一種樺褐孔菌人工栽培方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種樺褐孔菌人工栽培方法，1)樺褐孔菌菌株的分離、純化；2)選用無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基、無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基，以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基，黃豆粉為氮源，碳氮比20：1，pH為7，溫度為30℃；3)樺褐孔菌人工馴化栽培。本發(fā)明可形成樺褐孔菌子實(shí)體。
【專利說明】一種枠褐孔菌人工栽培方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種樺褐孔菌人工栽培方法。
【背景技術(shù)】
[0002]樺褐孔菌具有很高的藥用價值。(1)抗腫瘤、抗癌作用:樺褐孔菌的提取物對肝癌、肺癌、胃癌、宮頸癌等均有治療效果，其多糖與氨基酸對機(jī)體免疫系統(tǒng)可以起到保護(hù)與促進(jìn)的作用，提高人體的免疫力，維持人體正常細(xì)胞的生命活力與新陳代謝。(2)防治糖尿病:其多糖類產(chǎn)物葡聚糖、雜多糖和蛋白復(fù)合物)可以增強(qiáng)胰島細(xì)胞的功能、平衡人體內(nèi)的糖代謝過程，從而降低血糖，并可以維持3~48小時。(3)防治艾滋病、抗病毒作用:提取物組分中β，3-D-葡聚糖對SARS類傳染性病毒有明顯的抑制作用，而水溶性成分中的高相對分子質(zhì)量的木質(zhì)素衍生物可以阻抗HIV-1蛋白酶的活性進(jìn)而用于治療艾滋病。(4)抗氧化抗衰老:樺褐孔菌中的兒茶酚具有強(qiáng)抗氧化作用，并對基因有保護(hù)作用。(5)其他作用:芬蘭、加拿大等歐美國家應(yīng)用樺褐孔菌醇高標(biāo)準(zhǔn)提取物具備增強(qiáng)肌體免疫的功效來治療流行性感冒。樺褐孔菌是血液的清潔劑，對食物中毒、胃腸功能紊亂、肝炎、腎炎、高血壓有明顯的治療作用，還能增加食欲、緩解疼痛和改善過敏性體質(zhì)，市場上一直都有樺褐孔菌特制的茶和藥用酒，還把它制成氣霧劑用于治療各種疾病。
[0003]隨著對大型藥食同源真菌中活性物質(zhì)研究的深入，樺褐孔菌的藥用價值、營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值已經(jīng)引起人民的廣泛關(guān)注，成為各個行業(yè)的熱門開發(fā)領(lǐng)域。多學(xué)科綜合開發(fā)應(yīng)在基礎(chǔ)理論、臨床應(yīng)用、開發(fā)產(chǎn)品等不同領(lǐng)域同時進(jìn)行研究。樺褐孔菌多糖、三萜、多酚類天然抗癌藥物物質(zhì)可以作為保健藥品、健康食品、保健飲料、微膠囊的主要原料，其天然色素可在食品添加劑、茶葉的深加工、化妝品行業(yè)中應(yīng)用，另外，樺褐孔菌在煙草行業(yè)、紡織行業(yè)、飼料行業(yè)等邊緣學(xué)科的研究及產(chǎn)品開發(fā)也將具有十分廣闊的應(yīng)用前景。
[0004]野生樺褐孔菌價格極為昂貴緣于樺樹林中此木腐菌的比例大約只有萬分之一，由于大量的采集，使野生樺褐孔菌資源日趨枯竭，因此樺褐孔菌的栽培技術(shù)成為重要的研究領(lǐng)域。
[0005]目前，由于人們對樺褐孔菌的子實(shí)體的生長發(fā)育機(jī)制認(rèn)識不足，人工創(chuàng)造的條件與微生物在大自然中的環(huán)境差別很大，因此造成了人工馴化和栽培的一定困難，關(guān)于樺褐孔菌菌核的人工馴化已經(jīng)具有一定的成果與規(guī)模。但迄今為止，尚無形成子實(shí)體的先例，樺褐孔菌栽培技術(shù)還存在一些急需要攻克的難題，現(xiàn)有技術(shù)只能促進(jìn)菌核的產(chǎn)生，而不形成子實(shí)體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供一種樺褐孔菌人工栽培方法，優(yōu)化了栽培配方，根據(jù)野生樺褐孔菌的生物性特特性，利用變溫處理，成功促進(jìn)子實(shí)體的形成。其具體技術(shù)方案為:
