一種復合型包埋劑固定用于抑制藻類的光合細菌的固定方法
【專利摘要】一種復合型包埋劑固定用于抑制藻類的光合細菌的固定方法，屬于水處理和微生物固定化【技術領域】。選擇海藻酸鈉為包埋劑，沸石和碳酸鈣為添加劑，氯化鈣的飽和硼酸溶液為交聯(lián)劑，固定化溫度為4℃，固定化1h后，通過調節(jié)pH進行二次交聯(lián)24h后成球洗滌備用；同時本發(fā)明公開了其抑制富營養(yǎng)化水體中藻類的應用。本發(fā)明所提出的固定化方法適應了光合細菌的生理特性，能使其維持良好的生理活性；提供的最佳包埋比例使顆粒的密度、機械強度、含水率、傳質性、細胞活性和膨脹性都能維持在良好的水平；其制作工藝簡單，成本低，易于大范圍推廣；其抑藻效果顯著優(yōu)于游離光合細菌，不產(chǎn)生二次污染，為富營養(yǎng)化的治理提供一條有效的途徑。
【專利說明】一種復合型包埋劑固定用于抑制藻類的光合細菌的固定方

法【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于水處理和微生物固定化【技術領域】，具體地涉及一種復合型包埋劑及固定化光合細菌的方法及其對富營養(yǎng)化水體常見藻類的抑制作用。
【背景技術】
[0002]隨著城市化水平和工業(yè)化程度的提高，水資源短缺和水污染日益加重，再生水已經(jīng)成為很多缺水城市穩(wěn)定的第二水源。在再生水的利用中，作為補給景觀水體的生態(tài)用水是其最主要的應用范圍之一。而由于再生水水質特殊的物理化學性質，在使用過程中比天然水體更容易引起水體由于藻類過度繁殖導致的富營養(yǎng)化問題。
[0003]常見水體藻類控制技術可分為:物理方法、物理化學法、化學方法和生物方法。這些方法都在不同程度上存在費用高，不易控制等缺點。近年來，通過向水體中投加微生物，利用菌藻相互影響來控制藻類的過度繁殖的綠色控藻技術開始受到關注，其中光合細菌(PSB)是最常使用的。光合細菌適應性強，它既不像好氧活性污泥菌膠團細菌那樣受污水中氧濃度的限制，因其可以利用光能進行高效的能量代謝，即使在微弱的光照條件下也能進行，其中有機物作為供氫體被利用；又不像嚴格厭氧的甲烷細菌那樣對氧的存在高度敏感，可以在有氧條件下分解有機物，通過氧化磷酸化取得能量供其生長。因此，光合細菌在抑藻、水產(chǎn)養(yǎng)殖、有機廢水處理等方面具有其它微生物無法替代的優(yōu)勢。
[0004]目前，光合細菌主要以游離細胞的形式被應用。而游離細胞在流水條件下易被水流沖走，在靜水條件下易被其他生物所食用，并且缺乏吸附和生長繁殖的載體時其難以穩(wěn)定地長期發(fā)揮功能。固定化微生物技術的興起為其應用增添了新的活力。固定化微生物是用化學或物理手段將游離微生物定位于限定的空間區(qū)域內，增大微生物密度并使其保持活性的方法，能夠避免微生物流失，提高穩(wěn)定性、耐毒害和抗沖擊能力等，被廣泛應用。目前采用的固定化方法主要有:吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價結合法，其中包埋法具有操作簡單，對細胞活性影響較小，效率高等特點，是細胞固定化研究和應用最廣泛的方法。常用的包埋材料有:瓊脂、海藻酸鈉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等。海藻酸銨固定化的細胞制備過程簡便，不粘連，傳質性能較好，但強度較低；海藻酸鈉和聚乙烯醇聯(lián)合固定化方法研究較多，但是制備過程中有較嚴重的粘連現(xiàn)象且水溶膨脹性嚴重，不利于應用。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有固定化方法的不足，尋找一種專門用于控藻技術的光合細菌復合型固定化方法，以海藻酸鈉為包埋劑，通過添加劑對固定化光合細菌進行改性，使固定化光合細菌的密度、機械強度、含水率、傳質性、細胞活性和膨脹性都能維持在良好的水平，固定化后的光合細菌投加到水中以后，通過菌藻互作機理抑制藻類生長，為水體富營養(yǎng)化的治理提供一條新的途徑。
