從孔石莼中分離純化制備酚酸和生物堿的方法與用途
【專利摘要】本發(fā)明是一種從孔石莼中分離純化制備酚酸和生物堿的方法：向孔石莼干粉末加入無水甲醇制得蒸干物，再加入蒸餾水制得上清液；將上清液調(diào)pH后加入乙酸乙酯多次萃取制得組分ABCD；將其甲醇溶液點(diǎn)樣于硅膠GF254上，合并收集相同Rf處條帶溶解于丙酮，經(jīng)離心和減壓濃縮，制備到11種組分，其中的4種組分再次以劃線法點(diǎn)樣于硅膠GF254上進(jìn)行純化制備，制備到6種組分。13種組分為生物堿和酚酸?？捎糜谝种泼资蟿P倫藻或者中肋骨條藻的生長。本發(fā)明方法可操作性強(qiáng)，制得的酚酸和生物堿純度高，實(shí)現(xiàn)了從孔石莼中提取制得酚酸和生物堿的突破。該方法制得的多種酚酸和生物堿具有海藻抑藻活性，具有實(shí)際應(yīng)用價值。
【專利說明】從孔石莼中分離純化制備酚酸和生物堿的方法與用途
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于海洋生化工程領(lǐng)域，具體涉及一種從孔石莼中分離純化制備酚酸和生物堿的方法。本發(fā)明還涉及該方法制得的酚酸和生物堿的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，世界各地海岸普遍存在赤潮現(xiàn)象，對近海水域生態(tài)環(huán)境、人類生活和沿海水產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展造成了極大的威脅。在赤潮的發(fā)生頻率、規(guī)模和危害程度愈演愈烈的同時，海洋沿岸帶(河口和海灣等)水體較淺的透光層內(nèi)，以石莼(Ulva sp.)和滸苔(Enteromorpha sp.)等綠藻為主要代表的海藻亦開始泛濫,形成海藻水華,給沿海漁業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和旅游業(yè)造成重大的損失。如何科學(xué)、有效地利用這些綠潮海藻資源，以減少綠潮帶來的經(jīng)濟(jì)損失成為亟待解決的問題之一。以這些綠潮海藻為實(shí)驗(yàn)材料，將之應(yīng)用于赤潮生物治理中的研究逐漸引起研究者們的重視。
孔石莼(Ulva pertusa)分類上歸屬于綠藻門，石莼屬，石莼科，廣泛分布于西太平洋沿海，是我國野生經(jīng)濟(jì)藻類中資源極為豐富的一種，在黃渤海產(chǎn)量最大。自古以來，孔石莼在食用和藥用方面就有廣泛的應(yīng)用。目前，孔石莼主要應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料和生態(tài)肥料等方面，其應(yīng)用價值還未得到充分發(fā)掘。近來研究表明，孔石莼及其提取物具有多種生物活性，降血脂作用、抗病毒和抗菌作用、清除自由基和抗氧化作用、抑藻活性等，在食品領(lǐng)域、海洋天然藥物和生態(tài)環(huán)境保護(hù)等方面都顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的從孔石莼中分離純化制備酚酸和生物堿的方法，該方法可操作性強(qiáng)，制得的酚酸和生物堿純度高。
本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供了上述方法所制得的酚酸和生物堿的用途。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一種從孔石莼中分離純化制備酚酸和生物堿的方法，其特點(diǎn)是，其步驟如下:
(1)向孔石莼干粉末加入無水甲醇，常溫超聲波下提取2h，過濾和減壓蒸干，制備到蒸干物；將蒸干物加入蒸餾水，充分振蕩，4°C下靜置過夜，離心、過濾，去除沉淀，得上清液；
