一種丹參人工栽培方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種丹參人工栽培方法，利用丹參內(nèi)生真菌對宿主植物丹參生長的影響，采用真菌發(fā)酵液浸種法，丹參種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均顯著高于對照；采用丹參苗與真菌進(jìn)行共培養(yǎng)法，促進(jìn)丹參苗生長；采用真菌發(fā)酵液噴灑，促進(jìn)丹參生長及品質(zhì)提高，本發(fā)明在丹參人工栽培中有效地利用內(nèi)生真菌，促進(jìn)丹參種子的萌發(fā)和丹參苗生長，顯著地提高人工栽培丹參生長狀態(tài)，為丹參的人工種植和移栽奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】一種丹參人工栽培方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于丹參栽培領(lǐng)域，具體涉及一種丹參人工栽培方法。
【背景技術(shù)】
[0002]內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指在生活史中的某一個階段存在于健康植物組織內(nèi)部，不會引起宿主明顯病癥或者對宿主造成明顯傷害的真菌。研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌可以通過改善植物的營養(yǎng)條件，促進(jìn)植物生長，表現(xiàn)在增加植物的總生物量、提高種子發(fā)芽率、幼苗存活率以及抑制病原菌等多個方面；還可以通過產(chǎn)生次生代謝物及快速激活宿主的逆境反應(yīng)系統(tǒng)，增強(qiáng)宿主對環(huán)境的生態(tài)適應(yīng)能力。內(nèi)生真菌在生物制藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、工業(yè)發(fā)酵等方面上表現(xiàn)出美好的應(yīng)用前景，已受到世界各國專家的廣泛關(guān)注。
[0003]原料藥丹參為唇形科植物丹參Salvia mihiorrhiza Bunge的干燥根及根莖,用于治療冠心病、腦血管疾病和誘導(dǎo)各種癌細(xì)胞凋亡等，隨著丹參新藥的不斷研制開發(fā)及市場需求量的增加，對丹參需求量亦明顯攀升。丹參的需求量逐漸增加，野生資源不能滿足需要，人工栽培成為解決藥源的根本途徑。丹參繁殖方法有種子繁殖、分根繁殖、扦插繁殖和蘆頭繁殖等，由于分根繁殖、扦插繁殖和蘆頭繁殖能夠縮短丹參生長周期而為人們所常用，但種植的丹參由于長期的無性繁殖，有效成分含量極不穩(wěn)定、感染病毒病等現(xiàn)象導(dǎo)致品質(zhì)和產(chǎn)量的下降，嚴(yán)重影響了臨床應(yīng)用和制藥工業(yè)的發(fā)展。丹參以種子繁殖能很好的解決由于長期的無性繁殖導(dǎo)致品質(zhì)和產(chǎn)量下降等問題。然而在自然條件下丹參種子萌發(fā)率低，不耐貯藏，常溫干燥貯藏丹參種子，每放置30天種子發(fā)芽率就下降10%，貯藏時間超過半年，其發(fā)芽率低于40%，從而嚴(yán)重影響了丹參的人工栽培。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種丹參人工栽培方法。
[0005]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案。
[0006]一種丹參人工栽培方法，該丹參人工栽培方法包括以下步驟:
[0007]I)浸種:將丹參種子消毒后置于經(jīng)過滅菌的丹參內(nèi)生真菌發(fā)酵液中浸泡10_12h ；
[0008]2)萌發(fā):浸種后用無菌水沖洗丹參種子，然后用無菌濾紙吸干丹參種子表面水分，然后放在超凈工作臺內(nèi)晾干，將晾干后的丹參種子靜置于平皿中的襯墊物上，襯墊物包括鋪于平皿底部的經(jīng)無菌水浸潤的若干層濾紙以及鋪于所述若干層濾紙上的若干層紗布，靜置過程中定時向平皿中噴無菌水以保持襯墊物濕潤；
[0009]3)萌發(fā)后的丹參種子經(jīng)過育苗后移栽。
[0010]所述丹參種子為當(dāng)年的新種子或者貯藏一年至兩年的種子。
[0011]所述靜置過程中采用全天光照，溫度控制在25_27°C。
[0012]所述育苗包括以下步驟:
[0013]將萌發(fā)后的丹參種子轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)得丹參苗，培養(yǎng)條件為:溫度為晝 / 夜=23-25°C /16-18°C，光照周期為 12/12h，照度為 1800_2000Lx。[0014]所述丹參人工栽培方法還包括以下步驟:
[0015]在育苗階段，待丹參苗生長至株高2~3cm后，將丹參內(nèi)生真菌打成菌餅，將菌餅接種于與丹參苗相距l(xiāng)_2cm處的培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)條件為:溫度為晝/夜=23-250C /16-18°C，光照周期為 12/12h，照度為 1800_2000Lx。
[0016]所述丹參內(nèi)生真菌為茴香裸胞殼(Emericella foeniculicola)。
[0017]所述丹參內(nèi)生真菌為茴香裸胞殼(Emericella foeniculicola)TR21菌株、茴香裸胞殼(Emericella foeniculicola) N157 菌株、茴香裸胞殼(Emericella foeniculicola)NUl52 菌株或茴香裸胞殼(Emericella foeniculicola) U104 菌株。
[0018]移栽15-20天后用丹參內(nèi)生真菌發(fā)酵液進(jìn)行噴灑處理，每4-5株苗一次噴灑10-15mL丹參內(nèi)生真菌發(fā)酵液，每周噴灑一次。
[0019]用于噴灑處理的丹參內(nèi)生真菌發(fā)酵液為茴香裸胞殼(Emericellafoeniculicola) TR21 菌株、茴香裸胞殼(Emericella foeniculicola) N157 菌株或茴香裸胞殼(Emericella foeniculicola) U104 菌株的發(fā)酵液。
[0020]所述丹參內(nèi)生真菌發(fā)酵液的制備方法包括以下步驟:將丹參內(nèi)生真菌接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，然后置于恒溫?fù)u床中于25-28°C、130-160r/min條件下振蕩培養(yǎng)三到四周得菌培養(yǎng)液，將菌培養(yǎng)液中的菌絲體經(jīng)真空抽濾除去，然后以4000-5000r/min離心20-30min，得丹參內(nèi)生真菌發(fā)酵液。
[0021]本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在:本發(fā)明在丹參人工栽培中有效地利用內(nèi)生真菌，促進(jìn)丹參種子的萌發(fā)，并且可 以進(jìn)一步促進(jìn)丹參苗生長以及顯著地提高人工栽培丹參生長狀態(tài)和品質(zhì)，為丹參的高效人工種植奠定基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為各菌株對2010年丹參種子發(fā)芽勢的影響；
[0023]圖2為各菌株對2010年丹參種子發(fā)芽率的影響；
[0024]圖3為各菌株對2011年丹參種子發(fā)芽勢的影響；
[0025]圖4為各菌株對2011年丹參種子發(fā)芽率的影響；
[0026]圖5為各菌株對2012年丹參種子發(fā)芽勢的影響；
[0027]圖6為各菌株對2012年丹參種子發(fā)芽率的影響；
[0028]圖中:**表示與對照組(CK)比較極顯著，*表示與對照組(CK)比較顯著。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作詳細(xì)說明。
[0030]在本發(fā)明的前期工作中，分離出一株產(chǎn)丹參酮II A內(nèi)生真菌TR21，以TR21為出發(fā)菌株通過誘變方法誘變出3株能夠高產(chǎn)丹參酮II A的內(nèi)生真菌(參見文獻(xiàn)I)，本發(fā)明旨在觀察這4株菌對丹參生長的影響作用，從內(nèi)源角度解決丹參人工栽培品質(zhì)下降等問題。
[0031]文獻(xiàn)(I) Caixia Ma, Dongliang Jiang, Xiying We1.Mutation breeding ofEmericella foeniculicola TR21for improved production of tanshinone IIA.ProcessBiochemistry, 2011, 46(10):2059 ~2063.[0032]I材料與方法[0033]1.1 材料
[0034]1.1.1 培養(yǎng)基
[0035]馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL, pH自然(即不做PH的調(diào)整)；
[0036]馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB):馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水lOOOmL，pH自然；
[0037]MS培養(yǎng)基:配方見表1，調(diào)pH為5.7~6。
[0038]表1