[0007]一種樺褐孔菌人工栽培方法，包括如下步驟:[0008]1)樺褐孔菌菌株的分離、純化:先用1: 14的次氯酸鈣上清液對子實(shí)體進(jìn)行表面消毒，再用高溫滅菌的鑷子取中間5mm左右小方塊組織，將其移接于PDA培養(yǎng)基平板的中央，切取組織時，接種Id后置于25°C恒溫暗室中培養(yǎng)，隨時檢查菌株生長情況，及時排除被污染的平板，待菌絲長滿平板后，再轉(zhuǎn)入PDA斜面試管培養(yǎng)基上保存純種，長滿后然后置于4°C的冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0009]2)選用無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基、無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基，以鹿糖為碳源的培養(yǎng)基，黃豆粉為氮源，碳氮比20: 1，ρΗ為7，溫度為30°C ;
[0010]3)樺褐孔菌人工馴化栽培:PDA培養(yǎng)基上，所述培養(yǎng)基為樺樹木屑78%、黃豆粉20%、石膏1%、蔗糖I %及65 %水，在35°C條件下培養(yǎng)15d，將其放在室溫條件下培養(yǎng)20d，培養(yǎng)基上中心偏右部位長出了樺褐孔菌子實(shí)體。同栽培培養(yǎng)料配方中，在35°C溫箱下培養(yǎng)30天，室溫下不開口放置20-50d，在培養(yǎng)袋口及基部同樣產(chǎn)生了子實(shí)體。
[0011]進(jìn)一步優(yōu)選，所述樺褐孔菌菌株的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明可形成樺褐孔菌子實(shí)體，規(guī)模化生產(chǎn)后，將產(chǎn)生明顯的經(jīng)濟(jì)效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是不同氮源對樺褐孔菌生長情況，圖1a為黃豆粉、圖1b為酵母粉、圖1c為蛋白胨、圖1d為甘氨酸、圖1e為硫酸銨、圖1f為無氮對樺褐孔菌生長的影響；
[0014]圖2是不同碳氮比對樺褐孔菌生長情況，圖2a為碳氮比5: 1、圖2b為10: 1、圖2c為20: 1、圖2d為30: 1、圖2e為40: 1、圖2f為50: I對樺褐孔菌生長的影響；
[0015]圖3是不同酸堿度對樺褐孔菌生長情況；圖3a_圖3f依次為pH3、8、5、6、7及4對樺褐孔菌生長的影響；
[0016]圖4是人工培養(yǎng)基上產(chǎn)生的子實(shí)體。圖4a-圖4c依次為子實(shí)體形成情況、子實(shí)體形成情況、菌絲生長情況。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0018]試驗(yàn)材料于2011年與2012年5月采自于黑龍江省大興安嶺呼中自然保護(hù)區(qū)野生樺褐孔菌子實(shí)體呈黑褐色不規(guī)則瘤狀，表面堅(jiān)硬，質(zhì)地硬脆，子實(shí)體外部較干，用斧子砍開切面處手感濕潤。菌肉木栓質(zhì)，有模糊不清的環(huán)紋，淡黃褐色。PDA固體平板中培養(yǎng)7天的菌落上的菌絲濃厚、整齊，從中心向四周生長；菌落中心顏色呈黃褐色，從中心至邊緣黃色逐漸變淡，外圍純白色；平板背面菌落有明顯的淺褐色環(huán)紋。如圖3f所示；經(jīng)分離純化的菌種轉(zhuǎn)至PDA斜面上,培養(yǎng)5天滿管,菌落初期純白色,后逐漸變?yōu)闇\黃色,逐漸變黃褐色。菌種接到PDA液體培養(yǎng)基，在柜式恒溫?fù)u床中轉(zhuǎn)速120rpm，28°C下培養(yǎng)7天，菌球邊緣呈尖刺狀；搖瓶壁上的菌絲帶變粗，部分被搖落到液體中；搖瓶中液體顏色由淡黃逐漸變?yōu)樯詈稚撀涞木z結(jié)合為圓形或卵形菌絲球。挑取平板的營養(yǎng)菌絲體壓片后在光學(xué)顯微鏡下觀察，菌絲呈半弧形，透明，絲狀。營養(yǎng)菌絲多分枝，可見菌絲橫隔，無鎖狀聯(lián)合。野生菌株的ITS-rDNA經(jīng)測序獲得的目的片段長度為761bp，包含18S rDNA部分序列，306bp ITSl序列全長，160bp5.8S rDNA全長，243bp ITS2全長，以及部分28S rDNA序列。在GeneBank上經(jīng)BLAST比對,與Inonotus obliquus的ITS-rDNA序列有99%的相似性，結(jié)合形態(tài)觀察，確定所采的野生菌種為樺褐孔菌。序列已提交NCBI上的EST庫，其在GenBank上的登陸號為:KC312697(G1:461725870)。
