平邑甜茶無融合生殖MhSERK4基因植物表達(dá)載體構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種平邑甜茶無融合生殖MhSERK4基因植物表達(dá)載體構(gòu)建方法與應(yīng)用，本發(fā)明所構(gòu)建的表達(dá)載體pBI121-MhSERK4是由MhSERK4基因插入到PGM-T，經(jīng)XbaI和SmaI雙酶切后連接到pBI121的XbaI和SmaI位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。該植物表達(dá)載體用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，MhSERK4在CaMV35S啟動子的啟動下表達(dá)，對植物的生殖發(fā)育過程產(chǎn)生調(diào)控作用，使植物不經(jīng)過生殖細(xì)胞的融合可以正常產(chǎn)生種子，達(dá)到無融合生殖的作用。
【專利說明】平邑甜茶無融合生殖MhSERK4基因植物表達(dá)載體構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及蘋果屬平邑甜茶無融合生殖相關(guān)MhSERK4基因表達(dá)載體和構(gòu)建方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]無融合生殖是發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的重要科學(xué)問題。與有性生殖獲得的種子相比，無融合生殖后代的遺傳背景與母本一致，不發(fā)生性狀分離，在植物育種中，無融合生殖可以固定雜種優(yōu)勢；對于一些無性繁殖的植物，無融合生殖產(chǎn)生無性種子可以克服無性繁殖的不便，避免長期營養(yǎng)繁殖造成的親本退化；因此，有關(guān)植物生殖機(jī)理方面的研究一直是生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。
[0003]平邑甜茶(Malushupehensis Rehd.var.pingyiensis Jiang)是薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)湖北海棠(Malus hupehensis (Pamp.) Rehd.)的一個變種，也是典型的無融合生殖型三倍體植物。主產(chǎn)于山東省平邑縣蒙山白云巖和惡峪一帶，小葉呈紅色，似茶葉故稱平邑甜茶。平邑甜茶是蘋果的優(yōu)良砧木之一，也是我國特有的植物資源，其耐澇性和耐鹽性較強(qiáng)，在生產(chǎn)上具有重要的應(yīng)用價值。同時，平邑甜茶具有高度的無融合生殖能力，與西府海棠、山定子等其它蘋果砧木相比，其實(shí)生苗整齊一致，個體差異小，遺傳穩(wěn)定，因此，平邑甜茶是無融合生殖型矮化砧木育種的重要母本材料。多年來，平邑甜茶的相關(guān)研究主要集中在遺傳育種、胚胎發(fā)育、抗性等方面；隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在基因克隆、功能鑒定以及生理 功能等方面開展了無融合生殖分子機(jī)理和遺傳機(jī)理方面的研究，并通過基因工程方法對其生殖機(jī)理和功能進(jìn)一步加以驗(yàn)證。
[0004]近年來,對植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)類受體蛋白激酶(Somatic embryogenesisreceptor-like kinases, SERKs)類基因的研究表明:在植物的生長發(fā)育過程中，SERK基因及其家族成員在小孢子發(fā)育、體胚發(fā)生、激素感應(yīng)、無融合生殖及抗病抗逆反應(yīng)中都具有一定的功能。課題組在前期研究過程中，在平邑甜茶子房中已分離獲得無融合生殖相關(guān)MhSERK4基因片段，該序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對，預(yù)測為體胚發(fā)生類受體蛋白激酶基因(本發(fā)明將其命名為MhSERK4)片段，而MhSERK4基因的功能是什么，是否可以使普通植物也具有無融合生殖特性，于是本發(fā)明將通過MhSERK4基因植物表達(dá)載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化，希望獲得該基因的具體功能，以便能夠通過基因工程手段獲得更好的品種。
[0005]對于蘋果屬平邑甜茶無融合生殖相關(guān)MhSERK4基因，目前還未見其載體構(gòu)建及其基因功能的報道，而本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該基因在植物無融合生殖過程中可以使植物不經(jīng)過兩性生殖細(xì)胞的融合產(chǎn)生可育的種子，可以為深入研究無融合生殖的遺傳機(jī)制和分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于為蘋果屬平邑甜茶無融合生殖基因調(diào)控途徑的完善，提供一個新的平邑甜茶無融合生殖相關(guān)MhSERK4基因。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供該蘋果屬平邑甜茶無融合生殖相關(guān)MhSERK4基因的植物表達(dá)載體pBI121-MhSERK4。
