一種大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養(yǎng)的方法
【專利摘要】一種大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養(yǎng)的方法，本方法選取生長健壯的大苞鞘石斛母株，于開花時進行人工授粉，將授粉后發(fā)育至基本成熟而未開裂時的果實作為外植體，并經(jīng)過無菌播種、分化培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)基試管苗移栽等繁殖步驟。本發(fā)明具有種子萌發(fā)率高、成苗快、種苗品質(zhì)好等特點，能在短期內(nèi)獲得大量的試管苗，成苗的移栽成活率90%以上。能為大苞鞘石斛的種苗生產(chǎn)及資源保護提供一條有效的途徑。
【專利說明】—種大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體屬于一大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大荀鞘石斛又名騰沖石斛，學(xué)名生于海拔1350~1900 m的山地疏林中樹干上，主要分布于中國云南東南部至西部以及緬甸、泰國和印度東北部等地的熱帶雨林中，屬附生蘭?；ㄆ?1-5月，總狀花序具1- 3朵花，花被片白色，邊緣帶紫色，唇瓣頂端紫色基部金黃色，花梗和子房白色帶淡紫紅色，花大(花徑9.5 cm左右)、開展，花色艷麗，是石斛蘭中花大、色艷，觀賞價值很高的種類；其莖可作藥用，藥品名稱為扁黃草，性甘，微寒，具有益胃生津，滋陰清熱等功效。
[0003]我國石斛蘭原種資源豐富，但由于生境破壞、過渡采集及較長時期缺乏保護，野生資源數(shù)量明顯下降，針對這一狀況我們應(yīng)當(dāng)加快對我國石斛蘭原種種質(zhì)資源的研究與開發(fā)，提高繁殖速度和促進種質(zhì)保存，從而減緩人為破壞和資源瀕危的局面；鑒于石斛蘭的鑒定分類比較困難，甚至某些種類只有開花時才可鑒定，為此我們需要建立種質(zhì)資源庫，收集和整理我國石斛蘭原種資源，為 資源的有效保存、研究打下基礎(chǔ)；加強對野生石斛蘭資源的保護、開發(fā)與利用；加強和深化觀賞石斛蘭的育種研究，提高育種水平，培育出觀賞價值高、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新優(yōu)品種，同時要以工廠化、規(guī)模化生產(chǎn)為目標(biāo)，著力解決有開發(fā)前景的石斛蘭原種的快繁體系研究，且可結(jié)合試管苗和人工種子野生放養(yǎng)達到可持續(xù)發(fā)展的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養(yǎng)的方法。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案是:
一種大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養(yǎng)的方法，其特征在于:所述的方法包括以下步驟:
(1)選材:大苞鞘石斛蘭開花時選取生長健壯的母株進行人工授粉，授粉后果實成熟且外植體未開裂時作為外植體用播種；
(2)萌發(fā)培養(yǎng):將外植體用75%酒精擦拭表面，洗潔精清洗30min后自來水沖洗1 h，移置于超凈工作臺上，用75%的酒精消毒60 S，無菌水清洗2次，0.1%升汞溶液消毒15 min并搖動，無菌水清洗5次，取出大苞鞘石斛種胚，將種胚播于B5、綿白糖20 g/L—1、椰乳20%、瓊脂7.6 g/L-1混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為5.4的萌發(fā)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)50天，種胚萌發(fā)成原球莖；
(3)分化培養(yǎng):將原球莖轉(zhuǎn)接于花寶I號3g/L、蛋白胨2 g/L、NAA 0.2 mg/L、椰乳10%、馬鈴薯提取液10%、葡萄糖20 g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH為5.6的分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，培養(yǎng)時間70天，萌發(fā)后的綠色原球莖，接種10天后，最后形成完整植株小苗；
(4)增殖培養(yǎng):選取分化后的小苗接入CHB、NAA0.5、6_BA 0.2、椰乳10%、蔗糖30 g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為5.8的增殖培養(yǎng)基上進行叢生芽增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)150天長成無菌大苗；
(5)生根誘導(dǎo)培養(yǎng):將增殖后的無菌大苗轉(zhuǎn)入花寶2號3g/L、蛋白胨2 g/L、IBA I mg/L、椰乳10%、蔗糖30 g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為5.6的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行生根誘導(dǎo)，培養(yǎng)45天；
