一種翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及了一種翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法及其應(yīng)用。該翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法包括如下步驟：取翹嘴鱖精液稀釋后置于紫外線下照射，使精子遺傳失活；失活的精子與卵子混合受精，啟動卵子雌核發(fā)育；卵子受精后轉(zhuǎn)移到淡水中進行熱體克處理，使染色體組加倍，產(chǎn)生雌核發(fā)育二倍體；將翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體卵轉(zhuǎn)入淡水中，室溫孵化，按普通翹嘴鱖苗培育方法管理，即得翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體魚苗。本方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的翹嘴鱖后代只含雌性親本的基因，可加速優(yōu)良基因純合化，使優(yōu)良的遺傳性狀得以迅速固定，在翹嘴鱖遺傳分析和育種上具有廣闊的應(yīng)用前景；且該翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)方法條件易得、便于控制，具有很大的生產(chǎn)實踐推廣價值。
【專利說明】一種翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法及其應(yīng)用
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于魚類遺傳育種領(lǐng)域，涉及一種魚類雌核發(fā)育方法。更具體地，涉及一種翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]翹嘴鱖隸屬鱸形目，鯧科，鱖屬。其肉質(zhì)細(xì)嫩、厚實、少刺，營養(yǎng)豐富，味道鮮美，在我國已經(jīng)成為經(jīng)濟價值很高、市場需求量很大的名特水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。然而，我國鱖魚養(yǎng)殖產(chǎn)量的提高主要是依靠擴大養(yǎng)殖面積，增加養(yǎng)殖密度來實現(xiàn)的，而鱖魚育苗親魚多數(shù)采用自繁、自養(yǎng)、自留或從市場購買的活魚中選留培育。由于養(yǎng)殖群體遺傳結(jié)構(gòu)單一，經(jīng)過長期的近交繁殖后，種質(zhì)退化現(xiàn)象嚴(yán)重，致使翹嘴鱖生長速度減慢，病害嚴(yán)重，影響翹嘴鱖養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益。種質(zhì)問題己成為當(dāng)前翹嘴鱖養(yǎng)殖生產(chǎn)的主要問題之一。然而傳統(tǒng)的育種模式基因純合速度慢，育種周期長，不符合翹嘴鱖養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的迫切需要，因此有必要開展可加速育種進程的人工雌核發(fā)育技術(shù)研究。
[0004]雌核發(fā)育是單性生殖的一種，指卵子依靠自身的遺傳物質(zhì)發(fā)育成個體的生殖行為。人工雌核發(fā)育在魚類育種中主要應(yīng)用于兩個方面，一是加速魚類優(yōu)良基因純合化，使優(yōu)良的遺傳性狀得以迅速固定，從而實現(xiàn)快速育種，縮短育種周期。主要是通過人工雌核發(fā)育誘導(dǎo)出具有優(yōu)良性狀的后代后，再進行大規(guī)模擴繁，這對雌核發(fā)育二倍體孵化率的要求并不高。目前已應(yīng)用在草魚優(yōu)良生長性狀品系選育，白鰱抗逆性狀品系選育等方面，實踐證明一次雌核發(fā)育相當(dāng)于6~8次的近親交配，可大大提高遺傳純度。連續(xù)兩代的雌核發(fā)育就可以形成基因高度純合的群體。二是在某些雌雄個體生長差異較大、雌性比雄性生長快的魚類中，通過人工雌核發(fā)育誘導(dǎo)出全雌種苗，直接進行養(yǎng)殖，為提高經(jīng)濟效益需要較高的雌核發(fā)育二倍體孵化率，如牙鲆、半滑舌鰨等魚類的全雌育種。
[0005]縱觀國內(nèi)外魚類人工雌核發(fā)育的研究現(xiàn)狀，使卵子染色體二倍化的方法最常用的是溫度休克法。溫度休克法是一種使卵子染色體二倍化的最簡便、最有效和最常用的方法，冷休克法是目前最常用的溫度休克法。溫度休克法誘導(dǎo)卵子染色體二倍體化需要穩(wěn)定的熱源或者冷源。現(xiàn)有熱源的獲得方式主要有兩種，一是通過恒溫水浴設(shè)備，二是通過熱水調(diào)節(jié)水溫；冷源的獲得同樣有兩種方式，一是通過低溫恒溫設(shè)備，二是通過冰塊等調(diào)節(jié)水溫。
