一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因甜葉菊遺傳轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因甜葉菊遺傳轉(zhuǎn)化方法，本方法將預(yù)培養(yǎng)后的甜葉菊莖尖外植體浸入攜帶目的基因的pRI101-ANDNA質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，經(jīng)侵染、共培養(yǎng)及除菌處理后，將發(fā)狀根培養(yǎng)在含卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)外植體上形成抗卡那霉素的發(fā)狀根，誘導(dǎo)發(fā)狀根形成愈傷組織，分化不定芽，不定芽繼續(xù)生長(zhǎng)形成試管苗，利用PCR擴(kuò)增方法鑒定攜帶目的基因的轉(zhuǎn)基因植株。采用本發(fā)明提供的技術(shù)方案，可將目的基因?qū)胩鹑~菊，與聚乙二醇等化學(xué)方法的遺傳轉(zhuǎn)化相比，減少了從原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的環(huán)節(jié)；與基因槍等物理方法的遺傳轉(zhuǎn)化相比，不需要昂貴的儀器設(shè)備，且操作技術(shù)簡(jiǎn)單。
【專利說明】一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因甜葉菊遺傳轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)中的植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因甜葉菊遺傳轉(zhuǎn)化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化是植物基因工程的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。自Abel等(1986)將煙草花葉病毒(TMV)衣殼蛋白cDNA導(dǎo)入煙草細(xì)胞，獲得抗TMV病毒的轉(zhuǎn)基因煙草植株后，先后發(fā)展了許多植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)。
[0003]甜葉菊自1978年由中國(guó)農(nóng)科院從日本引入我國(guó)，至今已遍及全國(guó)，其葉片含有天然甜味劑甜菊醇糖苷(steviol glycosides, SGs),是一種新型糖料作物。我國(guó)已成為世界上最大的甜葉菊生產(chǎn)國(guó)和甜菊醇糖苷出口國(guó)。目前，全國(guó)的甜葉菊生產(chǎn)均存在以下問題:由于日本培育的守田2號(hào)及守田3號(hào)糖苷含量較高，在甜葉菊栽培品種中長(zhǎng)期具有支配地位，曾壟斷全國(guó)的甜葉菊種植。選育優(yōu)良的具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)甜葉菊新品種已成為亟需解決的問題。目前尚未有甜葉菊轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)建立的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明直接用甜葉菊試管苗莖尖作為外植體，取材方便。在已建立高效組培快繁體系的基礎(chǔ)上，建立了以莖尖為外植體的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因甜葉菊遺傳轉(zhuǎn)化的方法，減少所使用儀器的費(fèi)用，使實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)容易在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，為今后利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)甜葉菊進(jìn)行遺傳改良提供技術(shù)上的支持。
[0005]MS (Murashige and Skoog, 1962)培養(yǎng)基，是植物細(xì)胞工程的常用培養(yǎng)基，廣泛地用于植物的組織培養(yǎng)，效果良好。本發(fā)明所用的植物培養(yǎng)基均以MS為基本培養(yǎng)基，附加了不同濃度的激素。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
(I)提取攜帶目的基因的重組pRI 101 AN-DNA質(zhì)粒
將含有重組PRI 101 AN-DNA質(zhì)粒的大腸桿菌DH-5a接種到含50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37 °C、220rpm的條件下過夜培養(yǎng)；堿裂解法提取重組pAHC25質(zhì)粒DNA后，酶切鑒定重組pRI 101 AN-DNA質(zhì)粒。
[0007]堿裂解法能夠提取細(xì)菌的質(zhì)粒，屬于一般分子生物學(xué)常規(guī)操作。
[0008](2)準(zhǔn)備遺傳轉(zhuǎn)化使用的甜葉菊莖尖外植體
從高5 cm左右的試管苗上剪取1-1.5cm長(zhǎng)的莖尖，接種到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在溫度25±1 °C、光照強(qiáng)度40001x、光周期為14小時(shí)光照和10小時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)1_3天后，作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體。
[0009]預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為:MS+ 0.1 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + 30g/L 蔗糖 + 6 g/L 瓊脂，pH 5.6-5.8?！?br> [0010](3)甜葉菊莖尖外植體的遺傳轉(zhuǎn)化取活化工程菌液轉(zhuǎn)入無菌離心管中，室溫4000g離心5min，去上清，用新鮮的MS液體培養(yǎng)基重懸稀釋至(?_值為0.6，時(shí)倒入無菌錐形瓶中，在重懸菌液中加入不同體積的50 mmol/L乙酰丁香酮至終濃度為100 μ mol/L ；
預(yù)培養(yǎng)的外植體在菌液中浸泡30 min后，取出外植體在無菌濾紙上吸干多余菌液，接種與共培養(yǎng)培養(yǎng)基)，25°C，4000 Ix光照條件下共培養(yǎng)5d ；
將共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到除菌培養(yǎng)基上進(jìn)行除菌培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接至新的除菌培養(yǎng)基中，以除去發(fā)根農(nóng)桿菌。
[0011]共培養(yǎng)培養(yǎng)基為:MS+ 0.1 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + 30g/L 蔗糖 + 6 g/L 瓊脂，pH 5.6-5.8。
[0012]除菌培養(yǎng)基為:MS+ 0.1 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + lOOmg/L Cef + 30g/L 鹿糖 + 6 g/L 瓊脂,pH 5.6-5.8。