[0008]本發(fā)明的第三個目的在于提供平邑甜茶無融合生殖基因MhSERK4的重組植物表達(dá)載體pBI121-MhSERK4的構(gòu)建方法。
[0009]本發(fā)明提供的平邑甜茶無融合生殖相關(guān)MhSERK4基因，其核苷酸序列為SEQ IDN0.1所示，該基因全長1836bp。
[0010]本發(fā)明提供的蘋果屬平邑甜茶無融合生殖相關(guān)MhSERK4基因的植物表達(dá)載體PB 1121 -MhSERK4，其由無融合生殖相關(guān)基因MhSERK4開放閱讀框序列與植物表達(dá)載體PBI121 構(gòu)成。
[0011]本發(fā)明提供的平邑甜茶無融合生殖基因MhSERK4的重組植物表達(dá)載體pBI121-MhSERK4的構(gòu)建方法包括如下步驟:
[0012]I) MhSERK4基因全長序列擴(kuò)增
[0013]提取平邑甜茶發(fā)育時期的子房總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈；設(shè)計引物擴(kuò)增MhSERK4基因:
[0014]上游引物S1:5’ -ATGACGTCTTCCACCTCTGTTTC-3’
[0015]下游引物S2:5 ’ -TCATCTAGGACCGGACAACTCAT-3 ’
[0016]以反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA·為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物連接到PGM-T載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，篩選并測序獲得MhSERK4基因全長序列。
[0017]2)植物表達(dá)載體pBI121_MhSERK4的構(gòu)建
[0018]根據(jù)MhSERK4的開放閱讀框序列設(shè)計一對引物，并分別引入酶切位點(diǎn)XbaI和SmaI序列:
[0019]上游引物MhSERM-Xba1:5’ -GGTCTAGAATGACGTCTTCCACCTCTGTTTC-3，
[0020]下游引物MhSERM-SmaI: 5，-ACCCCGGGTCATCTAGGACCGGACAACTCAT-3 ’
[0021 ] 再以步驟(1)中的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物連接到PGM-T載體得到重組質(zhì)粒PGM-T-MhSERK4，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞；提取質(zhì)粒PGM_T_MhSERK4和pBI121，并用XbaI和SmaI雙酶切后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，篩選并測序驗(yàn)證，植物表達(dá)載體pBI121_MhSERK4構(gòu)建成功。
[0022]本發(fā)明提供平邑甜茶無融合生殖MhSERK4基因在普通植物中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明根據(jù)已獲得的平邑甜茶無融合生殖相關(guān)MhSERK4基因，通過構(gòu)建MhSERM基因植物表達(dá)載體，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制無融合生殖新品種，提高無融合生殖能力，應(yīng)用于植物品種遺傳改良。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1: MhSERK4瓊脂糖凝膠電泳分析；
[0025]M:Marker;MhSERK4 基因 cDNA 全長序列
[0026]圖2: pGM-MhSERK4 質(zhì)粒 XbaI 和 SmaI 雙酶切；
[0027]M:左 Ikb,右 IOObp DNAmarker ;泳道 1-4:pBI121 表達(dá)載體；泳道 5_12:平邑甜茶
[0028]圖3:pBI121_MhSERK4表達(dá)載體PCR菌液鑒定結(jié)果檢測圖；[0029]M:DL2000DNAmarker ;泳道1:陰性對照泳道2_5:平邑甜茶
[0030]圖4:植物表達(dá)載體pBI121_MhSERK4構(gòu)建方法示意圖；
[0031]圖5:轉(zhuǎn)基因煙草植株與對照植株比較；
[0032]圖6:PCR鑒定煙草轉(zhuǎn)基因植株MhSERK4基因表達(dá)；
[0033]M:100bp Marker ;泳道:1清水，2未轉(zhuǎn)化對照植株，3質(zhì)粒陽性對照；A:4_9是MhSERK4轉(zhuǎn)化煙草植株