[0006]本發(fā)明解決其技術問題所采取的技術方案是:以海藻酸鈉為包埋劑，沸石和碳酸鈣為添加劑，用含有氯化鈣的飽和硼酸為交聯(lián)劑，在最佳包埋比例、交聯(lián)時間、溫度的條件下，將光合細菌進行固定化，進而進行抑藻。
[0007]—種復合型包埋劑用于光合細菌的固定方法，具體包括以下步驟:
[0008](I)光合細菌濃縮液的制備:將光合細菌培養(yǎng)至對數(shù)期，使得OD68tl值為1.5-1.8，將光合細菌懸液在8000-10000r ? mirT1轉速下離心8_12min，用生理鹽水洗凈沉淀后再離心，如此重復3次，用生理鹽水配成OD68tl為2.3-2.6的濃縮液；
[0009](2)包埋劑的配制:將海藻酸鈉溶于60-80°C水，制備成2-3g/ml (優(yōu)選2.4g/ml)的海藻酸鈉水溶解后，加入沸石和碳酸鈣，其中沸石為l_2g/ml，碳酸鈣l_2g/ml，攪拌混合均勻，制成混合包埋劑；
[0010](3)交聯(lián)劑的配制:將氯化鈣溶解于飽和硼酸溶液中，于4°C冰箱中冷卻備用，其中氯化鈣2-4g/ml飽和硼酸；
[0011](4) 一次交聯(lián):待步驟(2)所制混合包埋劑冷卻至35°C _40°C，與步驟(1)所制的光合細菌濃縮液以5:1 (最佳包埋比)的體積比混合制成菌膠混合液，放入35°C _40°C恒溫水浴中，通過蠕動泵壓力傳送到12號針頭的造粒器中，通過調節(jié)流速，制成直徑為3-5_的顆粒，從IOcm高處滴入步驟(3)的氯化鈣的飽和硼酸溶液中，在4°C冰箱中固定Ih后；
[0012](5) 二次交聯(lián):，用氫氧化鈉溶液將一次交聯(lián)后的交溶液pH值調到8-9再繼續(xù)在4 °C冰箱中固定化20-24h ；
[0013](6)洗滌:收獲的顆粒用無菌水洗滌，保存在0.85%生理鹽水中。
[0014]將上述制備的固定化光合細菌用于抑藻。
[0015]抑藻實驗:將擴大培養(yǎng)IOd后的藻液混勻后分裝入500mL的三角瓶中，每瓶裝200-300mL的等濃度藻液，加入9_36g步驟(6)得到的固定化光合細菌，以不加光合細菌和相同菌量的游離光合細菌作為對照，搖勻后培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為(25 ± I) V,光暗比為12L: 12D，光照強度為20001uX。每天定時搖動2~3次，隨機改變三角瓶的位置。抑藻效果相對抑制率表示，根據(jù)藻細胞密度計算。藻類的相對抑制率計算公式如下:
[0016]IR (%) =(1 — N/N0) X 100
[0017]其中，IR為相對抑制率，N為加入光合細菌實驗組的藻細胞密度(cell ? mL—1)，N0為對照組藻密度(celI
[0018]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比顯著優(yōu)點是:
[0019]1.本發(fā)明固定化方法中，以海藻酸鈉為主劑，同時加入沸石和碳酸鈣2種輔劑制成復合型包埋劑。該復合包埋劑由于利用了 2中輔劑特性，成球過程中不粘連，分散了海藻酸鈉的粘度，不易產(chǎn)生氣泡，增加了包埋體密度，且操作簡便；
[0020]2.沸石顆粒表面凹凸不平，具有很多大小均勻的孔穴，且內部有堿金屬和堿土金屬的含水鋁硅酸鹽類，有利于離子進入顆粒內部提供細菌生長；