[0006]熱休克法相比冷休克法具有以下優(yōu)勢:(I)熱源的獲得成本要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于冷源的獲得成本，相比熱源獲得所需要的恒溫水浴設(shè)備，低溫恒溫設(shè)備的價格是其的3飛倍；如果不使用專門的設(shè)備，而是采用熱水或冰塊調(diào)節(jié)水溫的話，溫度休克時需要大量的熱水或者冰塊，冰塊的獲得需要專門的制冰設(shè)備或者大量購買，而熱水只需要使用常用的加熱裝置便可獲得。(2)熱休克法相比冷休克法更易實現(xiàn)應(yīng)用，不管用上述哪種方式獲得熱源和冷源，如果不考慮成本，在一些條件便利的地區(qū)實現(xiàn)應(yīng)用的問題不大，而在某些條件簡陋、交通不便的地方則難以獲得大量的冷源，因此在這些地方熱休克法更易實現(xiàn)應(yīng)用。(3)熱休克法比冷休克法處理更為快捷、控制更加容易。熱休克法誘導(dǎo)卵子染色體二倍體化只需處理2~3min，而冷休克法誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育處理時間一般需要l(T60min。因此在大批量誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育時，熱休克法更為快捷。而且由于冷休克法處理的時間更長，維持冷休克所需穩(wěn)定的處理溫度更加困難。
[0007]熱休克法具有成本低、易于推廣應(yīng)用、處理更為快捷、控制更加容易的優(yōu)勢，但是通過熱休克法誘導(dǎo)雌核發(fā)育二倍體的方法并不適用于所有魚類，如大黃魚、團頭魴以及大部分鲆鰈類均是利用冷休克法誘導(dǎo)人工雌核發(fā)育，而熱休克法未見報道。
[0008]目前，本領(lǐng)域人員公識認(rèn)為，對翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)均是采用冷休克法。但是，冷休克法誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育的最適溫度一般為0°c~4°C，而翹嘴鱖繁殖期主要集中在6月I月，這時繁殖水溫較高，使用冷休克法誘導(dǎo)翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體所需最適水溫條件在生產(chǎn)中難以獲得；并且在冷休克時調(diào)節(jié)水溫需要專門的制冷儀器等，所需成本高，很難在生產(chǎn)實踐中大規(guī)模推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有翹嘴鱖傳統(tǒng)育種模式基因純合速度慢、育種周期長以及條件不易控制、難以大規(guī)模推廣等技術(shù)不足，提供一種翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法。
[0010]本發(fā)明另一目的是提供上述方法在翹嘴鱖育種方面的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
一種翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法，包括如下步驟:
51.翹嘴鱖精子的遺傳失活:取新鮮翹嘴鱖精液，按1:4-1:40的比例經(jīng)Hanks液稀釋后用紫外線照射，紫外線照射劑量為80 mJ/cnT640 mj/cm2 ；
52.卵子雌核發(fā)育的啟動:將SI得到的遺傳失活的翹嘴鱖精子與翹嘴鱖成熟卵子混合受精；
53.卵子單倍體染色體組加倍:卵子經(jīng)S2步驟受精后，轉(zhuǎn)移到淡水中進行熱休克處理，得到二倍體卵；
54.將S3得到的二倍體卵轉(zhuǎn)入淡水中，室溫孵化，按普通翹嘴鱖苗培育方法管理，得到翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體魚苗；
步驟S3所述熱休克處理溫度為41 °C，熱休克處理的起始時間是在卵子受精后2min~IOmin,熱休克持續(xù)時間Imin~2.5min。
[0012]優(yōu)選地,步驟SI所述經(jīng)Hanks液稀釋是按1:8的比例經(jīng)Hanks液稀釋。
[0013]優(yōu)選地，步驟SI所述紫外線照射劑量為640 mj/cm2。
[0014]優(yōu)選地，步驟S2所述的混合是在25°C~27°C的溫度條件下進行的。
[0015]優(yōu)選地,步驟S3所述熱休克的起始時間是在卵子受精后4min。
[0016]優(yōu)選地，步驟S3所述熱休克的熱休克持續(xù)時間2min。
[0017]本發(fā)明還提供所述翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法在翹嘴鱖育種方面的應(yīng)用。