【具體實(shí)施方式】
[0034]實(shí)施例1:平邑甜茶無融合生殖相關(guān)MhSERK4基因的克隆:
[0035]1、總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄成cDNA:
[0036](I)總RNA的提取使用TIANGEN生化科技公司的RNApr印pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(DP441)獲得，具體操作見試劑盒說明書。
[0037](2)反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成利用寶生物工程(大連)有限公司的PrimeScript?RTreagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA,作為PCR模板備用。
[0038]2.利用Primer Primer5.0軟件分析設(shè)計引物擴(kuò)增MhSERK4 ；
[0039]上游引物S1:5 ’ -ATGACGTCTTCCACCTCTGTTTC-3，
[0040]下游引物S2:5，-TCATCTAGGACCGGACAACTCAT-3 ’
[0041]以提取的子房cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0042]反應(yīng)體系:25μ L 體系，取 I μ L cDNA 加入 Taq DNA 聚合酶 0.25 μ L, 10XPCRBuffer2.5 μ L, dNTPs (2.5mmol.L_1)2.0μ L,正反向引物各 lyL，最后用 ddH20 補(bǔ)足至25 μ L ；
[0043]反應(yīng)程序:95V5min ；94°C 40s, 58。。40s, 72V 2min, 30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；
[0044]凝膠電泳:將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)特異條帶，如圖2所示,M為200bp Marker ;1為擴(kuò)增條帶,可見在1800bp左右有一條特異條帶?？寺?、測序:使用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接至pGM_T載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞T0P10 (TIANGEN),經(jīng)PCR篩選，將重組陽性質(zhì)粒送至北京華大基因科技公司測序；經(jīng)測序后結(jié)果說明成功獲得MhSERK4基因序列。該MhSERK4基因的核苷酸序列為:
[0045]MhSERK4(1836bp)
[0046]5，-ATGACGTCTTCCACCTCTGTTTCCGTCTGGCTGATTCTGCTGTTTGGCTTCTTTCACCTCCATAAGCTCGCTGCCAACGTCGAAGGTGACGCATTGAACGCGTTGAAGACCAATCTAGCTGATCCAAATAATGTTCTGCAGAGTTGGGATCCGACTCTCGTCAATCCCTGCACCTGGTTTCATGTCACTTGTAATAGCGAAAACAGCGTTACTCGAGTTGATCTTGGCAATGCCAATCTCTCTGGTCAATTGGTTGCACAGCTTGGTGTGCTTTCCAAGTTGCAGTACTTGGAACTTTACAGTAATAACATAACTGGAACCATTCCCGAAGAGCTTGGGGGTTTGGCAGACTTGGTCAGTTTGGATCTTTACTTGAACAAGTTACATGGTAACATTC CAGCGGCACTTGGCAACCTTGCAAAACTACGTTTCCTGCGTCTCAACAACAACACCTTGTCAGGGACTATTCCCTTGACTTTGACTAACATCCAATCATTGCAAGTCCTGGATCTTTCAAATAACAATCAGACAGGGGATATTCCAGTCAATGGATCTTTTTCACTTTTTACTCCCATCAGTTTTGCCAATAATCCTCTGAAACCACTTCCACCCTCTCCACCTCCTCCTGTTTCTCCGAACCCACCAAGTTCTCCAGGTACCACTGCTACTGGGGCTATTGCTGGAGGGGTTGCTGCTGGTGCTGCTTTGCTATTTGCTGCACCTGCAATTGCCCTTGCTTATTGGCGACGAAGAAAACC
ACAGGATCATTTCTTTGATGTACCTGCTGAGGAGGATCCAGAAGTTCATTTAGGACAGCTCAAAAGGTTTTCTTTGC
GCGAACTACAAGTTGCAACGGATACCTTTAGTAACAAAAATATTCTTGGTAGAGGTGGATTTGGTAAGGTTTATAAA
GGACGCTTAGCTGATGGAACTCTGGTTGCTGTAAAAAGACTTAAAGAGGAGAGAACCCAAGGTGGGGAGCTACAGTT