[0021]3.碳酸鈣的加入一方面可以增加固定化光合細菌的通透性、細胞活性、顆粒的比重，另一方面碳酸鈣的加入使顆粒內部微環(huán)境變?yōu)槲A性，有利于光合細菌生長；
[0022]4.碳酸鈣的加入相對增加了鈣離子的濃度，加大了海藻酸鈉與鈣離子螯合作用，增加了固定化光合細菌的機械強度；
[0023]5.本發(fā)明處理方法通過二次交聯(lián)，減少硼酸對光合細菌的毒性作用；
[0024]6.本發(fā)明處理方法中采用的固定化光合細菌方法不含有害物質，不會對水體造成二次污染；
[0025]7.本發(fā)明利用的原料來源豐富，生產(chǎn)工藝簡單，容易加工，價格低廉，易于大范圍推廣；
[0026]8.本發(fā)明所制成的固定化光合細菌包埋體用于抑制藻類生長可以克服傳統(tǒng)投加游離態(tài)光合細菌的弱點，數(shù)量穩(wěn)定，在靜水條件下不易被其他生物所吞噬，且增加了吸附和生長繁殖的載體有助于其穩(wěn)定地長期發(fā)揮功效。
[0027]同時本發(fā)明公開了其抑制富營養(yǎng)化水體中藻類的應用。本發(fā)明所提出的固定化方法適應了光合細菌的生理特性，能使其維持良好的生理活性；提供的最佳包埋比例使顆粒的密度、機械強度、含水率、傳質性、細胞活性和膨脹性都能維持在良好的水平；其制作工藝簡單，成本低，易于大范圍推廣；其抑藻效果顯著優(yōu)于游離光合細菌，不產(chǎn)生二次污染，為富營養(yǎng)化的治理提供一條有效的途徑。
【具體實施方式】
[0028]下面通過具 體實施方式來進一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。
[0029]實施例1
[0030](I)光合細菌濃縮液的制備:將光合細菌培養(yǎng)至對數(shù)期(0D_值為1.5-1.8)，將光合細菌懸液在8000-10000r ? mirT1轉速下離心8_12min，用生理鹽水洗凈沉淀后再離心，如此重復3次。用生理鹽水配成OD68tl為2.3-2.6的濃縮液；
[0031](2)包埋劑的配制:將7.0-7.5(g)(最佳量7.2g)海藻酸鈉用300mL溫度為60_80°C蒸餾水溶解后，分別加入3-3.5 (g)(最佳量3.2g)的沸石和碳酸鈣，攪拌混合均勻，制成混合包埋劑；
[0032](3)交聯(lián)劑的配制:將12g (最佳量)的氯化鈣溶解于600mL (最佳體積)飽和硼酸溶液中，于4 °C冰箱中冷卻備用；
[0033](4)一次交聯(lián):待步驟(2)所制混合包埋劑冷卻至35_40°C，與步驟(1)所制的光合細菌濃縮液以5:1 (最佳包埋比)的體積比混合制成菌膠混合液，放入40°C恒溫水浴鍋中，通過蠕動泵壓力傳送到12號針頭的造粒器中，通過調節(jié)流速，制成直徑為3-5_的顆粒，從IOcm高處滴入交聯(lián)劑中，在4°C冰箱中固定Ih后；
[0034](5)二次交聯(lián):一次交聯(lián)后，用氫氧化鈉溶液將交聯(lián)劑pH值調到8-9再繼續(xù)在4°C冰箱中固定化20-24 (h)；
[0035](6)洗滌:收獲的顆粒用無菌水洗滌，保存在0.85%生理鹽水中
[0036](7)抑藻實驗:
