束花石斛組培快繁生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種束花石斛高效組培快繁生產(chǎn)方法，屬于中藥材組培【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)束花石斛高效組培快繁生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短、成本低，可規(guī)?；a(chǎn)種苗，種苗經(jīng)練苗后移栽成活率達(dá)95%以上，便于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。通過(guò)本發(fā)明培育出來(lái)的束花石斛種苗繁殖快速，有效成分（石斛多糖）含量與功效與野生野生型束花石斛相似，且相對(duì)穩(wěn)定，解決了自然條件下束花石斛繁殖緩慢而使得生產(chǎn)中資源匱乏的問(wèn)題，對(duì)瀕危緊缺藥用植物資源再生和持續(xù)利用具有十分積極的影響。
【專利說(shuō)明】束花石斛組培快繁生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥材組培【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種束花石斛高效組培快繁生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]石斛，蘭科植物之一，在我國(guó)主要分布于西南、華南、臺(tái)灣等地，對(duì)人體具有曲解虛熱、益精強(qiáng)陰等療效，藥用價(jià)值已被世人所認(rèn)可，并被廣泛使用。石斛始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，記載:“味甘、平，無(wú)毒；治傷中，除痹，下氣，補(bǔ)五臟虛勞，贏瘦，強(qiáng)陰；久服厚腸胃，輕身，延年，長(zhǎng)肌肉，逐皮膚邪熱，定志除驚等”。《本草綱目拾遺》(清.趙學(xué)敏):“清胃除虛熱，生津，已勞損，以之代茶，開胃健脾，定驚療風(fēng)，能鎮(zhèn)炎痰，解暑，甘芳降氣等”。
[0003]石斛屬為蘭科比較大的屬之一，全球約有1000余種，我國(guó)有石斛屬植物共74種2變種，其中有藥用價(jià)值且能進(jìn)行商品流通的有50余種，如束花石斛、鐵皮石斛、金釵石斛等。束花石斛(Dendrobium chrysanthum Wall.exLindl)是《中華人民共和國(guó)藥典》收載入藥的石斛中藥材之一，味淡、性微寒，有滋陰養(yǎng)胃、清熱解毒的功效，在臨床上多用于治療慢性咽喉炎、眼科疾病、血栓閉塞性疾病，效果十分明顯，在我國(guó)主要分布云南、廣西、貴州等省。
[0004]束花石斛是脈絡(luò)寧、通塞脈片、石斛液光丸等著名中成藥的主要原料之一，為我國(guó)常用的傳統(tǒng)中藥植物，國(guó)內(nèi)外需求量大。由于近年來(lái)過(guò)量挖采，野生資源已經(jīng)瀕臨滅絕而成為稀缺藥材，而該植物的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足藥用制品和保健品生產(chǎn)需求，供需矛盾較突出。因此，只有通過(guò)組培快繁技術(shù)，大量繁育種苗，發(fā)展人工栽培生產(chǎn)，才能滿足市場(chǎng)需求。
[0005]從20世紀(jì)70年代開 始，我國(guó)科學(xué)家開始對(duì)石斛的組織培養(yǎng)育苗和人工栽培做了大量研究，并于80年代，實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛組培苗的工廠化生產(chǎn)，成功將技術(shù)研究推向?qū)嶋H應(yīng)用。采用工廠化快繁種苗不僅保護(hù)了這一珍稀野生資源，還持續(xù)為相關(guān)制藥廠和保健品生產(chǎn)廠家提供了原材料，緩解國(guó)內(nèi)市場(chǎng)供需矛盾。而目前對(duì)于束花石斛的組培繁殖研究較少。史永鋒等(束花石斛快繁育苗技術(shù)的研究)，中草藥，第36卷第3期，2005年3月)為尋找束花石斛快繁育苗的有效途徑，采用組織培養(yǎng)和野生自然棲息的束花石斛誘導(dǎo)高位腋芽萌發(fā)等途徑進(jìn)行探索，最后得出結(jié)論:在組織培養(yǎng)中，改良1/2MS培養(yǎng)基德圓球莖形成效果最好，調(diào)整不同溶度的N、P、K及外援激素對(duì)誘導(dǎo)束花石斛圓球增殖、生根壯苗極為明顯；外援激素對(duì)誘導(dǎo)束花石斛的高位腋芽萌發(fā)無(wú)明顯效果，高位芽萌發(fā)與莖株勝利年齡和營(yíng)養(yǎng)狀況有關(guān)。這些研究為束花石斛組培繁殖產(chǎn)業(yè)化奠定了科學(xué)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種束花石斛高效組培快繁生產(chǎn)方法，本方法不僅可以進(jìn)行工廠化生產(chǎn)以滿足市場(chǎng)需求，而且用該方法培育出來(lái)的束花石斛性能相對(duì)穩(wěn)定，食用安全，有效成分(石斛多糖)含量與功效與野生型束花石斛相似，間接保護(hù)了野生資源。
[0007]為實(shí)現(xiàn)所述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下:一種束花石斛組培快繁生產(chǎn)方法，包括如下步驟:
(I)將野生束花石斛植株引種在苗圃內(nèi)，于花期進(jìn)行人工授粉，授粉后果實(shí)成熟，將果實(shí)作為外植體。
[0008](2)將選取的果實(shí)經(jīng)外表滅菌處理后，取出內(nèi)部的種胚，均勻撒播到萌芽培養(yǎng)基上，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度1800-2500LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)25-30天后，種子萌發(fā)形成圓球莖。
[0009](3)將步驟(2)中形成的圓球莖轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度1800-2500LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)25-30天后，圓球莖分化形成帶芽的芽苗。
[0010](4)將步驟(3)中形成的芽苗轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基中，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度2000-3000LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)25-30天后，可培養(yǎng)出3cm高的大苗。