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種丹參人工栽培方法，其特征在于:該丹參人工栽培方法包括以下步驟: 1)浸種:將丹參種子消毒后置于經(jīng)過滅菌的丹參內(nèi)生真菌發(fā)酵液中浸泡10-12h； 2)萌發(fā):浸種后用無菌水沖洗丹參種子，然后用無菌濾紙吸干丹參種子表面水分，然后放在超凈工作臺內(nèi)晾干，將晾干后的丹參種子靜置于平皿中的襯墊物上，靜置過程中定時向平皿中噴無菌水以保持襯墊物濕潤； 3)萌發(fā)后的丹參種子經(jīng)過育苗后移栽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種丹參人工栽培方法，其特征在于:所述丹參種子為當(dāng)年的新種子或者貯藏一年至兩年的種子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種丹參人工栽培方法，其特征在于:所述靜置過程中采用全天光照，溫度控制在25-27 °C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種丹參人工栽培方法，其特征在于:所述育苗包括以下步驟: 將萌發(fā)后的丹參種子轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)得丹參苗，培養(yǎng)條件為:溫度為晝/夜=23-25°C /16-18°C，光照周期為 12/12h，照度為 1800_2000Lx。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種丹參人工栽培方法，其特征在于:所述丹參人工栽培方法還包括以下步驟: 在育苗階段，待丹參苗生長至株高2~3cm后，將丹參內(nèi)生真菌打成菌餅，將菌餅接種于與丹參苗相距l(xiāng)_2cm處的培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)條件為:溫度為晝/夜=23-250C /16-18°C，光照周期為 12/12h，照度為 1800_2000Lx。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述一種丹參人工栽培方法，其特征在于:所述丹參內(nèi)生真菌為茴香裸胞殼(Emericella foeniculicola)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述一種丹參人工栽培方法，其特征在于:所述丹參內(nèi)生真菌為茵香裸胞殼(Emericella foeniculicola) TR21菌株、茵香裸胞殼(Emericellafoeniculicola)N157 菌株、茴香裸胞殼(Emericella foeniculicola)NU152 菌株或茴香裸胞殼(Emericella foeniculicola) U104 菌株。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種丹參人工栽培方法，其特征在于:移栽15-20天后用丹參內(nèi)生真菌發(fā)酵液進(jìn)行噴灑處理，每4-5株苗一次噴灑10-15mL丹參內(nèi)生真菌發(fā)酵液，每周噴灑一次。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種丹參人工栽培方法，其特征在于:用于噴灑處理的丹參內(nèi)生真菌發(fā)酵液為茴香裸胞殼(Emericella foeniculicola) TR21菌株、茴香裸胞殼(Emericella foeniculicola)NI57 菌株或茴香裸胞殼(Emericella foeniculicola)U104菌株的發(fā)酵液。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述一種丹參人工栽培方法，其特征在于:所述丹參內(nèi)生真菌發(fā)酵液的制備方法包括以下步驟:將丹參內(nèi)生真菌接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，然后置于恒溫?fù)u床中于25-28°C、130-160r/min條件下振蕩培養(yǎng)三到四周得菌培養(yǎng)液，將菌培養(yǎng)液中的菌絲體經(jīng)真空抽濾除去，然后以4000-5000r/min離心20_30min，得丹參內(nèi)生真菌發(fā)酵液。
【文檔編號】A01G1/00GK103733829SQ201310655949
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】魏希穎, 王鳳霞, 馬彩霞, 萬陜寧, 井明博, 劉穎, 王喆之 申請人:陜西師范大學(xué)