一種免疫細(xì)胞凍存液、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種免疫細(xì)胞凍存液、其制備方法及應(yīng)用，該免疫細(xì)胞凍存液包含二甲基亞砜、人供體血漿和免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。具體地，所述免疫細(xì)胞凍存液按體積百分比包含5-10%二甲基亞砜、10-90%人供體血漿和0.01-80%免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液中不含動(dòng)物血清，因此不會(huì)引入外源蛋白，降低了動(dòng)物病原污染的可能性；能夠有效的保護(hù)免疫細(xì)胞免受冷凍損傷，保持免疫細(xì)胞復(fù)蘇后的生理功能和生物學(xué)特性的穩(wěn)定性，可直接應(yīng)用于臨床治療，本發(fā)明適用于人單個(gè)核細(xì)胞及其它各類(lèi)免疫細(xì)胞的長(zhǎng)期冷凍儲(chǔ)存。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種免疫細(xì)胞凍存液、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞保存【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種免疫細(xì)胞凍存液、其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]對(duì)供體的免疫細(xì)胞深低溫保存可保持其活力和功能，無(wú)論對(duì)臨床還是基礎(chǔ)研究均具有重要意義，尤其是免疫細(xì)胞用于回顧性研究時(shí)更為重要。冷凍保存免疫細(xì)胞不僅可以解決現(xiàn)有免疫細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，需要多次誘導(dǎo)和患者多次采血的問(wèn)題，還可以把人健康狀態(tài)最好戰(zhàn)斗力最強(qiáng)時(shí)期的免疫細(xì)胞保存下來(lái)，用于腫瘤治療以及抗衰老保健治療。
[0003]影響免疫細(xì)胞凍存和復(fù)蘇活性的主要因素包括冷凍及復(fù)蘇的方式和冷凍劑的選擇。造成細(xì)胞損傷的兩種因素一種是細(xì)胞內(nèi)冰晶形成和重結(jié)晶，一般是由不適當(dāng)?shù)慕禍睾蛷?fù)溫導(dǎo)致；另一種是溶質(zhì)損傷，一般是由于冷凍使得電解質(zhì)和溶質(zhì)濃度升高所致。免疫細(xì)胞在-70°C~_80°C凍存，細(xì)胞活性會(huì)隨著冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)迅速下降，在_196°C時(shí)細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程幾乎停止，因此要長(zhǎng)期保存免疫細(xì)胞，液氮溫度是最佳的儲(chǔ)存溫度。冷凍保護(hù)劑可以避免冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，保護(hù)細(xì)胞膜和細(xì)胞器免受損傷。細(xì)胞凍存常用滲透性保護(hù)劑，有甘油和二甲基亞砜(DMSO)兩種，而甘油作為冷凍保護(hù)劑凍存的免疫細(xì)胞存活率較低，DMSO可迅速透入細(xì)胞，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，使水分在細(xì)胞凍結(jié)前透出細(xì)胞外形成冰晶，為免疫細(xì)胞凍存最理想的冷凍保護(hù)劑。目前國(guó)內(nèi)凍存方法多采用的是DMS0、動(dòng)物血清和細(xì)胞培養(yǎng)液按不同比例 搭配成的凍存液，優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞保存時(shí)間長(zhǎng)，缺點(diǎn)是凍存液中含有的動(dòng)物血清引入了外源蛋白，同時(shí)增加了動(dòng)物病原污染的可能性，會(huì)對(duì)人體過(guò)繼免疫治療產(chǎn)生一定影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種免疫細(xì)胞凍存液、其制備方法及應(yīng)用，該免疫細(xì)胞凍存液中不含動(dòng)物血清，因此不會(huì)引入外源蛋白，降低了動(dòng)物病原污染的可能性，不會(huì)對(duì)人體過(guò)繼免疫治療產(chǎn)生影響；本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液能夠有效的保護(hù)免疫細(xì)胞免受冷凍損傷，保持免疫細(xì)胞復(fù)蘇后的生理功能和生物學(xué)特性。
[0005]為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0006]在第一方面，本發(fā)明提供一種免疫細(xì)胞凍存液，其包含二甲基亞砜、人供體血漿和免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0007]本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液用人供體血漿代替動(dòng)物血清，不但避免了引入外源蛋白，降低了動(dòng)物病原污染的可能性；而且用人供體血漿保存供體自身的免疫細(xì)胞，比用動(dòng)物血清保存人免疫細(xì)胞能夠更好地保持免疫細(xì)胞復(fù)蘇后的生理功能和生物學(xué)特性。
[0008]本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液并不排除其它成分的存在，比如生理鹽水等。