[0011](5)將步驟(4)中培養(yǎng)出來(lái)的大苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度2000-3000LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)25-30天后，可培養(yǎng)出5cm高以上根系發(fā)達(dá)的完整大苗。
[0012](6)將步驟(5)中培養(yǎng)出來(lái)的健壯大苗轉(zhuǎn)移至溫室大棚內(nèi)練苗15-20天，然后清洗組培苗根部的培養(yǎng)基，用0.25-0.5%多菌靈溶液浸7-10min后移栽至苗圃的基質(zhì)中。
[0013]所述萌芽培養(yǎng)基為MS+馬鈴薯汁100g/L+ACl.0g/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.0g/L, pH為 5.2-5.4。
[0014]所述分化培養(yǎng)基為MS+馬鈴薯汁200g/L+ACl.0g/L+蔗糖20g/L+瓊脂5.0g/L, pH為 5.2-5.4。
[0015]所述壯苗培養(yǎng)基為MS+香蕉汁100g/L+ACl.0g/L+活性炭1.0g/L+蔗糖30g/L+瓊脂 5.0g/L，pH 為 5.2-5.4。
[0016] 所述生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.5-1.0g/L+活性炭0.5g/L+蔗糖20g/L+瓊脂
5.0g/L, pH 為 5.2-5.4。
[0017]所述步驟(2)的滅菌處理是將外植體用流動(dòng)的自來(lái)水下沖洗干凈后，置于超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)70-80%的酒精浸泡30-60s，再用0.1%的氯化汞消毒10_15min，然后取出用無(wú)菌水漂洗5次。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果:
(I)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)束花石斛高效組培快繁生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短、成本低，可規(guī)模化生產(chǎn)種苗，種苗經(jīng)練苗后移栽成活率達(dá)95%以上，便于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。
[0019](2)本發(fā)明方法采用束花石斛種子為外植體，在種子萌芽和圓球莖培養(yǎng)過(guò)程不使用激素，避免了衰退、變異等問(wèn)題的發(fā)生，有利于保持種苗的優(yōu)良形狀，提高種苗使用的安全性。
[0020](3)通過(guò)本發(fā)明培育出來(lái)的束花石斛種苗繁殖快速，有效成分(石斛多糖)含量與功效與野生野生型束花石斛相似，且相對(duì)穩(wěn)定，解決了自然條件下束花石斛繁殖緩慢而使得生產(chǎn)中資源匱乏的問(wèn)題，對(duì)瀕危緊缺藥用植物資源再生和持續(xù)利用具有十分積極的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明作更清楚的說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0022]1、培養(yǎng)基配制
實(shí)施例1:萌芽培養(yǎng)基:以MS為基本培養(yǎng)基，每升添加馬鈴薯汁100g/L、ACl.0g/L、蔗糖30g/L、瓊脂5.0g/L, pH調(diào)節(jié)至5.2-5.4 ;將配制后的培養(yǎng)基加熱至瓊脂完全溶解，趁熱均勻地分裝于干凈的培養(yǎng)瓶中，加蓋；將加入培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)于121°C、105kPa條件下滅菌20min ;滅菌后取出，冷卻備用。
[0023]實(shí)施例2:分化培養(yǎng)基:以MS為基本培養(yǎng)基，每升添加馬鈴薯汁200g/L、ACl.0g/L、蔗糖20g/L、瓊脂5.0g/L, pH調(diào)節(jié)至5.2-5.4 ;將配制后的培養(yǎng)基加熱至瓊脂完全溶解，趁熱均勻地分裝于干凈的培養(yǎng)瓶中，加蓋；將加入培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)于121°C、105kPa條件下滅菌20min ;滅菌后取出，冷卻備用。
[0024]實(shí)施例3:壯苗培養(yǎng)基:以MS為基本培養(yǎng)基，每升添加香蕉汁100g/L、ACl.0g/L、活性炭1.0g/L、蔗糖30g/L、瓊脂5.0g/L, pH調(diào)節(jié)至5.2-5.4 ;將配制后的培養(yǎng)基加熱至瓊脂完全溶解，趁熱均勻地分裝于干凈的培養(yǎng)瓶中，加蓋；將加入培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)于121°C、105kPa條件下滅菌20min ;滅菌后取出，冷卻備用。
[0025]實(shí)施例4:生根培養(yǎng)基:以1/2MS為基本培養(yǎng)基，每升添加ΝΑΑ0.5-1.0g/L、活性炭
0.5g/L、蔗糖20g/L、瓊脂5.0g/L，pH調(diào)節(jié)至5.2-5.4 ;將配制后的培養(yǎng)基加熱至瓊脂完全溶解，趁熱均勻地分裝于干凈的培養(yǎng)瓶中，加蓋；將加入培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)于121°C、105kPa條件下滅菌20min ;滅菌后取出，冷卻備用。
[0026]2、生產(chǎn)實(shí)施例 實(shí)施例5
本發(fā)明一種束花石斛組培快繁生產(chǎn)方法，包括如下步驟:
(1)將在野外原生產(chǎn)地采摘回來(lái)的野生束花石斛植株引種在苗圃內(nèi)，于花期進(jìn)行人工授粉，授粉后果實(shí)成熟，將果實(shí)作為外植體。