TCAAACAGAGGTTGAAATGATTAGCATGGCTGTCCACCGCAATCTGCTTCGTCTGCGTGGTTTTTGCATGACACCAA
CAGAAAGGCTGCTTGTATATCCTTATATGTCTAATGGAAGTGTGGCATCATGTTTAAGAGATCGTCCAGAAGGACAA
CCTGCACTTGATTGGCCAATAGGACAACGCATTGCGTTGGGATCTGCAAGAGGCCTTGCTTATTTACATGATCACTG
TGATCCAAAAATTATTCACCGTGATGTGAAAGCAGCAAACATATTGTTGGATGAGGAATTCGAAGCAGTTGTTGGAG
ACTTTGGGTTGGCTAAACTCATGGACTACAAGGATACACATGTTACCACAGCTGTACGTGGCACAATTGGTCATATA
GCACCAGAGTACCTTTCAACTGGAAAATCTTCCGAGAAAACTGATGTTTTTGGATACGGAGTCATGCTTCTTGAACT
CATCACTGGGCAGAGGGCTTTTGATCTTGCTCGGCTTGCGAATGATGATGATGTCATGTTACTTGATTGGGTCAAAG
GACTACTGAAAGATCGGAAGTTGGAAACACTTGTTGATGCTGATCTGAATGGAAATTATGTTGACGATCAAGTGGAG
CAGCTCATCCAAGTAGCTCTACTGTGCACACAAGGCACCCCAGGGGAACGACCCAAGATGTCAGAGGTTGTCCGGAT
GCTGGAAGGCGATGGTTTGGCTGAAAGATGGGAGGAGTGGCAAAAGGAGGAGGTGTTCCGCCAAGATTTCAACCCT
ATTCATCATCCAAGTACTACTTGGATCATAGACTCCACTTCTCATATTCCTCCGGATGAGTTGTCCGGTCCTAGATG
A-3，。
[0047]實(shí)施例2:蘋果屬平邑甜茶無融合生殖相關(guān)MhSERK4基因的重組植物表達(dá)載體pBI121-MhSERK4 的構(gòu)建
[0048]I主要試劑:質(zhì)粒提取試劑盒購自TIANGEN生化科技有限公司；T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶XbaI和SmaI購自大連寶生物工程有限公司；含質(zhì)粒pBI121的菌種由沈陽沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院提供。
[0049]2重組植物表達(dá)載體pBI 121_MhSERK4的構(gòu)建
[0050]2.1引物設(shè)計:根據(jù)目的基因MhSERK4開放閱讀框序列設(shè)計上下游引物，分別引入XbaI (TCTAGA)和 SmaI (CCCGGG)酶切位點(diǎn)，引物為:
[0051]上游引物MhSERK4-Xba1:5’ -GTCTAGAATGACGTCTTCCACCTCTGTTTC-3’
[0052]下游引物MhSERM-SmaI: 5，-CCCGGGTCATCTAGGACCGGACAACTCAT-3 ’
[0053]2.2PCR擴(kuò)增:以實(shí)驗(yàn)例I中的cDNA第一鏈為模板，引物MhSERK4_XbaI和MhSERK4-SmaI 做 PCR 擴(kuò)增:體系為 25 μ L:取 I μ L cDNA 加入 Taq DNA 聚合酶 0.25 μ L,10XPCR Buffer2.5 μ L, dNTPs (2.5mmol.1^)2.0 μ L，正反向引物各 lyL，最后用 ddH20補(bǔ)足到 25 μ L ;反應(yīng)程序:95°C 5min ；94°C 40s, 58°C 40s, 72°C 2min,30 個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；
[0054]2.3電泳:將2.2擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)特異條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。
[0055]2.4TA克隆機(jī)票的重組載體PGM-T-MhSERM:將2.2中PCR產(chǎn)物電泳后用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶并連接至PGM-T載體得到重組載體PGM-T-MhSERM，然后轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR篩選，將含有重組載體PGM-T-MhSERM的陽性菌液送至北京華大生物科技有限公司測序；
[0056]2.5測序結(jié)果:與預(yù)期結(jié)果完全一致。