(6)壯苗培養(yǎng):將生根誘導(dǎo)的無菌苗在花寶I號3g/L、蛋白胨2 g/L、蔗糖30 g/L、活性炭I g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為5.6的壯苗培養(yǎng)基做壯苗生根培養(yǎng)，培養(yǎng)90天；
(7)試管苗移栽:無菌苗壯苗生根培養(yǎng)后栽植于1:1:0.5的松樹皮+珍珠巖+蘭花基石中，栽培基質(zhì)采用121 °C高壓蒸汽滅菌消毒120 min，栽培條件為遮陰40%的自然光照條件，80%相對濕度，25~29 °C。
[0006]所述的大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養(yǎng)的方法，其特征在于:所述的大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養(yǎng)的方法的所有步驟均在培養(yǎng)溫度為(23±1) °C，光照強度15001ux,光照時間16 h/d的條件下進行。
[0007]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供一種大苞鞘石斛的種苗試管繁殖無菌播種和組織培養(yǎng)方法，本方法選取生長健壯的大苞鞘石斛母株，于開花時進行人工授粉，將授粉后發(fā)育至基本成熟而未開裂時的果實作為外植體，并經(jīng)過無菌播種、分化培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)基試管苗移栽等繁殖步驟。本發(fā)明具有種子萌發(fā)率高、成苗快、種苗品質(zhì)好等特點，能在短期內(nèi)獲得大量的試管苗，成苗的移栽成活率90%以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為大苞鞘石斛種胚萌發(fā)過程圖。
[0009]圖2為大苞鞘石斛萌發(fā)培養(yǎng)圖。
[0010]圖3為大苞鞘石斛分化培養(yǎng)圖。
[0011]圖4為大苞鞘石斛增殖培養(yǎng)圖。
[0012]圖5為大苞鞘石斛生根培養(yǎng)圖。
[0013]圖6為大苞鞘石斛壯苗培養(yǎng)圖。
[0014]圖7為大苞鞘石斛移栽馴化培養(yǎng)圖。
[0015]實施例1:
無菌播種和組織培養(yǎng)的條件:培養(yǎng)溫度為(23±1) °C，光照強度15001UX，光照時間16
h/d
1、材料:大苞鞘石斛開花時選取生長健壯的母株進行人工授粉，授粉后果實210天成熟時作為外植體用播種。
[0016]2、萌發(fā)培養(yǎng):將外植體用75%酒精擦拭表面，洗潔精清洗30 min后自來水沖洗Ih，移置于超凈工作臺上，用75%的酒精消毒60 S，無菌水清洗2次，0.1%升汞溶液消毒15min并搖動，無菌水清洗5次，取出大苞鞘石斛種胚，將種胚播于B5、綿白糖20 g/L—1、椰乳20%、瓊脂7.6 g/L-1混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為5.4的萌發(fā)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)50天，種胚萌發(fā)成原球莖，原球莖長勢一致，色澤鮮綠，形狀飽滿，直徑在0.65 mm左右(圖1、2)。
[0017]3、分化培養(yǎng):將原球莖轉(zhuǎn)接于花寶I號3 g/L、蛋白胨2 g/L、NAA 0.2 mg/L、椰乳10%、馬鈴薯提取液10%、葡萄糖20 g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為5.6的分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，培養(yǎng)時間70天，萌發(fā)后的綠色原球莖，接種10天后，從原球莖頂端產(chǎn)生葉原基凸起，逐漸發(fā)育成幼葉，最后形成完整植株(圖3)，小苗高16.5mm左右。
[0018]4、增殖培養(yǎng):選取分化后的小苗接入CHB、NAA 0.5、6_BA 0.2、椰乳10%、蔗糖30g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為5.8的增殖培養(yǎng)基上進行叢生芽增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)150天(圖4)。小苗接入培養(yǎng)基后10天根系開始生長，20天莖部增粗，30天莖基部分化不定芽，此階段基本沒有苗進行高生長，之后莖基部的不定芽不斷增加生長，最初接入的小苗老化死亡。新生的不定芽葉片長度和寬度指標(biāo)明顯高于接入時的小苗，并且開始進行高生長，節(jié)間明顯，具2節(jié)。當(dāng)不定芽長到一定程度時又開始以自身作為母株進行不定芽的增殖，并在增殖到一定數(shù)量后老化死亡。
[0019]5、將增殖后的無菌大苗轉(zhuǎn)入花寶2號3 g/L、蛋白胨2 g/L、IBA I mg/L、椰乳10%、蔗糖30 g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為5.6的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行生根誘導(dǎo)，培養(yǎng)45天，苗體健壯，生根率100%，生根粗壯，根毛豐富，平均根數(shù)2.3條(圖5)。