[0018]人工誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育二倍體需要解決兩個問題:(I)使精子染色體遺傳物質(zhì)失活。精子遺傳失活的目的是讓精子的染色體去除或不參與合子核的形成，又要讓精子保持刺激卵子開始胚胎發(fā)育的能力；(2)使單倍體卵子染色體組加倍。雌核發(fā)育單倍體均能較好地通過胚胎發(fā)育，但到孵化期或孵化后數(shù)天由于“單倍體綜合癥”均會陸續(xù)死亡。因此，如果要獲得成活的雌核發(fā)育二倍體，還必須使其染色體加倍。
[0019]首先，對于精子染色體遺傳物質(zhì)的失活，如果同源精子滅活不完全，進行雌核發(fā)育誘導(dǎo)時，會產(chǎn)生正常的二倍體或是雜交個體，如果不能從形態(tài)上將其和雌核發(fā)育二倍體個體相區(qū)別，則不能證明誘導(dǎo)后的群體是否全部為雌核發(fā)育二倍體個體，因而要求滅活用的紫外線照射劑量越大滅活越完全。但是紫外線照射劑量的加大，將會影響精子的受精能力，進而影響孵化率。因此，在篩選滅活條件時，最佳的滅活條件是可以使精子遺傳完全失活的最低紫外線照射劑量。不同魚類間，精子的密度、活力、對紫外線的耐受能力等都存在著巨大差異。本發(fā)明通過不斷分析總結(jié)并結(jié)合大量的實驗確定了翹嘴鱖精子遺傳失活的紫外線照射劑量為80 mJ/cnT640 mJ/cm2，在所述紫外線照射劑量條件下，就可以完全排除誘變的隨機性，既能保證同源精子滅活完全，又能保證一定的孵化率，最佳的紫外線照射劑量為640 mj/cm2。
[0020]另外，要獲得較多的純合二倍體雌核發(fā)育個體，一般都要采用人工誘導(dǎo)的方法，SP用遺傳滅活的精 子與正常卵受精后，再阻止第二極體排出使染色體加倍。不同魚類第二極體的排出時間不同，一般冷水性魚類較遲，如鮭科魚類大多在受精后15mirT40min。溫水性魚類較早，如水晶彩鯽卵子在受精后4mirT5min開始處理最好。鯉在受精后lmirT9min處理效果最好。因此，雌核發(fā)育人工誘導(dǎo)中染色體加倍的效果受處理起始時間、處理持續(xù)時間和處理強度的影響，在每次誘導(dǎo)處理之時，確定最適水溫下受精卵排放第二極體時的時間，及時地進行溫度休克處理，才能獲得最佳的雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)效果，處理起始時間過早或過晚均可導(dǎo)致雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)率過低或雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)失敗。同時在采用熱休克處理時通常要用亞致死溫度才能有效地抑制第二極體的排出，并且，處理時間太短無抑制作用，太長則會對胚體造成較大損傷，導(dǎo)致孵化率下降、畸型率上升而影響整體誘導(dǎo)效果。另外，受精卵發(fā)育的速率與當(dāng)時的水溫也有很大關(guān)系，不同魚類耐受水溫和對高溫耐受時間不同。因此，不同魚類雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)的休克處理溫度、休克處理的起始時間和持續(xù)時間均完全不同。
[0021]目前，本領(lǐng)域人員公識認(rèn)為，對翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)均是采用冷休克法。但是，冷休克法誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育的最適溫度一般為0°c~4°C，而翹嘴鱖繁殖期主要集中在6月I月，這時繁殖水溫較高，使用冷休克法誘導(dǎo)翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體所需最適水溫條件在生產(chǎn)中難以獲得；并且在冷休克時調(diào)節(jié)水溫需要專門的制冷儀器等，所需成本高，很難在生產(chǎn)實踐中大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0022]為了克服上述翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)的技術(shù)問題，本發(fā)明通過研究首次發(fā)現(xiàn)也可以通過熱休克法誘導(dǎo)翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體。相比于冷休克法而言，熱休克法具有成本低、易實現(xiàn)、處理更為快捷、容易控制的優(yōu)勢，適合大范圍的推廣應(yīng)用，但是通過熱休克法誘導(dǎo)雌核發(fā)育二倍體的方法并不適用于所有魚類，如大黃魚、團頭魴以及大部分鲆鰈類均是利用冷休克法誘導(dǎo)人工雌核發(fā)育。本發(fā)明經(jīng)過反復(fù)試驗確定了翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)條件為熱休克處理溫度為41 °C，熱休克處理起始時間是在卵子受精后2 mirTlOmin，熱休克處理持續(xù)時間為f 2.5min，在所述熱休克處理條件下，可以獲得穩(wěn)定的誘導(dǎo)效果。最佳誘導(dǎo)條件:熱休克處理溫度為41°C，熱休克處理起始時間是在卵子受精后4min，熱休克處理持續(xù)時間為2min。