[0057]2.6重組植物表達(dá)載體pBI121-MhSERK4的構(gòu)建:將2.4含重組載體PGM-T-MhSERK4的陽性菌液進(jìn)行培養(yǎng)，并采取普通質(zhì)粒提取試劑盒的方法提取菌液中的重 組質(zhì)粒PGM-T-MhSERK4 ;將含有植物表達(dá)質(zhì)粒pBI121的菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，用同樣的方法提取 質(zhì)粒PBI121，將提取的PGM-T-MhSERK4質(zhì)粒和pBI121質(zhì)粒分別用Xbal和Smal限制性內(nèi) 切酶雙酶切，酶切后電泳，并切下PGM-T-MhSERK4質(zhì)粒的小片段和pBI121質(zhì)粒的大片段，利 用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。然后用NEB生物公司生產(chǎn)的T4DNA連接酶連接小片段和大片段 (連接體系為：小片段2. 7u L,大片段7u L, T4DNA連接酶1 u L，10XBuffer 1. 5UL, ddH20不 足至15yL)過夜連接，然后利用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10 ;PCR篩選陽性克隆，再進(jìn)行測 序驗(yàn)證，得到序列完全正確的重組表達(dá)載體pBI121-MhSERK4及含該重組表達(dá)載體的大腸 桿菌。
[0058]2. 7pBI121-MhSERK4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌：從2. 6中含pBI121_MhSERK4載體的 菌株中提取重組質(zhì)粒，用冷激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，轉(zhuǎn)化方法為：①去lOiiL質(zhì)粒DNA， 加入30-100 u L農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105，充分混勻，冰浴5min，轉(zhuǎn)入液氮冷凍lmin ?’② 迅速轉(zhuǎn)入37°C水浴5min后，加入800 u LYEP液體培養(yǎng)基(稱取胰蛋白胨lg，酵母浸粉lg， NaCIO. 5g,融解于100mL無菌水中，經(jīng)高溫高壓滅菌備用；下同）28°C, 150rpm預(yù)培養(yǎng) 4_5h，然后涂布于含有Kan (50mg. L-1)、Rif (50mg. L-1)的YEP固體平板上，28°C恒溫箱中 培養(yǎng)48h后可出現(xiàn)菌落；④挑取菌體做PCR鑒定，確定正確后保存于-70°C，即為植物遺傳 轉(zhuǎn)化的工程菌株。
[0059]實(shí)施例3 :植物表達(dá)載體pBI 121_MhSERK4的遺傳轉(zhuǎn)化
[0060]1普通煙草的培養(yǎng)：普通煙草種子經(jīng)過濃度70%酒精消毒30s，然后用濃度為0. 1% 的HgCI2消毒8-10min，用無菌水清洗5_7遍后接種于MS培養(yǎng)基上，20-30天后種子萌發(fā)長 出幼嫩葉片，備用。
[0061]2農(nóng)桿菌侵染實(shí)驗(yàn)
[0062]①將培養(yǎng)15-20d的普通煙草組培苗取出，剪取煙草新萌發(fā)的幼嫩葉片，去除葉 脈，剪成0. 5X0. 5cm葉片置于懸浮培養(yǎng)液中侵染備用；
[0063]②將實(shí)施例2步驟2. 7中制備好的已轉(zhuǎn)化含有重組質(zhì)粒的pBI121_MhSERK4的 農(nóng)桿菌EHA105菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，放入含有10mL YEP液體培養(yǎng)基(含有50mg. L^Kan和50mg. PRif)的離心管中，28°C，150-200rpm ? min—1搖菌15_20h，按照菌液濃度進(jìn)行稀釋，加入 10mL含有50mg. L^Kan的液體培養(yǎng)基（同上)中，28°C，150_200rpm振蕩培養(yǎng)4_6h，至菌液濃 度 0D=0. 4-0. 6 ；
[0064]③將懸浮液中的葉片放入農(nóng)桿菌菌液中進(jìn)行浸染8-10min，用滅菌的濾紙將多余 的菌液吸凈，將葉片置于培養(yǎng)基（MS+6-BA1. Omg. L^+NAA0. lmg. L—1)上共培養(yǎng)3d ；
[0065]④共培養(yǎng)3d后，將浸染的煙草葉片用懸浮液進(jìn)行清洗，然后用無菌濾紙吸 干多余農(nóng)桿菌菌液，再置于篩選培養(yǎng)基（MS+6-BA1. Omg. I^+NAAO. lmg. L^+KanlOOmg. L-i+CeKOOmg. L—1)上，黑暗條件下進(jìn)行篩選培養(yǎng)；
[0066]⑤1個月后，在浸染的葉片上長出愈傷組織，當(dāng)葉片邊緣出現(xiàn)抗性芽后，再將抗性 芽轉(zhuǎn)移到新的增殖培養(yǎng)基（MS+Kanl00mg. L^+CefSOOmg. I71)中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，至得到TO代 轉(zhuǎn)化植株。