(2)將上清液調(diào)pH至11，加入乙酸乙酯萃??；所得上層減壓蒸干，獲得組分A，將所得下層調(diào)節(jié)PH至7，乙酸乙酯萃取，所得上層減壓蒸干，制備到組分B，再將所得下層pH調(diào)節(jié)至2，乙酸乙酯萃取，所得上層和下層分別減壓蒸干，獲得組分C和組分D ;將組分A、B、C、D分別溶解于無水甲醇中，得到4種甲醇溶液；
(3)將所得的4種甲醇溶液點(diǎn)樣于硅膠GF254上，組分A、組分B和組分C的甲醇溶液以體積比為15:3:2的氯仿/丙酮/甲酸為展開劑，組分D的甲醇溶液以體積比為8:1的氯仿/甲醇為展開劑；展開后，紫外254nm下觀察；組分A甲醇溶液出現(xiàn)I個斑點(diǎn)，Rf為0.550 ;組分B甲醇溶液出現(xiàn)4個斑點(diǎn)，Rf為0.356、0.466、0.687和0.872 ;組分C甲醇溶液出現(xiàn)4個斑點(diǎn)，Rf為0.550、0.663、0.775和0.894 ;組分D的甲醇溶液出現(xiàn)2個斑點(diǎn)，Rf分別為0.216和0.585 ;在此基礎(chǔ)上，以劃線法多次點(diǎn)樣，合并收集相同Rf處條帶，重新溶解于丙酮，經(jīng)離心和減壓濃縮，制備到11種組分，和前述斑點(diǎn)對應(yīng)依次記為組分A1、組分V組分B2、組分B3、組分B4、組分C1、組分C2、組分C3、組分C4、組分D1和組分D2 ;其中，組分B4、組分C4、組分D1和組分D2再次以劃線法點(diǎn)樣于硅膠GF254上進(jìn)行純化制備，以體積比為18:1:3的氯仿/丙酮/甲酸為展開劑，制備到6種組分，依次記為組分B41、組分B42、組分C41、組分C42、組分D11和組分D21 ；
(4)經(jīng)化合物定性檢測、波長掃描和薄層層析檢測，13種組分物質(zhì)中，組分Dll和組分D21是生物堿，其余組分為酚酸；分別減壓蒸干，即得。
以上所述的本發(fā)明方法制得的酚酸或者生物堿，可以用來抑制米氏凱倫藻或者中肋骨條藻的生長。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法可操作性強(qiáng)，制得的酚酸和生物堿純度高，實(shí)現(xiàn)了從孔石莼中提取制得酚酸和生物堿的突破。該方法制得的多種酚酸和生物堿具有海藻抑藻活性，具有實(shí)際應(yīng)用價值。
【具體實(shí)施方式】
以下進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對其權(quán)利的限制。
實(shí)施例1，一種從孔石莼中分離純化制備酚酸和生物堿的方法，其步驟如下:
(O向孔石莼干粉末加入無水甲醇，常溫超聲波下提取2h，過濾和減壓蒸干，制備到蒸干物；將蒸干物加入蒸餾水，充分振蕩，4°C下靜置過夜，離心、過濾，去除沉淀，得上清液；
(2)將上清液調(diào)pH至11，加入乙酸乙酯萃取；所得上層減壓蒸干，獲得組分A，將所得下層調(diào)節(jié)PH至7，乙酸乙酯萃取，所得上層減壓蒸干，制備到組分B，再將所得下層pH調(diào)節(jié)至2，乙酸乙酯萃取，所得上層和下層分別減壓蒸干，獲得組分C和組分D ;將組分A、B、C、D分別溶解于無水甲醇中，得到4種甲醇溶液；