[0019]通過BLAST軟件的分析，對樺褐孔菌菌株測得的序列和GenBank中下載的ITS-rDNA序列進(jìn)行聚類分析，本發(fā)明采集的菌種(targeted sequence)與Inonotusobliquus isolate FS656163 以及 Inonotus obliquus strain MDJCBS88 同源性最近，這兩個為樣褐孔菌不同菌株，而與 Inonotus linteus strainPL08121 和 Inonotus rickiiisolate PF241親緣性最遠(yuǎn)，都屬于纖孔菌屬。)樺褐孔菌采樣地點(diǎn)為白樺天然成、過熟林內(nèi)，在東北林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室分離獲得。菌種分離采用常規(guī)組織分離技術(shù)，先用I: 14的次氯酸鈣上清液對子實(shí)體進(jìn)行表面消毒。再用高溫滅菌的鑷子取中間5_左右小方塊組織，將其移接于PDA培養(yǎng)基平板的中央。切取組織時，接種Id后置于25°C恒溫暗室中培養(yǎng)，隨時檢查菌株生長情況，及時排除被污染的平板。待菌絲長滿平板后，再轉(zhuǎn)入PDA斜面試管培養(yǎng)基上保存純種，長滿后然后置于4°C的冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0020]無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基:甘氨酸lg，KH2PO40.5g，硫酸鎂0.25g，瓊脂10g，水500ml。
[0021]無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂0.25g，瓊脂10g，水500ml。
[0022]碳源:根據(jù)所購買實(shí)驗(yàn)藥品說明書上得知葡萄糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉含碳量分別為40%、42.1 %、40%、42.1 %、44.4%。用葡萄糖，麥芽糖，果糖，蔗糖，可溶性淀粉作為碳源，分別IOg,9.5g, IOg,9.5g,9.0lg加入無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，另設(shè)一個無糖作對照，重復(fù)6次共36處理，在25°C，黑暗條件下，采用平板培養(yǎng)法，在培養(yǎng)皿中央用0.5mm打孔器定量接種，在25°C恒溫箱中倒置培養(yǎng)。接種后第3天，用十字交叉法每24個小時記錄菌落生長直徑，并注意菌絲顏色、菌苔厚度、菌落邊緣特征，此后對菌絲生長速度采用Spssll.5軟件中Dunca檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，見表1_2.[0023]氮源:根據(jù)所購買實(shí)驗(yàn)藥品說明書上得知甘氨酸、酵母浸粉、蛋白胨、硫酸銨的含氮量分別為18.65%、8~9%、14.5%、21%。黃豆粉和玉米粉蛋白質(zhì)含量為32.7%和8.7%。根據(jù)凱氏定氮法，在任何生物樣品中，每克氮相當(dāng)于6.25g蛋白質(zhì)，可以計(jì)算出黃豆粉與玉米粉的氮含量為5.232%與1.392%。在25°C，黑暗條件下，用分析天平分別稱取酵母粉1.1Og,黃豆粉1.7823g,蛋白胨0.6431g,甘氨酸0.5g,硫酸銨0.444g,加入無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，另設(shè)一個無氮作對照。接種與測量方法同上文碳源處理實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1-3。
[0024]碳氮比:在25°C、無光條件下，固定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，變換黃豆粉的含量，配制成C/N比分別為5: 1,10: 1,20: 1,30: 1,40: 1,50: I的培養(yǎng)基。每處理用0.5mm打孔器定量分別接種接于不同碳氮比的培養(yǎng)基中，重復(fù)6次共36個處理，接種與測量方法同上文碳源處理實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1-4。