[0009]優(yōu)選地，所述免疫細(xì)胞凍存液按體積百分比包含5-10% 二甲基亞砜、10-90%人供體血漿和0.01-80%免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。[0010]本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液按體積百分比二甲基亞砜的含量比如可以是5%、6%、7%、8%、9% 或 10% 等，優(yōu)選 10% ο
[0011 ] 本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液按體積百分比人供體血漿的含量比如可以是10%、12%、15%、20%、24%、28%、32%、40%、50%、60%、70%、80%、85% 或 89% 等，優(yōu)選 10%。
[0012]本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液按體積百分比免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基的含量比如可以是
0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 等，優(yōu)選 80%。
[0013]更優(yōu)選地，所述免疫細(xì)胞凍存液按體積百分比由5-10% 二甲基亞砜、10-90%人供體血漿和0.01-80%免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成，即僅含有上述體積百分比的三種成分。
[0014]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述免疫細(xì)胞凍存液按體積百分比包含5-10% 二甲基亞砜、10-40%人供體血漿和50-80%免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0015]更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述免疫細(xì)胞凍存液按體積百分比包含10% 二甲基亞砜、10%人供體血漿和80%免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0016]本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液中，所述免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自opTmizer?CTS?T-Cell Expans1n SFM 培養(yǎng)基或 RPM1-1640 培養(yǎng)基，可購(gòu)自美國(guó) GIBCO 公司。
[0017]在第二方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的免疫細(xì)胞凍存液的制備方法，所述方法包括將所述二甲基亞砜 、人供體血漿和免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合的步驟。
[0018]本發(fā)明對(duì)制備人供體血漿的方法不限，比如可以通過(guò)如下方法制備:將抗凝外周血于2000-2500rpm離心15_20min，吸取上層血漿，置于水浴鍋中56 °C保持30min，然后2000-2500rpm離心5_10min,取上清，即自體血衆(zhòng),4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0019]因此本發(fā)明免疫細(xì)胞凍存液的一個(gè)優(yōu)選的制備方法包括:
[0020](I)制備人供體血漿；例如，可以通過(guò)將抗凝外周血離心，吸取上層血漿，52_60°C、優(yōu)選56°C水浴上層血衆(zhòng)25-35min、優(yōu)選30min,然后離心棄沉淀的過(guò)程制備人供體血衆(zhòng)；和
[0021](2)將所述二甲基亞砜、人供體血漿和免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基按配比混合，得到所述免疫細(xì)胞凍存液。
[0022]在第三方面，本發(fā)明提供一種免疫細(xì)胞的凍存方法，包括:
[0023](a)將免疫細(xì)胞懸浮于如第一方面所述的免疫細(xì)胞凍存液；和
[0024](b)進(jìn)行程控降溫至_80°C，然后轉(zhuǎn)移至液氮中冷凍保存。
[0025]本發(fā)明程控降溫的程序不限，比如可以是:第一步:4°C，等待；第二步:以1.(TC /分鐘降至-3.(TC ;第三步:以10.(TC /分鐘降至-20.(TC ;第四步:以1.(TC /分鐘降至-40.(TC ;第五步:以10.(TC /分鐘降至-80.(TC。
[0026]在第三方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的免疫細(xì)胞凍存液在凍存免疫細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0027]優(yōu)選地，所述免疫細(xì)胞為外周血單個(gè)核細(xì)胞，更優(yōu)選自然殺傷細(xì)胞。
[0028]本發(fā)明的有益效果為:
[0029]本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液中不含動(dòng)物血清，因此不會(huì)引入外源蛋白，降低了動(dòng)物病原污染的可能性，不會(huì)對(duì)人體過(guò)繼免疫治療產(chǎn)生影響；本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液能夠有效的保護(hù)免疫細(xì)胞免受冷凍損傷，保持免疫細(xì)胞復(fù)蘇后的生理功能和生物學(xué)特性，免疫細(xì)胞復(fù)蘇后的活性達(dá)到90%，細(xì)胞生物學(xué)特性不發(fā)生變化，可應(yīng)用于臨床治療，本發(fā)明適用于人單個(gè)核細(xì)胞及其它各類(lèi)免疫細(xì)胞的長(zhǎng)期冷凍儲(chǔ)存。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，以下實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換或改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購(gòu)買(mǎi)得到的。