[0037]以銅綠微囊藻為受試藻種:將擴大培養(yǎng)IOd的銅綠微囊藻混勻后分裝入500mL的三角瓶中，每瓶裝250mL的等濃度藻液(初始藻細胞濃度為8.0X IO5Cell ? mL—1)，分別加入9、18、27、36g固定化后的光合細菌載體，以不加光合細菌和相同菌量的游離光合細菌作為對照，搖勻后培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為(25±1) °C,光暗比為12L: 12D,光照強度為20001UX。每天定時搖動2~3次，隨機改變三角瓶的位置。抑藻效果由藻液濃度表示，本發(fā)明結果表明，試驗12天后，游離光合細菌對銅綠微囊藻抑制率為26.81%，不同投加量的固定化后的光合細菌的抑制率分別為55.38% (9g)、83.55% (18g)、89.37% (27g)、89.77%(36g)。綜合考慮技術需求和經(jīng)濟性，9g固定化光合菌顆粒的投加量為最優(yōu)，即36g ? L'[0038] 以蛋白核小球藻為受試藻種:將擴大培養(yǎng)IOd的銅綠微囊藻混勻后分裝入500mL的三角瓶中，每瓶裝250mL的等濃度藻液(初始藻細胞濃度為8.0X 105cell ?mL—1)，分別加A 9、18、27、36 (g)固定化光合細菌，以不加光合細菌和相同菌量的游離光合細菌作為對照，搖勻后培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為(25±1) °C,光暗比為12L: 12D,光照強度為20001UX。 每天定時搖動2~3次，隨機改變三角瓶的位置。抑藻效果由藻液濃度表示，本發(fā)明結果表明，試驗12天后，游離光合細菌對蛋白核小球藻的抑制率為13.53%，固定化光合細菌對其的抑制率分別為 25.62% (9g)、35.54% (18g)、59.5% (27g)、57.02% (36g)。綜合考慮技術需求和經(jīng)濟性，投加27 (g)固定化后的光合菌顆粒為最優(yōu)，即108g ? L'
【權利要求】
1.一種復合型包埋劑用于光合細菌的固定方法，其特征在于，具體包括以下步驟: (1)光合細菌濃縮液的制備:將光合細菌培養(yǎng)至對數(shù)期，使得OD68tl值為1.5-1.8，將光合細菌懸液在8000-10000r ? HiirT1轉速下離心8_12min，用生理鹽水洗凈沉淀后再離心，如此重復3次，用生理鹽水配成OD68tl為2.3-2.6的濃縮液； (2)包埋劑的配制:將海藻酸鈉溶于60-80°C水，制備成2-3g/ml的海藻酸鈉水溶解后，加入沸石和碳酸1丐，其中沸石為l-2g/ml,碳酸|丐l_2g/ml,攪拌混合均勻，制成混合包埋劑； (3)交聯(lián)劑的配制:將氯化鈣溶解于飽和硼酸溶液中，于4°C冰箱中冷卻備用，其中氯化鈣2-4g/ml飽和硼酸； (4)一次交聯(lián):待步驟(2)所制混合包埋劑冷卻至35°C _40°C，與步驟(1)所制的光合細菌濃縮液以5: 1的體積比混合制成菌膠混合液，放入35°C _40°C恒溫水浴中，通過蠕動泵壓力傳送到12號針頭的造粒器中，通過調節(jié)流速,制成直徑為3-5_的顆粒,從IOcm高處滴入步驟(3)的氯化鈣的飽和硼酸溶液中，在4°C冰箱中固定Ih后； (5)二次交聯(lián):，用氫氧化鈉溶液將一次交聯(lián)后的交溶液pH值調到8-9再繼續(xù)在4°C冰箱中固定化20-24h ； (6)洗滌:收獲的顆粒用無菌水洗滌，保存在0.85%生理鹽水中。
2.按照權利要求1的方法，其特征在于，步驟(2)海藻酸鈉溶液的濃度為2.4g/ml。
3.按照權利要求1或2的方法制備得到的固定化光合細菌。
4.按照權利要求1或2的方法制備得到的固定化光合細菌用于抑藻。
【文檔編號】A01P13/00GK103614360SQ201310576832
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權日:2013年11月18日
【發(fā)明者】吳珊, 任麗艷, 厲智成 申請人:北京工業(yè)大學