[0013](4)篩選培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根、誘導(dǎo)抗性愈傷組織形成和植株再生
將生長(zhǎng)旺盛長(zhǎng)度達(dá)到2cm，完全除菌、生長(zhǎng)速度快、分枝多的發(fā)狀根轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基中篩選，并大量培養(yǎng)；
將經(jīng)篩選培養(yǎng)基篩選的發(fā)狀根的根尖剪成Icm左右的片段，移入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽，不定芽繼續(xù)生長(zhǎng)形成試管苗。
[0014](5) PCR擴(kuò)增鑒定轉(zhuǎn)基因植株
采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株的DNA，作為被檢模板，根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR(Polymerase Chain Reaction)法對(duì)候選植株進(jìn)行鑒定。
[0015]CTAB法的全稱是十六烷基三甲基溴化胺法能夠提取植物基因組DNA，屬于一般分子生物學(xué)常規(guī)操作。PCR又稱為“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的實(shí)驗(yàn)方法，根據(jù)PCR引物以及PCR反應(yīng)條件，本領(lǐng)域技術(shù)人員可依據(jù)常識(shí)確定PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增出目的基因。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
本發(fā)明以甜葉菊試管苗莖尖作為外植體建立的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，在短時(shí)間內(nèi)可選育出甜葉菊轉(zhuǎn)基因新品種；容易獲得轉(zhuǎn)基因再生植株；所需的設(shè)備簡(jiǎn)單，操作技術(shù)容易掌握。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為Sal I和EcoR I雙酶切攜帶目的基因的重組pRI 101 AN-DNA質(zhì)粒的產(chǎn)物，其中 M:DNA Marker Lanel: pRI 101 AN-DNA:::UGT76G1 ； Lane2_3:pRI 101AN-DNA:::UGT76G1:::UGT76G1 ；
圖2為發(fā)狀根誘導(dǎo)的愈傷組織及再生植株。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中所述試驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得，或可以常規(guī)方法制備。
[0019]實(shí)施例1提取攜帶目的基因UGT76G1的重組pRI 101 AN-DNA質(zhì)粒活化后選取單菌落于5 ml含50 mg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，220 r/min, 37 V培養(yǎng)過夜。采用常規(guī)堿裂解法提取重組pRI 101 AN-DNA質(zhì)粒，得到純化的重組pRI 101AN-DNA質(zhì)粒后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA溶液的濃度，將質(zhì)粒DNA溶液的濃度調(diào)整為1.0 μ g/L。
[0020]Sal I和EcoR I雙酶切后，取5ul酶切液，在含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠板中電泳，TAE電泳緩沖液，電壓5V/cm。將瓊脂糖凝膠板置于凝膠成像儀下，觀察到兩條大小約為IlKb和1600bp的DAN片段(圖1)，表明實(shí)驗(yàn)中使用的重組pRI 101 AN-DNA質(zhì)粒攜帶的目的基因。
[0021]實(shí)施例2發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生
(I)甜葉菊莖尖外植體的預(yù)培養(yǎng)
從高5 cm左右的試管苗上剪取1-1.5cm長(zhǎng)的莖尖，接種到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在溫度25±1 °C、光照強(qiáng)度40001x、光周期為14小時(shí)光照和10小時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)1_3天后，作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體。
[0022]預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為:MS+ 0.1 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + 30g/L 蔗糖 + 6 g/L 瓊脂，pH 5.6-5.8。
[0023](2)甜葉菊莖尖外植體的遺傳轉(zhuǎn)化
取活化工程菌液轉(zhuǎn)入無菌離心管中，室溫4000g離心5min，去上清，用新鮮的MS液體培養(yǎng)基重懸稀釋至(?_值為0.6，時(shí)倒入無菌錐形瓶中，在重懸菌液中加入不同體積的50 mmol/L乙酰丁香酮至終濃度為100 μ mol/L ；
預(yù)培養(yǎng)的外植體在菌液中浸泡30 min后，取出外植體在無菌濾紙上吸干多余菌液，接種與共培養(yǎng)培養(yǎng)基)，25°C，4000 Ix光照條件下共培養(yǎng)5d ;將共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到除菌培養(yǎng)基上進(jìn)行除菌培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接至新的除菌培養(yǎng)基中，以除去發(fā)根農(nóng)桿菌。
[0024]共培養(yǎng)培養(yǎng)基為:MS+ 0.1 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + 30g/L 蔗糖 + 6 g/L 瓊脂，pH 5.6-5.8。除菌培養(yǎng)基為:MS + 0.1 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + lOOmg/LCef + 30g/L 蔗糖 + 6 g/L 瓊脂，pH 5.6-5.8 0
[0025](3)篩選培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根、誘導(dǎo)抗性愈傷組織形成和植株再生
將生長(zhǎng)旺盛長(zhǎng)度達(dá)到2cm，完全除菌、生長(zhǎng)速度快、分枝多的發(fā)狀根轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基中篩選，并大量培養(yǎng)；將經(jīng)篩選培養(yǎng)基篩選的發(fā)狀根的根尖剪成Icm左右的片段，移入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽(圖2)，不定芽繼續(xù)生長(zhǎng)形成試管苗。