(3)將所得的4種甲醇溶液點(diǎn)樣于硅膠GF254上，組分A、組分B和組分C的甲醇溶液以體積比為15:3:2的氯仿/丙酮/甲酸為展開劑，組分D的甲醇溶液以體積比為8:1的氯仿/甲醇為展開劑；展開后，紫外254nm下觀察；組分A甲醇溶液出現(xiàn)I個斑點(diǎn)，Rf為0.550 ;組分B甲醇溶液出現(xiàn)4個斑點(diǎn)，Rf為0.356、0.466、0.687和0.872 ;組分C甲醇溶液出現(xiàn)4個斑點(diǎn)，Rf為0.550、0.663、0.775和0.894 ;組分D的甲醇溶液出現(xiàn)2個斑點(diǎn)，Rf分別為0.216和0.585 ;在此基礎(chǔ)上，以劃線法多次點(diǎn)樣，合并收集相同Rf處條帶，重新溶解于丙酮，經(jīng)離心和減壓濃縮，制備到11種組分，和前述斑點(diǎn)對應(yīng)依次記為組分A1、組分V組分B2、組分B3、組分B4、組分C1、組分C2、組分C3、組分C4、組分D1和組分D2 ;其中，組分B4、組分C4、組分D1和組分D2再次以劃線法點(diǎn)樣于硅膠GF254上進(jìn)行純化制備，以體積比為18:1:3的氯仿/丙酮/甲酸為展開劑，制備到6種組分，依次記為組分B41、組分B42、組分C41、組分C42、組分D11和組分D21 ；
(4)經(jīng)化合物定性檢測、波長掃描和薄層層析檢測，13種組分物質(zhì)中，組分Dll和組分D21是生物堿，其余組分為酚酸；分別減壓蒸干，即得。
實(shí)施例2，一種從孔石莼中分離純化制備酚酸和生物堿的方法實(shí)驗(yàn):
孔石莼干品粉碎成0.3_粉末，加入無水甲醇，在常溫超聲波下提取2h。反復(fù)提取3-4次后，合并提取液，經(jīng)離心、過濾和減壓蒸干，制備到蒸干物；此蒸干物加入適量蒸餾水，充分振蕩，4°C下靜置過夜，離心、過濾，去除沉淀，保留上清液。用2-5mol/L氫氧化鈉將上清液PH調(diào)至11，加入乙酸乙酯萃取3-4次。上層減壓蒸干，獲得組分A。調(diào)節(jié)下層pH至7，乙酸乙酯萃取3-4次，上層減壓蒸干，制備到組分B。再將下層pH調(diào)節(jié)至2，乙酸乙酯萃取3-4次，上層和下層分別減壓蒸干，獲得組分C和組分D。上述4種組分分別溶解于無水甲醇中，制備到4種甲醇溶液。將此4種甲醇溶液點(diǎn)樣于硅膠GF254上，組分A、組分B和組分C以氯仿/丙酮/甲酸(15:3:2)為展開劑，組分D以氯仿/甲醇(8:1)為展開劑。展開后，紫外254nm下觀察。組分A出現(xiàn)I個斑點(diǎn)，Rf為0.550 ;組分B出現(xiàn)4個斑點(diǎn)，Rf為0.356、0.466,0.687 和 0.872 ;組分 C 出現(xiàn) 4 個斑點(diǎn)，Rf 為 0.550,0.663,0.775 和 0.894 ;組分 D出現(xiàn)2個斑點(diǎn)，Rf分別為0.216和0.585。在此基礎(chǔ)上，以劃線法多次點(diǎn)樣，合并收集相同Rf處條帶，重新溶解于丙酮，經(jīng)離心和減壓濃縮，制備到11種組分，記為組分A1、組分B1、組分B2、組分B3、組分B4、組分C1、組分C2、組分C3、組分C4、組分D1和組分D2。其中，組分B4、組分C4、組分D1和組分D2再次以劃線法點(diǎn)樣于硅膠GF254上進(jìn)行純化，以氯仿/丙酮/甲酸(18:1:3)為展開劑，制備到6種組分，依次記為組分B41、組分B42、組分C41、組分C42、組分D11和組分D21。
取0.lmL13種組分的濃縮液，溶劑揮發(fā)后，加入lmol/L冰醋酸溶液I mL，充分振蕩，加入鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑(0.6%鐵氰化鉀溶液和0.9%三氯化鐵溶液，使用前按0.9: 1.0混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配)，觀察顏色反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)組分V組分B1、組分B2、組分B3、組分B41、組分B42、組分C1、組分C2、組分C3、組分C41和組分C42呈現(xiàn)污綠色，為酚酸類物質(zhì)的陽性反應(yīng)；波長掃描顯示，此11種組分在260-330nm范圍內(nèi)有特征吸收峰，為酚酸類物質(zhì)的特征吸收峰；13種組分的0.1mL濃縮液，溶劑揮發(fā)后，加入碘化鉍鉀溶液lmL，充分振蕩，僅組分D11和組分D21出現(xiàn)黃色沉淀，為生物堿的陽性反應(yīng)。