒的復(fù)配增效組合物，包括由香椿樹皮乙醇浸膏，加少量水，在超聲儀中分散，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，所得的各種萃取液，減壓濃縮得到相應(yīng)浸膏，其特征在于乙酸乙酯萃取浸膏或正丁醇萃取浸膏與寧南霉素復(fù)配，質(zhì)量比0.5~8:2時，抗植物病毒活性在相同濃度下高于單獨乙酸乙酯萃取浸膏或正丁醇萃取浸膏，質(zhì)量比為1:2時，高于寧南霉素；乙酸乙酯萃取浸膏經(jīng)柱層析分離，分離物Frl的抗植物病毒活性在相同濃度下比乙酸乙酯萃取浸膏大幅度提高，F(xiàn)rl與寧南霉素復(fù)配質(zhì)量配比1:1~4時，抗植物病毒活性在相同濃度下，高于單獨Frl或?qū)幠厦顾?；正丁醇萃取浸膏?jīng)柱層析分離，分離物Frll、Frl3的抗植物病毒活性在相同濃度下比正丁醇萃取浸膏大幅度提高，F(xiàn)rll或Frl3與寧南霉素復(fù)配質(zhì)量配比1:1~3時，抗植物病毒活性在相同濃度下，高于單獨Frll、Frl3或?qū)幠厦顾亍?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗植物病毒的復(fù)配增效組合物，其特征是所述的乙酸乙酯萃取浸膏柱層析分離物Frl是指將乙酸乙酯萃取浸膏用乙酸乙酯溶解，200~300目硅膠拌樣，用200~300目硅膠裝柱，進行柱層析分離，以石油醚/乙酸乙酯=1:1~10(V:V)的洗脫液梯度洗脫，用TLC點板跟蹤，收集相同極性的洗脫液，得Frl到FrS 8個組分，F(xiàn)rl是第一份洗脫液減壓濃縮后得到的產(chǎn)物；所述的正丁醇萃取浸膏柱層析分離物Frll、Frl3是指將正丁醇浸膏用含10%甲醇的水溶液溶解，經(jīng)DlOl大孔吸附樹脂吸附，靜置過夜，然后用甲醇與水配制的洗脫劑:甲醇、80%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液、40%甲醇水溶液、20%甲醇水溶液及純水6種洗脫液進行梯度洗脫，以洗脫液的顏色接近無色為止，收集相同極性的洗脫液，得到6個組分Fr9到Frl4，其中FrlI和Frl3是其第三組分和第五組分洗脫液減壓濃縮后得到的產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗植物病毒的組合物，其特征是組合物的原料為香椿樹皮乙醇浸膏的乙酸乙酯萃取浸膏、乙酸乙酯萃取浸膏的柱層析分離物Frl、香椿樹皮乙醇浸膏的正丁醇萃取浸膏、正丁醇萃取浸膏的柱層析分離物Frll和Frl3和寧南霉素，復(fù)配增效組合物的最佳質(zhì)量配比為: 乙酸乙酯萃取浸膏:寧南霉素等于1:2，` 正丁醇萃取浸膏:寧南霉素等于1:2， Frl:寧南霉素等于1:1， Frll:寧南霉素等于1:2， Frl3:寧南霉素等于1:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的抗病毒增效組合物在防止農(nóng)作物病害中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于農(nóng)作物包括煙草、蔬菜和禾谷類作物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的農(nóng)作物病害包括煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、玉米條紋葉枯病毒和水稻矮縮病毒病。
【文檔編號】A01N65/26GK103548892SQ201310563296
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月14日
【發(fā)明者】薛偉, 趙洪菊, 張賢, 王忠波, 楊勝杰, 龔華玉, 夏麗娟, 陳玉, 柳敏, 朱雪松 申請人:貴州大學(xué)