[0020]6、壯苗培養(yǎng):將生根誘導(dǎo)的無菌苗在花寶I號3 g/L、蛋白胨2 g/L、蔗糖30 g/L、活性炭I g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為5.6的壯苗培養(yǎng)基做壯苗生根培養(yǎng)，培養(yǎng)90天，植株健壯(莖高3cm以上，莖粗3mm左右)、葉片開展有光澤、葉色濃綠、根粗壯、根毛豐富 ，平均根數(shù)4條(圖6)。
[0021]7、試管苗移栽:無菌苗壯苗生根培養(yǎng)后栽植于1:1:0.5的松樹皮+珍珠巖+蘭花基石中，栽培基質(zhì)采用121 °C高壓蒸汽滅菌消毒120 min，栽培條件為遮陰40%的自然光照條件，80%相對濕度，25~29°C，，移栽成活率92 % (圖7)。
[0022]實施例中使用的花寶I號(HYPONeX I)和花寶2號(HYPONeX 2)均為美國生產(chǎn)臺灣臺和園藝企業(yè)股份有限股份有限公司分裝產(chǎn)品。
[0023]實施例中使用的綿白糖為玉棠牌優(yōu)級綿白糖。
[0024]實施例中使用的基本培養(yǎng)基成分見下表。
【權(quán)利要求】
1.一種大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養(yǎng)的方法，其特征在于:所述的方法包括以下步驟: (1)選材:大苞鞘石斛蘭開花時選取生長健壯的母株進行人工授粉，授粉后果實成熟且外植體未開裂時作為外植體用播種； (2)萌發(fā)培養(yǎng):將外植體用75%酒精擦拭表面，洗潔精清洗30min后自來水沖洗I h，移置于超凈工作臺上，用75%的酒精消毒60 S，無菌水清洗2次，0.1%升汞溶液消毒15 min并搖動，無菌水清洗5次，取出大苞鞘石斛種胚，將種胚播于B5、綿白糖20 g/L—1、椰乳20%、瓊脂7.6 g/L—1混合配制的pH調(diào)節(jié)為5.4的萌發(fā)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)50天，種胚萌發(fā)成原球莖； (3)分化培養(yǎng):將原球莖轉(zhuǎn)接于花寶I號3g/L、蛋白胨2 g/L、NAA 0.2 mg/L、椰乳10%、馬鈴薯提取液10%、葡萄糖20 g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的pH調(diào)節(jié)為5.6的分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，培養(yǎng)時間70天，萌發(fā)后的綠色原球莖，接種10天后，最后形成完整植株小苗； (4)增殖培養(yǎng):選取分化后的小苗接入CHB、NAA0.5、6-BA 0.2、椰乳10%、蔗糖30 g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的pH調(diào)節(jié)為5.8的增殖培養(yǎng)基上進行叢生芽增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)150天長成無菌大苗； (5)生根誘導(dǎo)培養(yǎng):將增殖后的無菌大苗轉(zhuǎn)入花寶2號3g/L、蛋白胨2 g/L、IBA I mg/L、椰乳10%、蔗糖30 g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的pH調(diào)節(jié)為5.6的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行生根誘導(dǎo)，培養(yǎng)45天； (6)壯苗培養(yǎng):將生根誘導(dǎo)的無菌苗在花寶I號3g/L、蛋白胨2 g/L、蔗糖30 g/L、活性炭I g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的pH調(diào)節(jié)為5.6的壯苗培養(yǎng)基做壯苗生根培養(yǎng)，培養(yǎng)90天； (7)試管苗移栽:無菌苗壯苗生根培養(yǎng)后栽植于1:1:0.5的松樹皮+珍珠巖+蘭花基石中，栽培基質(zhì)采用121 °C高壓蒸汽滅菌消毒120 min，栽培條件為遮陰40%的自然光照條件，80%相對濕度，25~29 °C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養(yǎng)的方法，其特征在于:所述的大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養(yǎng)的方法的所有步驟均在培養(yǎng)溫度為(23±1)°C，光照強度15001UX，光照時間16 h/d的條件下進行。
【文檔編號】A01H4/00GK103636500SQ201310653314
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】王偉, 盧珊, 金荷仙, 陳香波, 夏守慧, 康華靖, 徐雙雙 申請人:溫州科技職業(yè)學(xué)院