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因甜葉菊遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于該方法是將預(yù)培養(yǎng)后的甜葉菊莖尖外植體浸入含有目的基因和篩選基因質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，具體包括以下步驟: a.從甜葉菊試管苗上剪取1- 1.5 cm長(zhǎng)的莖尖，接種到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)1-3天，培養(yǎng)溫度為25± I °C、光照強(qiáng)為3000-4000 Lux、光照時(shí)間為14 h，作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體； 所述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為=MS + 0.1 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + 30g/L 蔗糖 + 6 g/L 瓊脂，pH 5.6-5.8 ； b.挑取發(fā)根農(nóng)桿菌的單菌落，接種到含有50mg/mL利福平的20mL YEP培養(yǎng)基中，于28°C下，180 rpm振蕩培養(yǎng)30 h后，取50 μ L菌液接種到50mL YEP液體培養(yǎng)基中，于28°C下，180 rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0.6 ; c.將步驟a中獲得的莖尖外植體浸入步驟b中獲得的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，在含100μ mol/L乙酰丁香酮的條件下侵染30min ； d.使用無菌濾紙吸取步驟c中外植體的多余菌液，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)5天，共培養(yǎng)溫度為25°C ； 所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為=MS + 0.1 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + 30g/L 蔗糖 + 6 g/L 瓊脂，pH 5.6-5.8 ； e.步驟d獲得的外植體轉(zhuǎn)入除菌培養(yǎng)基上，進(jìn)行除菌培養(yǎng)，培養(yǎng)除菌初期2周內(nèi)每隔3-4天轉(zhuǎn)移至新的除菌培養(yǎng)基，以后每隔一周轉(zhuǎn)移一次，直至除菌完全； 所述除菌培養(yǎng)基為:除菌培養(yǎng)基為:MS + 0.1 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + 100mg/L Cef + 30g/L 鹿糖 + 6 g/L 瓊脂，pH 5.6-5.8 ； f.將步驟e所得的外植體轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30d后，轉(zhuǎn)至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至誘導(dǎo)出愈傷組織，并再生不定芽； 所述篩選培養(yǎng)基為:MS + 0.1 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + lOOmg/L kan + 30g/L鹿糖 + 6 g/L 瓊脂，pH 5.6-5.8 ； g.待f中不定芽生長(zhǎng)至2-3cm，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為25±1°C、光照強(qiáng)為3000-4000 Lux、光照時(shí)間為 14 h ； 所述生根培養(yǎng)基為:MS + 0.1 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + lOOmg/L kan + 30g/L鹿糖 + 6 g/L 瓊脂，pH 5.6-5.8 ； h.采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因甜葉菊的DNA，作為被檢測(cè)的模板，采用PCR法鑒定轉(zhuǎn)基因植株，所用特異性引物根據(jù)所轉(zhuǎn)目的基因設(shè)計(jì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因甜葉菊遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，所述的發(fā)根農(nóng)桿菌含有目的基因，含有攜帶目的基因的表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌是通過以下方法構(gòu)建的: 將目的基因插入表達(dá)載體啟動(dòng)子之后，通過凍融法將構(gòu)建好的攜帶目的基因的表達(dá)載體導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌，經(jīng)抗性篩選，獲得含有攜帶目的基因的表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因甜葉菊遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，所述的步驟c中將外植體浸泡于含有攜帶目的基因的表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌中的步驟是先將含有攜帶目的基因的表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌常規(guī)培養(yǎng)至0D6。。= 0.6后，加入終濃度為100 μ mol/L乙酰丁香酮，然后將外植體浸泡于該發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，時(shí)間為28-30 min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因甜葉菊遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，所述方法中包括經(jīng)共培養(yǎng)的莖尖外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因甜葉菊遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，所述方法中包括愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)的的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因甜葉菊遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，所述的S基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-芐胺基腺嘌呤，萘乙酸，3%蔗糖和0.6%瓊脂，Cef，kan，pH為5.6-5.8。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因甜葉菊遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，本方`法可應(yīng)用于其它雙子葉植物的轉(zhuǎn)基因。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103667343SQ201310652991
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】王鈺, 陳達(dá)偉, 湯其坤, 萬田, 胡同華 申請(qǐng)人:安徽大學(xué)