[0027](2)將選取的外植體果實(shí)用流動(dòng)的自來(lái)水下沖洗干凈后，置于超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精浸泡60s，再用0.1%的氯化汞消毒lOmin，然后取出用無(wú)菌水漂洗5次；用無(wú)菌濾紙吸干果實(shí)表面的水分后剖開果實(shí)，取出內(nèi)部的種胚，均勻撒播到萌芽培養(yǎng)基(實(shí)施例I)上，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度1800-2500LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)28天后，種子萌發(fā)形成圓球莖。
[0028](3)將步驟(2)中形成的圓球莖轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基(實(shí)施例2)中，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度1800-2500LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)30天后，圓球莖分化形成帶芽的芽苗。
[0029](4)將步驟(3)中形成的芽苗轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基(實(shí)施例3)中，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度2000-3000LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)25天后，可培養(yǎng)出3cm高的大苗。
[0030](5)將步驟(4)中培養(yǎng)出來(lái)的大苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(實(shí)施例4)中，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度2000-3000LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)26天后，可培養(yǎng)出5cm高以上根系發(fā)達(dá)的完整大苗。
[0031](6)將步驟(5)中培養(yǎng)出來(lái)的健壯大苗轉(zhuǎn)移至溫室大棚內(nèi)練苗16天，然后清洗組培苗根部的培養(yǎng)基，用0.3%多菌靈溶液浸8min后移栽至苗圃的基質(zhì)中。
[0032]本方法種苗經(jīng)練苗后移栽成活率為95.31%。[0033]實(shí)施例6
本發(fā)明一種束花石斛組培快繁生產(chǎn)方法，包括如下步驟:
(I)將在野外原生產(chǎn)地采摘回來(lái)的野生束花石斛植株引種在苗圃內(nèi)，于花期進(jìn)行人工授粉，授粉后果實(shí)成熟，將果實(shí)作為外植體。
[0034](2)將選取的外植體果實(shí)用流動(dòng)的自來(lái)水下沖洗干凈后，置于超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)80%的酒精浸泡40s，再用0.1%的氯化汞消毒lOmin，然后取出用無(wú)菌水漂洗5次；用無(wú)菌濾紙吸干果實(shí)表面的水分后剖開果實(shí)，取出內(nèi)部的種胚，均勻撒播到萌芽培養(yǎng)基(實(shí)施例I)上，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度1800-2500LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)25天后，種子萌發(fā)形成圓球莖。
[0035](3)將步驟(2)中形成的圓球莖轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基(實(shí)施例2)中，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度1800-2500LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)28天后，圓球莖分化形成帶芽的芽苗。
[0036](4)將步驟(3)中形成的芽苗轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基(實(shí)施例3)中，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度2000-3000LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)30天后，可培養(yǎng)出3cm高的大苗。
[0037](5)將步驟(4)中培養(yǎng)出來(lái)的大苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(實(shí)施例4)中，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度2000-3000LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)30天后，可培養(yǎng)出5cm高以上根系發(fā)達(dá)的完整大苗。
[0038](6)將步驟(5)中培養(yǎng)出來(lái)的健壯大苗轉(zhuǎn)移至溫室大棚內(nèi)練苗20天，然后清洗組培苗根部的培養(yǎng)基，用0.35%多菌靈溶液浸IOmin后移栽至苗圃的基質(zhì)中。
[0039]本方法種苗經(jīng)練 苗后移栽成活率為96.54%ο
[0040]實(shí)施例7
本發(fā)明一種束花石斛組培快繁生產(chǎn)方法，包括如下步驟:
(I)將在野外原生產(chǎn)地采摘回來(lái)的野生束花石斛植株引種在苗圃內(nèi)，于花期進(jìn)行人工授粉，授粉后果實(shí)成熟，將果實(shí)作為外植體。
[0041](2)將選取的外植體果實(shí)用流動(dòng)的自來(lái)水下沖洗干凈后，置于超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)70%的酒精浸泡50s，再用0.1%的氯化汞消毒12min，然后取出用無(wú)菌水漂洗5次；用無(wú)菌濾紙吸干果實(shí)表面的水分后剖開果實(shí)，取出內(nèi)部的種胚，均勻撒播到萌芽培養(yǎng)基(實(shí)施例I)上，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度1800-2500LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)30天后，種子萌發(fā)形成圓球莖。