將此13種組分溶液點(diǎn)樣于硅膠GF254上，分別在氯仿/甲醇，環(huán)己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3種展開劑下展開，發(fā)現(xiàn)此13種組分均呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)；同時，采用通用型顯色劑(10%硫酸溶液和碘)以及專屬顯色劑(鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液或碘化鉍鉀溶液)，發(fā)現(xiàn)在此3種顯色劑下，此13種組分同樣呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)，表明純度達(dá)到了薄層純。最后，抑藻活性檢測表明，此13種組分均能抑制米氏凱倫藻和中肋骨條藻的生長。減壓蒸干，制備到13種抑藻活性物質(zhì)。
實(shí)施例3，一種從孔石莼中分離純化制備酚酸和生物堿的方法實(shí)驗(yàn):
稱取孔石藥干粉末400g,溶解于2000mL無水甲醇,室溫下超聲波提取2h。提取4次后，合并提取液，經(jīng)離心、過濾和減壓蒸干，制備到42.6g蒸干物。此蒸干物中加入40mL蒸餾水，充分振蕩，4°C下靜置過夜，離心、過濾，去除沉淀，保留上清液。用2mol/L氫氧化鈉將上清液PH調(diào)至11，加入乙酸乙酯萃取4次。上層40°C下減壓蒸干，獲得暗綠色蒸干物2.219g(組分A)。調(diào)節(jié)下層pH至7，乙酸乙酯萃取4次，上層40°C下減壓蒸干，制備到黃色蒸干物
0.466g (組分B)。 再將下層pH調(diào)節(jié)至2，乙酸乙酯萃取4次，上層和下層分別在40°C減壓蒸干，獲得棕黃色蒸干物2.485g (組分C)和紅棕色蒸干物3.219g (組分D)。上述4種組分分別溶解于無水甲醇中，制備到4種甲醇溶液。將此4種甲醇溶液點(diǎn)樣于硅膠GF254上，組分A、組分B和組分C以氯仿/丙酮/甲酸(15:3:2)為展開劑，組分D以氯仿/甲醇(8:1)為展開劑。展開后，紫外254nm下觀察。組分A出現(xiàn)I個斑點(diǎn)，Rf為0.550;組分B出現(xiàn)4個斑點(diǎn)，Rf 為 0.356、0.466、0.687 和 0.872 ;組分 C 出現(xiàn) 4 個斑點(diǎn)，Rf 為 0.550、0.663、0.775 和0.894 ;組分D出現(xiàn)2個斑點(diǎn)，Rf分別為0.216和0.585。在此基礎(chǔ)上，以劃線法多次點(diǎn)樣，合并收集相同Rf處條帶，重新溶解于丙酮，經(jīng)離心和減壓濃縮，制備到11種組分，記為組分A1、組分B1、組分B2、組分B3、組分B4、組分C1、組分C2、組分C3、組分C4、組分D1和組分D2。其中，組分B4、組分C4、組分D1和組分D2再次以劃線法點(diǎn)樣于硅膠GF254上進(jìn)行純化，以氯仿/丙酮/甲酸(18:1:3)為展開劑，制備到6種組分，依次記為組分B41、組分B42、組分C41、組分C42、組分D11和組分D21。