[0025]pH值:在培養(yǎng)基PDA上，用磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值分別為:3、4、5、6、7、8，重復(fù)6次共36個處理，接種與測量方法同上文碳源處理實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 1-5。
[0026]溫度:在培 養(yǎng)基PDA上，接入樺褐孔菌，分別設(shè)5°C，10°C，15°C，20 V，25°C，30 V，35°C，重復(fù)7次共42個處理，接種與測量方法同上文碳源處理實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1-6。
[0027]篩選母種:將不同采集地點(diǎn)或不同采集時間的菌株進(jìn)行純化、擴(kuò)大培養(yǎng)以備用。在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行接種，方法同上文碳源處理實(shí)驗(yàn)，結(jié)果測量也如上文碳源處理實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1-6。
[0028]培養(yǎng)料篩選:母種、原種培養(yǎng)基均采用常規(guī)PDA培養(yǎng)基；栽培種使用篩選母種實(shí)驗(yàn)中得到的活性好的兩個菌株，取l_2cm長的其PDA斜面作為栽培種，以白樺樹木屑為主料，黃豆粉、玉米粉、白砂糖、石膏、石灰等為輔料按不同配比成栽培種培養(yǎng)料，進(jìn)行栽培袋培養(yǎng)料配方篩選，各配方組成和編號見表1-1。將主料和輔料常規(guī)拌料裝袋，選用規(guī)格為17X33cm的聚乙烯折角袋，裝袋后置于高壓滅菌鍋(121°C )中滅菌120min。每個菌株的每個配方30個處理，共計(jì)180個菌袋。接種后置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，定時觀察菌袋情況，隨時清理出被污染的菌袋，待菌絲定殖后觀察菌絲生長情況，菌核出現(xiàn)大小、密度、個數(shù)。按數(shù)據(jù)分析及長勢情況選擇最好的培養(yǎng)料配方進(jìn)行下一步馴化研究。
[0029]表1培養(yǎng)料組分(干料％ )
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種樺褐孔菌人工栽培方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)樺褐孔菌菌株的分離、純化:先用1:14的次氯酸鈣上清液對子實(shí)體進(jìn)行表面消毒，再用高溫滅菌的鑷子取中間5_左右小方塊組織，將其移接于PDA培養(yǎng)基平板的中央，切取組織時，接種I1d后置于25°C恒溫暗室中培養(yǎng)，隨時檢查菌株生長情況，及時排除被污染的平板，待菌絲長滿平板后，再轉(zhuǎn)入PDA斜面試管培養(yǎng)基上保存純種，長滿后然后置于4°C的冰箱中保存?zhèn)溆茫? 2)選用無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基、無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基，以鹿糖為碳源的培養(yǎng)基，黃豆粉為氮源，碳氮比20:1，pH為7，溫度為30°C ； 3)樺褐孔菌人工馴化栽培:PDA培養(yǎng)基上，所述培養(yǎng)基為樺樹木屑78%、黃豆粉20%、石膏1 %、蔗糖1 %及65%水，在35°C條件下培養(yǎng)15d，將其放在室溫條件下培養(yǎng)20d，培養(yǎng)基上中心偏右部位長出了樺褐孔菌子實(shí)體，在35°C溫箱下培養(yǎng)30天，室溫下不開口放置20-50d,在培養(yǎng)袋口及基部產(chǎn)生了子實(shí)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樺褐孔菌人工栽培方法，其特征在于，所述樺褐孔菌菌株的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【文檔編號】A01G1/04GK103891523SQ201310595655
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年11月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月16日
【發(fā)明者】董愛榮, 劉雪峰 申請人:東北林業(yè)大學(xué)