[0031]實(shí)驗(yàn)材料及其來(lái)源:
[0032]1、實(shí)驗(yàn)環(huán)境:GMP實(shí)驗(yàn)室里的生物安全柜中操作。
[0033]2、試劑:opTmizerTMCTS?T-Cell Expans1n SFM 培養(yǎng)基(GIBC0，美國(guó))、RPM1-1640培養(yǎng)基(GIBC0，美國(guó))、SCGM培養(yǎng)基(Sigma公司)、GT-T551培養(yǎng)基(寶生物工程(大連)有限公司)、人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)、胎牛血清(GIBC0，美國(guó))、二甲基亞砜DMSO (WAK，德國(guó))、肝素鈉鹽溶液(上海第一生化藥業(yè)有限公司)、生理鹽水(杭州民生藥業(yè))、L-谷氨酰胺(GIBC0，美國(guó))、注射用甘露聚糖肽、抗人⑶16單抗、白細(xì)胞介素2。
[0034]3、器材:離心機(jī)(THERMO，美國(guó))、T175培養(yǎng)瓶(NUNC，丹麥)、GT-A610培養(yǎng)袋(TAKARA,日本)、C02培養(yǎng)箱(三洋，中國(guó))、程控降溫儀(THERMO，美國(guó))、生物安全柜(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，香港)、50ml離心管(BD，美國(guó))。
[0035]實(shí)施例1:制備人供體血漿
[0036]( 1)抽血:選兩名志愿者(A和B),分別用50ml注射器抽取50ml外周血,肝素抗凝(也可以采用檸檬酸鈉或EDTA等其它抗凝方式)。
[0037](2)取少量外周血進(jìn)行梅毒螺旋體、巨細(xì)胞病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒和EB病毒等特異性病毒檢測(cè)，均為陰性(表1)，證明兩志愿者均為不攜帶上述病菌或病毒的健康個(gè)體。
[0038]表1志愿者血液檢測(cè)結(jié)果
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種免疫細(xì)胞凍存液，其特征在于，所述免疫細(xì)胞凍存液包含二甲基亞砜、人供體血漿和免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫細(xì)胞凍存液，其特征在于，所述免疫細(xì)胞凍存液按體積百分比包含5-10% 二甲基亞砜、10-90%人供體血漿和0.01-80%免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫細(xì)胞凍存液，其特征在于，所述免疫細(xì)胞凍存液按體積百分比由5-10% 二甲基亞砜、10-90%人供體血漿和0.01-80%免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫細(xì)胞凍存液，其特征在于，所述免疫細(xì)胞凍存液按體積百分比包含5-10% 二甲基亞砜、10-40%人供體血漿和50-80%免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫細(xì)胞凍存液，其特征在于，所述免疫細(xì)胞凍存液按體積百分比包含10% 二甲基亞砜、10%人供體血漿和80%免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的免疫細(xì)胞凍存液，其特征在于，所述免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自 opTmizerTMCTS?T-Cell Expans1n SFM 培養(yǎng)基或 RPM1-1640 培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的免疫細(xì)胞凍存液的制備方法，其特征在于，所述方法包括將所述二甲基亞砜、人供體血漿和免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述方法包括: (1)制備人供體血漿； 優(yōu)選地，通過(guò)將抗凝外周血離心，吸取上層血漿，52-60°C、優(yōu)選56°C水浴上層血漿25-35min、優(yōu)選30min,然后離心棄沉淀的過(guò)程制備人供體血衆(zhòng)；和 (2)將所述二甲基亞砜、人供體血漿和免疫細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基按配比混合，得到所述免疫細(xì)胞凍存液。
9.一種免疫細(xì)胞的凍存方法，其特征在于，包括: Ca)將免疫細(xì)胞懸浮于權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的免疫細(xì)胞凍存液；和 (b)進(jìn)行程控降溫至_80°C，然后轉(zhuǎn)移至液氮中冷凍保存。
10.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的免疫細(xì)胞凍存液在凍存免疫細(xì)胞中的應(yīng)用； 優(yōu)選地，所述免疫細(xì)胞為外周血單個(gè)核細(xì)胞，更優(yōu)選自然殺傷細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】A01N1/02GK104026118SQ201310571326
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日
【發(fā)明者】項(xiàng)春生, 王大奎, 張翠翠 申請(qǐng)人:杭州易文賽生物技術(shù)有限公司