取0.lmL13種組分的濃縮液，溶劑揮發(fā)后，加入lmol/L冰醋酸溶液lmL，充分振蕩，加入鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑(0.6%鐵氰化鉀溶液和0.9%三氯化鐵溶液，使用前按0.9: 1.0混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配)，觀察顏色反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)組分A1、組分B1、組分B2、組分B3、組分B41、組分B42、組分C1、組分C2、組分C3、組分C41和組分C42呈現(xiàn)污綠色，為酚酸類物質(zhì)的陽性反應(yīng)；波長掃描顯示，此11種組分在260-330nm范圍內(nèi)有特征吸收峰，為酚酸類物質(zhì)的特征吸收峰；
13種組分的0.1mL濃縮液，溶劑揮發(fā)后，加入碘化鉍鉀溶液lmL，充分振蕩，僅組分D11和組分D21出現(xiàn)黃色沉淀，為生物堿的陽性反應(yīng)。將此13種組分溶液點(diǎn)樣于硅膠GF254上，分別在氯仿/甲醇，環(huán)己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3種展開劑下展開，發(fā)現(xiàn)此13種組分均呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)；同時，采用通用型顯色劑(10%硫酸溶液和碘)以及專屬顯色劑(鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液或碘化鉍鉀溶液)，發(fā)現(xiàn)在此3種顯色劑下，此13種組分同樣呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)，表明純度達(dá)到了薄層純。最后，抑藻活性檢測表明，此13種組分均能抑制米氏凱倫藻和中肋骨條藻的生長。減壓蒸干，制備到13種抑藻活性物質(zhì)，A1黃色油狀物0.054g、B1淡黃色針狀結(jié)晶0.032g、B2黃色結(jié)晶性粉末0.034g、B3黃色結(jié)晶0.026g、B41黃色針狀結(jié)晶0.006g、B42黃色粉末0.0OSgj1淡黃色粉末0.032g、C2淡黃色結(jié)晶0.083g、C3黃色粉末
0.085g、C41黃色結(jié)晶性粉末0.007g、C42黃色粉末0.004g、D11淡黃色粉末0.004g和D21淡黃色結(jié)晶0.009g。
實(shí)施例4，一種從孔石莼中`分離純化制備酚酸和生物堿的方法實(shí)驗(yàn):
稱取孔石藥干粉末600g,溶解于3000mL無水甲醇，室溫下超聲波提取2h。提取4次后，合并提取液，經(jīng)離心、過濾和減壓蒸干，制備到58.4g蒸干物。此蒸干物中加入60mL蒸餾水，充分振蕩，4°C下靜置過夜，離心、過濾，去除沉淀，保留上清液。用3mol/L氫氧化鈉將上清液PH調(diào)至11，加入乙酸乙酯萃取4次。上層40°C下減壓蒸干，獲得暗綠色蒸干物
3.466g (組分A)。調(diào)節(jié)下層pH至7，乙酸乙酯萃取4次，上層40°C下減壓蒸干，制備到黃色蒸干物0.531g (組分B)。再將下層pH調(diào)節(jié)至2，乙酸乙酯萃取4次，上層和下層分別在40°C減壓蒸干，獲得棕黃色蒸干物2.875g (組分C)和紅棕色蒸干物3.658g (組分D)。上述4種組分分別溶解于無水甲醇中，制備到4種甲醇溶液。將此4種甲醇溶液點(diǎn)樣于硅膠GF254上，組分A、組分B和組分C以氯仿/丙酮/甲酸(15:3:2)為展開劑，組分D以氯仿/甲醇(8:1)為展開劑。展開后，紫外254nm下觀察。組分A出現(xiàn)I個斑點(diǎn)，Rf為0.550 ;組分B出現(xiàn)4個斑點(diǎn)，Rf為0.356,0.466,0.687和0.872 ;組分C出現(xiàn)4個斑點(diǎn)，Rf為0.550、