[0042](3)將步驟(2)中形成的圓球莖轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基(實(shí)施例2)中，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度1800-2500LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)26天后，圓球莖分化形成帶芽的芽苗。
[0043](4)將步驟(3)中形成的芽苗轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基(實(shí)施例3)中，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度2000-3000LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)28天后，可培養(yǎng)出3cm高的大苗。
[0044](5)將步驟(4)中培養(yǎng)出來(lái)的大苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(實(shí)施例4)中，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度2000-3000LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)28天后，可培養(yǎng)出5cm高以上根系發(fā)達(dá)的完整大苗。
[0045](6)將步驟(5)中培養(yǎng)出來(lái)的健壯大苗轉(zhuǎn)移至溫室大棚內(nèi)練苗18天，然后清洗組培苗根部的培養(yǎng)基，用0.4%多菌靈溶液浸7min后移栽至苗圃的基質(zhì)中。[0046] 本方法種苗經(jīng)練苗后移栽成活率為96.07%。
【權(quán)利要求】
1.一種束花石斛組培快繁生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將野生束花石斛植株引種在苗圃內(nèi)，于花期進(jìn)行人工授粉，授粉后果實(shí)成熟，將果實(shí)作為外植體； (2)將選取的果實(shí)經(jīng)外表滅菌處理后，取出內(nèi)部的種胚，均勻撒播到萌芽培養(yǎng)基上，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度1800-2500LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)25-30天后，種子萌發(fā)形成圓球莖； (3)將步驟(2)中形成的圓球莖轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度1800-2500LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)25-30天后，圓球莖分化形成帶芽的芽苗； (4)將步驟(3)中形成的芽苗轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基中，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度1800-2500LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)25-30天后，可培養(yǎng)出3cm高的大苗； (5)將步驟(4)中培養(yǎng)出來(lái)的大苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度1800-2500LX、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)25-30天后，可培養(yǎng)出5cm高以上根系發(fā)達(dá)的完整大苗； (6)將步驟(5)中培養(yǎng)出來(lái)的健壯大苗轉(zhuǎn)移至溫室大棚內(nèi)練苗15-20天，然后清洗組培苗根部的培養(yǎng)基，用0.25-0.5%多菌靈溶液浸7-10min后移栽至苗圃的基質(zhì)中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的束花石斛組培快繁生產(chǎn)方法，其特征在于，所述萌芽培養(yǎng)基為 MS+ 馬鈴薯汁 100g/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5.0g/L, pH 為 5.2-5.4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的束花石斛組培快繁生產(chǎn)方法，其特征在于，所述分化培養(yǎng)基為 MS+ 馬鈴薯汁 200g/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 5.0g/L, pH 為 5.2-5.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的束花石斛組培快繁生產(chǎn)方法，其特征在于，所述壯苗培養(yǎng)基為 MS+ 香蕉汁 100g/L+ACl.0g/L+ 活性炭 1.0g/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5.0g/L, pH 為 5.2-5.4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的束花石斛組培快繁生產(chǎn)方法，其特征在于，所述生根培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA0.5-1.0g/L+ 活性炭 0.5g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 5.0g/L, pH 為 5.2-5.4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的束花石斛組培快繁生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟(2)的滅菌處理是將外植體用流動(dòng)的自來(lái)水下沖洗干凈后，置于超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)70-80%的酒精浸泡30-60s，再用0.1%的氯化汞消毒10-15min，然后取出用無(wú)菌水漂洗5次。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103651120SQ201310569209
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日
【發(fā)明者】羅永城, 黃南概, 林國(guó)友 申請(qǐng)人:廣西弘耀祥科技有限公司