[0023]本發(fā)明具有如下有益效果:本發(fā)明首次采用熱休克法，并結(jié)合紫外線照射使精子遺傳失活，經(jīng)過大量實驗摸索確定了翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的最佳誘導(dǎo)方法，并且該誘導(dǎo)方法條件易得、成本低、便于控制、育種周期短。同時，本發(fā)明方法利用紫外線照射遺傳失活的翹嘴鱖精子，啟動卵子雌核發(fā)育以及染色體加倍的措施，精子失活率100%，再經(jīng)過熱休克法誘導(dǎo)產(chǎn)生的二倍體后代全部為只含有雌性親本基因的雌核發(fā)育二倍體，可加速優(yōu)良基因純合化、使優(yōu)良的遺傳性狀得以迅速固定，在翹嘴鱖遺傳分析和育種上有廣闊的應(yīng)用前景，具備很大的生產(chǎn)實踐推廣價值。
【具體實施方式】
[0024]以下結(jié)合具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備及方法為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑、設(shè)備及方法。
[0025]實施例1翹嘴鱖精子的遺傳物質(zhì)滅活條件的選擇
利用成熟度良好的翹嘴鱖雌魚和雄魚各10尾，經(jīng)人工催產(chǎn)后采集精子和卵子。
[0026]取新鮮翹嘴鱖精液500 μ L，用預(yù)冷的Hanks液按1:8比例稀釋后，平鋪于直徑為7cm的預(yù)冷培養(yǎng)皿中，設(shè)置0、80、160、240、320、400、480、560、640 mj/cm2等9個不同紫外線強度照射；將處理后的精液立即與3mL翹嘴鱖卵在25V~27°C水溫下人工授精；授精后室溫孵化，按普通翹嘴鱖苗培育方法管理。統(tǒng)計受精率、孵化率和單倍體率，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。
[0027]表1不同紫外線照射劑量對受精率、孵化率和單倍體誘導(dǎo)率的影響
【權(quán)利要求】
1.一種翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法，其特征在于，包括以下步驟: S1.翹嘴鱖精子的遺傳失活:取新鮮翹嘴鱖精液，按1:4-1:40的比例經(jīng)Hanks液稀釋后用紫外線照射，紫外線照射劑量為80 mJ/cnT640 mj/cm2 ； S2.卵子雌核發(fā)育的啟動:將SI得到的遺傳失活的翹嘴鱖精子與翹嘴鱖成熟卵子混合受精； S3.卵子單倍體染色體組加倍:卵子經(jīng)S2步驟受精后，轉(zhuǎn)移到淡水中進行熱休克處理，得到二倍體卵； S4.將S3所得到的二倍體卵轉(zhuǎn)入淡水中，室溫孵化，按普通翹嘴鱖苗培育方法管理，得到翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體魚苗； 步驟S3所述熱休克處理的溫度為41 °C，熱休克處理的起始時間是在卵子受精后2mirTl0min,熱休克處理持續(xù)時間為lmirT2.5min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法，其特征在于，步驟SI所述經(jīng)Hanks液稀釋是按1:8的比例經(jīng)Hanks液稀釋。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法，其特征在于，步驟SI所述紫外線照射劑量為640 mj/cm2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法，其特征在于，步驟S2所述的混合是在25°C~27°C的溫度條件下進行的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法，其特征在于，步驟S3所述熱休克處理起始時間是在卵子受精后4min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法，其特征在于，步驟S3所述熱休克處理的持續(xù)時間為2min。
7.權(quán)利要求1所述翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法在翹嘴鱖育種方面的應(yīng)用。
【文檔編號】A01K61/00GK103734037SQ201310568931
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】李桂峰, 胥鵬, 古勇明, 盧薛, 王鵬飛, 周磊, 韓林強 申請人:中山大學(xué), 佛山市南海百容水產(chǎn)良種有限公司