0.663,0.775和0.894 ;組分D出現(xiàn)2個斑點(diǎn)，Rf分別為0.216和0.585。在此基礎(chǔ)上，以劃線法多次點(diǎn)樣，合并收集相同Rf處條帶，重新溶解于丙酮，經(jīng)離心和減壓濃縮，制備到11種組分，記為組分A1、組分B1、組分B2、組分B3、組分B4、組分C1、組分C2、組分C3、組分C4、組分D1和組分D2。其中，組分B4、組分C4、組分D1和組分D2再次以劃線法點(diǎn)樣于硅膠GF254上進(jìn)行純化，以氯仿/丙酮/甲酸(18:1:3)為展開劑，制備到6種組分，依次記為組分B41、組分B42、組分C41、組分C42、組分D11和組分D21。取0.lmL13種組分的濃縮液，溶劑揮發(fā)后，加入lmol/L冰醋酸溶液lmL，充分振蕩，加入鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑(0.6%鐵氰化鉀溶液和
0.9%三氯化鐵溶液，使用前按0.9: 1.0混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配)，觀察顏色反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)組分Ap組分B1、組分B2、組分B3、組分B41、組分B42、組分C1、組分C2、組分C3、組分C41和組分C42呈現(xiàn)污綠色，為酚酸類物質(zhì)的陽性反應(yīng)；波長掃描顯示，此11種組分在260-330nm范圍內(nèi)有特征吸收峰，為酚酸類物質(zhì)的特征吸收峰；13種組分的0.1mL濃縮液，溶劑揮發(fā)后，加入碘化鉍鉀溶液lmL，充分振蕩，僅組分D11和組分D21出現(xiàn)黃色沉淀，為生物堿的陽性反應(yīng)。將此13種組分溶液點(diǎn)樣于硅膠GF254上，分別在氯仿/甲醇，環(huán)己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3種展開劑下展開，發(fā)現(xiàn)此13種組分均呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)；同時，采用通用型顯色劑(10%硫酸溶液和碘)以及專屬顯色劑(鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液或碘化鉍鉀溶液)，發(fā)現(xiàn)在此3種顯色劑下，此13種組分同樣呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)，表明純度達(dá)到了薄層純。最后，抑藻活性檢測表明，此13種組分均能抑制米氏凱倫藻和中肋骨條藻的生長。減壓蒸干，制備到13種抑藻活性物質(zhì)，A1黃色油狀物0.082g、B1淡黃色針狀結(jié)晶0.051g、B2黃色結(jié)晶性粉末0.049g、B3黃色結(jié)晶0.047g、B41黃色針狀結(jié)晶0.008g、B42黃色粉末0.01Ogj1淡黃色粉末0.048g、C2淡黃色結(jié)晶0.096g、C3黃色粉末0.098g、C41黃色結(jié)晶性粉末0.009g、C42黃色粉末0.005g、D11淡黃色粉末0.005g和D21淡黃色結(jié)晶0.0 Hg。
實(shí)施例5，一種從孔石莼中分離純化制備酚酸和生物堿的方法實(shí)驗(yàn):
稱取孔石藥干粉末800g,溶解于3500mL無水甲醇,室溫下超聲波提取2h。提取4次后，合并提取液，經(jīng)離心、過濾和減壓蒸干，制備到84.2g蒸干物。此蒸干物中加入IOOmL蒸餾水，充分振蕩，4°C下靜置過夜，離心、過濾，去除沉淀，保留上清液。用5mol/L氫氧化鈉將上清液PH調(diào)至11，加入乙酸乙酯萃取4次。上層40°C下減壓蒸干，獲得暗綠色蒸干物4.0Slg(組分A)。調(diào)節(jié)下層pH至7，乙酸乙酯萃取4次，上層40°C下減壓蒸干，制備到黃色蒸干物
0.782g (組分B)。再將下層pH調(diào)節(jié)至2，乙酸乙酯萃取4次，上層和下層分別在40°C減壓蒸干，獲得棕黃色蒸干物3.725g (組分C)和紅棕色蒸干物5.383g (組分D)。上述4種組分分別溶解于無水甲醇中，制備到4種甲醇溶液。將此4種甲醇溶液點(diǎn)樣于硅膠GF254上，組分A、組分B和組分C以氯仿/丙酮/甲酸(15:3:2)為展開劑，組分D以氯仿/甲醇(8:1)為展開劑。展開后，紫外254nm下觀察。組分A出現(xiàn)I個斑點(diǎn)，Rf為0.550;組分B出現(xiàn)4個斑點(diǎn)，Rf 為 0.356,0.466,0.687 和 0.872 ;組分 C 出現(xiàn) 4 個斑點(diǎn)，Rf 為 0.550,0.663,0.775 和0.894 ;組分D出現(xiàn)2個斑點(diǎn)，Rf分別為0.216和0.585。在此基礎(chǔ)上，以劃線法多次點(diǎn)樣，合并收集相同Rf處條帶，重新溶解于丙酮，經(jīng)離心和減壓濃縮，制備到11種組分，記為組分A1、組分B1、組分B2、組分B3、組分B4、組分C1、組分C2、組分C3、組分C4、組分D1和組分D2。其中，組分B4、組分C4、組分D1和組分D2再次以劃線法點(diǎn)樣于硅膠GF254上進(jìn)行純化，以氯仿/丙酮/甲酸(18:1:3)為展開劑，制備到6種組分，依次記為組分B41、組分B42、組分C41、組分C42、組分D11和組分D21。取0.lmL13種組分的濃縮液，溶劑揮發(fā)后，加入lmol/L冰醋酸溶液lmL，充分振蕩，加入鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑(0.6%鐵氰化鉀溶液和0.9%三氯化鐵溶液，使用前按0.9: 1.0混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配)，觀察顏色反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)組分A1、組分B1、組分B2、組分B3、組分B41、組分B42、組分C1、組分C2、組分C3、組分C41和組分C42呈現(xiàn)污綠色，為酚酸類物質(zhì)的陽性反應(yīng)；波長掃描顯示，此11種組分在260-330nm范圍內(nèi)有特征吸收峰，為酚酸類物質(zhì)的特征吸收峰；13種組分的0.1mL濃縮液，溶劑揮發(fā)后，加入碘化鉍鉀溶液lmL，充分振蕩，僅組分D11和組分D21出現(xiàn)黃色沉淀，為生物堿的陽性反應(yīng)。將此13種組分溶液點(diǎn)樣于硅膠GF254上，分別在氯仿/甲醇，環(huán)己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3種展開劑下展開，發(fā)現(xiàn)此13種組分均呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)；同時，采用通用型顯色劑(10%硫酸溶液和碘)以及專屬顯色劑(鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液或碘化鉍鉀溶液)，發(fā)現(xiàn)在此3種顯色劑下，此13種組分同樣呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)，表明純度達(dá)到了薄層純。最后，抑藻活性檢測表明，此13種組分均能抑制米氏凱倫藻和中肋骨條藻的生長。減壓蒸干，制備到13種抑藻活性物質(zhì)，A1黃色油狀物0.098g、B1淡黃色針狀結(jié)晶0.059g、B2黃色結(jié)晶性粉末0.060g、B3黃色結(jié)晶0.048g、B41黃色針狀結(jié)晶0.01Og^B42黃色粉末0.0Hg^C1淡黃色粉末0.058g、C2淡黃色結(jié)晶0.147g、C3黃色粉末0.152g、C41黃色結(jié)晶性粉末0.01lg, C42黃色粉末0.006g、D11淡黃色粉末0.007g和D21淡黃色結(jié)晶0.016g。