[0067]實(shí)施例4 :植物表達(dá) 載體pBI121_MhSERK4的遺傳轉(zhuǎn)化煙草抗性植株的基因功能驗(yàn) 證[0068]待抗性苗長至5~7片葉時，選用基因組提取試劑盒提取抗性煙草植株葉片的基因組DNA，以基因組DNA為模板，做PCR檢測驗(yàn)證是否為轉(zhuǎn)基因煙草，反應(yīng)體系為25 μ L:體系為上下游引物(MhSERK4-XbaI 和 MhSERK4_SmaI)各 I μ L，ExTaq2.5 μ L, dNTP(2.5mol.I/1) 2μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 補(bǔ)足至 25μ L。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95 °C 5min,94°C 40s, 58°C 40s, 72°C 2min，30 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。PCR 結(jié)束后，用濃度為 1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測為陽性。
[0069]將該MhSERK4基因轉(zhuǎn)入普通煙草植物后，當(dāng)根系長至5_7條時，進(jìn)行煉苗、移栽，放入大棚中遮陰培育。
[0070]經(jīng)過2-3月培育TO代轉(zhuǎn)化抗性株系后，煙草植株逐漸產(chǎn)生花蕾，在花蕾即將開放前將一部分煙草抗性植株采取去雄處理；未轉(zhuǎn)化煙草對照植株采取去雄處理；
[0071]經(jīng)過一段時間生長發(fā)育后對處理植株進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn):采取去雄處理的煙草抗性植株可以正常結(jié)種子，而對照(未轉(zhuǎn)化煙草)植株經(jīng)過去雄處理后未能結(jié)種子。
[0072]通過上述實(shí)驗(yàn)說明MhSERK4基因是無融合生殖相關(guān)基因，驗(yàn)證了該基因無融合生殖功能，即不通過兩性生殖細(xì)胞的結(jié)合仍然可以正常產(chǎn)生種子。
[0073]綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建了含有無融合生殖相關(guān)MhSERK4基因編碼的植物表達(dá)載體pBI121-MhSERK4，其中MhSERK4基因?yàn)槭状螆蟮?。所?gòu)建的載體可導(dǎo)入植物中，可用于研究植物的無融合生殖分子機(jī)理。
[0074]以上所揭露的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，當(dāng)然不能以此來限定本發(fā)明之權(quán)利范圍，因此，依本發(fā)明權(quán)利要求所·作的等同變化，仍屬于本發(fā)明所涵蓋的范圍。
【權(quán)利要求】
1.蘋果屬平邑甜茶無融合生殖基因MhSERK4，其特征在于，該MhSERK4基因的核苷酸序列為:
MhSERK4(1836bp)
5’ -ATGACGTCTTCCACCTCTGTTTCCGTCTGGCTGATTCTGCTGTTTGGCTTCTTTCACCTCCATAAGCTCGCTGCCAACGTCGAAGGTGACGCATTGAACGCGTTGAAGACCAATCTAGCTGATCCAAATAATGTTCTGCAGAGTTGGGATCCGACTCTCGTCAATCCCTGCACCTGGTTTCATGTCACTTGTAATAGCGAAAACAGCGTTACTCGAGTTGATCTTGGCAATGCCAATCTCTCTGGTCAATTGGTTGCACAGCTTGGTGTGCTTTCCAAGTTGCAGTACTTGGAACTTTACAGTAATAACATAACTGGAACCATTCCCGAAGAGCTTGGGGGTTTGGCAGACTTGGTCAGTTTGGATCTTTACTTGAACAAGTTACATGGTAACATTCCAGCGGCACTTGGCAACCTTGCAAAACTACGTTTCCTGCGTCTCAACAACAACACCTTGTCAGGGACTATTCCCTTGACTTTGACTAACATCCAATCATTGCAAGTCCTGGATCTTTCAAATAACAATCAGACAGGGGATATTCCAGTCAATGGATCTTTTTCACTTTTTACTCCCATCAGTTTTGCCAATAATCCTCTGAAACCACTTCCACCCTCTCCACCTCCTCCTGTTTCTCCGAACCCACCAAGTTCTCCAGGTACCACTGCTACTGGGGCTATTGCTGGAGGGGTTGCTGCTGGTGCTGCTTTGCTATTTGCTGCACCTGCAATTGCCCTTGCTTATTGGCGACGAAGAAAACCACAGGATCATTTCTTTGATGTACCTGCTGAGGAGGATCCAGAAGTTCATTTAGGACAGCTCAAAAGGTTTTCTTTGCGCGAACTACAAGTTGCAACGGATACCTTTAGTAACAAAAATATTCTTGGTAGAGGTGGATTTGGTAAGGTTTATAAAGGACGCTTAGCTGATGGAACTCTGGTTGCTGTAAAAAGACTTAAAGAGGAGAGAACCCAAGGTGGGGAGCTACAGTTTCAAACAGAGGTTGAAATGATTAGCATGGCTGTCCACCGCAATCTGCTTCGTCTGCGTGGTTTTTGCATGACACCAACAGAAAGGCTGCTTGTATATCCTTATATGTCTAATGGAAGTGTGGCATCATGTTTAAGAGATCGTCCAGAAGGACAACCTGCACTTGATTGGCCAATAGGACAACGCATTGCGTTGGGATCTGCAAGAGGCCTTGCTTATTTACATGATCACTGTGATCCAAAAATTATTCACCGTGATGTGAAAGCAGCAAACATATTGTTGGATGAGGAATTCGAAGCAGTTGTTGGAGACTTTGGGTTGGCTAAACTCATGGACTACAAGGATACACATGTTACCACAGCTGTACGTGGCACAATTGGTCATATAGCACCAGAGTACCTTTCAACTGGAAAATCTTCCGAGAAAACTGATGTTTTTGGATACGGAGTCATGCTTCTTGAACTCATCACTGGGCAGAGGGCTTTTGATCTTGCTCGGCTTGCGAATGATGATGATGTCATGTTACTTGATTGGGTCAAAGGACTACTGAAAGATCGGAAGTTGGAAACACTTGTTGATGCTGATCTGAATGGAAATTATGTTGACGATCAAGTGGAGCAGCTCATCCAAGTAGCTCTACTGTGCACACAAGGCACCCCAGGGGAACGACCCAAGATGTCAGAGGTTGTCCGGATGCTGGAAGGCGATGGTTTGGCTGA·AAGATGGGAGGAGTGGCAAAAGGAGGAGGTGTTCCGCCAAGATTTCAACCCTATTCATCATCCAAGTACTACTTGGATCATAGACTCCACTTCTCATATTCCTCCGGATGAGTTGTCCGGTCCTAGATGA-3,0
2.蘋果屬平邑甜茶無融合生殖基因MhSERK4的重組植物表達(dá)載體pBI121-MhSERK4，其特征在于:由權(quán)利要求1所述的無融合生殖相關(guān)MhSERK4基因的開放閱讀框序列與植物表達(dá)載體PBI121構(gòu)成。
3.如權(quán)利要求2所述的蘋果屬平邑甜茶無融合生殖基因MhSERK4的重組植物表達(dá)載體pBI121-MhSERK4的構(gòu)建方法，其特征在于:包括以下步驟: I) MhSERK4基因全長序列擴(kuò)增 提取平邑甜茶發(fā)育時期的子房總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈；設(shè)計引物擴(kuò)增MhSERK4 基因:
上游引物 S1:5’ -ATGTTTGTTGCAGCTGATCCTTG-3’
下游引物 S2:5’ -TCACCTTGGACCAGATAACTCGA-3’ 以反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物連接到PGM-T載體，轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，篩選并測序獲得MhSERK4基因全長序列；2)植物表達(dá)載體pBI121-MhSERK4的構(gòu)建 根據(jù)MhSERK4的開放閱讀框序列設(shè)計一對引物，并分別引入酶切位點(diǎn)XbaI和SmaI序列: 上游引物 MhSERM-Xba1:5’ -GGTCTAGAATGACGTCTTCCACCTCTGTTTC-3’ 下游引物 MhSERM-SmaI:5，-ACCCCGGGTCATCTAGGACCGGACAACTCAT-3，； 再以步驟(1)中的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物連接到PGM-T載體得到重組質(zhì)粒PGM-T-MhSERK4，轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞；提取質(zhì)粒PGM_T_MhSERK4和pBI121，并用XbaI和SmaI雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化，篩選并測序驗(yàn)證，植物表達(dá)載體pBI121_MhSERK4構(gòu)建成功。
4.如權(quán)利要求1所述的蘋果屬平邑甜茶無融合生殖相關(guān)MhSERK4基因的應(yīng)用，其特征在于提高植物 無融合生殖特性中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01H5/00GK103849635SQ201310642414
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】張麗杰, 董文軒, 孫曉梅, 王玉霞, 劉月學(xué), 祁慶欽 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)