采用抑藻圈實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抑藻活性檢測。在數(shù)個直徑為1.5cm的圓形濾紙片上，分別滴加5 μ L待測組分丙酮濃縮液和丙酮(作為對照組)，待丙酮完全揮發(fā)后，將濾紙片放置于接種對數(shù)生長期的中肋骨條藻的固體培養(yǎng)基上，置于GXZ-260B智能型光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度(26±1) °C，光照強(qiáng)度62μπι01 JiT2s-1,光暗比為12:12。2d后，觀察濾紙片及周圍受試微藻的生長，發(fā)現(xiàn)13種待測組分均對中肋骨條藻的生長表現(xiàn)出較為明顯的抑制作用。通過測定抑藻圈，此13種待測組分的抑藻圈均超`過1.0cm0
【權(quán)利要求】
1.一種從孔石莼中分離純化制備酚酸和生物堿的方法，其特征在于，其步驟如下: (O向孔石莼干粉末加入無水甲醇，常溫超聲波下提取2h，過濾和減壓蒸干，制備到蒸干物；將蒸干物加入蒸餾水，充分振蕩，4°C下靜置過夜，離心、過濾，去除沉淀，得上清液； (2)將上清液調(diào)pH至11，加入乙酸乙酯萃??；所得上層減壓蒸干，獲得組分A，將所得下層調(diào)節(jié)PH至7，乙酸乙酯萃取，所得上層減壓蒸干，制備到組分B，再將所得下層pH調(diào)節(jié)至2，乙酸乙酯萃取，所得上層和下層分別減壓蒸干，獲得組分C和組分D ;將組分A、B、C、D分別溶解于無水甲醇中，得到4種甲醇溶液； (3)將所得的4種甲醇溶液點(diǎn)樣于硅膠GF254上，組分A、組分B和組分C的甲醇溶液以體積比為15:3:2的氯仿/丙酮/甲酸為展開劑，組分D的甲醇溶液以體積比為8:1的氯仿/甲醇為展開劑；展開后，紫外254nm下觀察；組分A甲醇溶液出現(xiàn)I個斑點(diǎn)，Rf為0.550 ;組分B甲醇溶液出現(xiàn)4個斑點(diǎn)，Rf為0.356、0.466、0.687和0.872 ;組分C甲醇溶液出現(xiàn)4個斑點(diǎn)，Rf為0.550、0.663、0.775和0.894 ;組分D的甲醇溶液出現(xiàn)2個斑點(diǎn)，Rf分別為0.216和0.585 ;在此基礎(chǔ)上，以劃線法多次點(diǎn)樣，合并收集相同Rf處條帶，重新溶解于丙酮，經(jīng)離心和減壓濃縮，制備到11種組分，和前述斑點(diǎn)對應(yīng)依次記為組分A1、組分V組分B2、組分B3、組分B4、組分C1、組分C2、組分C3、組分C4、組分D1和組分D2 ;其中，組分B4、組分C4、組分D1和組分D2再次以劃線法點(diǎn)樣于硅膠GF254上進(jìn)行純化制備，以體積比為18:1:3的氯仿/丙酮/甲酸為展開劑，制備到6種組分，依次記為組分B41、組分B42、組分C41、組分C42、組分D11和組分D21 ； (4)經(jīng)化合物定性檢測、波長掃描和薄層層析檢測，13種組分物質(zhì)中，組分Dll和組分D21是生物堿，其余組分為酚酸；分別減壓蒸干，即得。
2.如權(quán)利要求1所述方法制得的酚酸或者生物堿在抑制米氏凱倫藻或者中肋骨條藻的生長中的用途。
【文檔編號】A01N65/03GK103690571SQ201310649525
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】孫穎穎, 閻斌倫, 王輝 申請人:淮海工學(xué)院