一種獲得植物高花青素含量毛狀根的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種獲得植物高花青素含量毛狀根的方法，它涉及植物【技術(shù)領(lǐng)域】，將植物中調(diào)控花青素合成代謝的MYB基因AmROS1和bHLH基因AmDEL分別構(gòu)建到載體PJAM1502和載體pK7WG2D中獲得PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL；并將PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL轉(zhuǎn)化到發(fā)根農(nóng)桿菌中，獲得包含質(zhì)粒PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL的發(fā)根農(nóng)桿菌；利用轉(zhuǎn)化后的發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物組織器官，共培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)后，誘導(dǎo)出高花青素含量的毛狀根。本發(fā)明在植物毛狀根中同時(shí)表達(dá)調(diào)控花青素合成代謝的轉(zhuǎn)錄因子MYB基因和bHLH基因，獲得特定植物高花青素含量的毛狀根。
【專利說(shuō)明】一種獲得植物高花青素含量毛狀根的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種獲得植物高花青素含量毛狀根的方法，屬于植物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】:
[0002]花青素是一類陸生植物特有并普遍存在的水溶性色素，賦予植物器官紅、粉紅、藍(lán)和紫等色彩。作為食物，花青素不僅是優(yōu)良的食品添加劑，而且具有抗心率失調(diào)，抗癌的功能，降低心血管疾病，肥胖癥，糖尿病的發(fā)病率。 [0003]花青素屬于酚類化合物中的類黃酮類化合物?；窘Y(jié)構(gòu)單元是2-苯基苯并吡喃型陽(yáng)離子，即花色基元?；ㄉ鶐Яu基數(shù)、甲基化、醣基化數(shù)目、種類和連接位置的差異，形成200多種不同的化合物。這些不同結(jié)構(gòu)的花青素會(huì)呈現(xiàn)不同顏色，具有不同的保健功能和藥用價(jià)值(范和邱，1998)。花色基元的羥基化，甲基化，糖基化等修飾由不同的基因控制。由于系統(tǒng)發(fā)生上的差異，不同植物可能所具有的花青素修飾基因有所差異，因此其所含有的花青素也有可能不同。例如，大牽牛天堂藍(lán)花中的一種花青素含有6個(gè)葡萄糖和3個(gè)咖啡酸，是目前發(fā)現(xiàn)的最大的花青素類化合物，還沒有在其它植物中發(fā)現(xiàn)。
[0004]目前花青素主要來(lái)源于產(chǎn)量較高的水果和蔬菜的塊莖和果實(shí)中，如紫甘薯、越橘、酸果蔓、黑枸杞、藍(lán)莓、葡萄、接骨木紅、黑加侖、紫胡蘿卜和紅甘藍(lán)。由于植物的來(lái)源較為單一，所以所獲得花青素的種類也就不是十分豐富。從更多植物中獲取花青素，是擴(kuò)大花青素資源庫(kù)的重要手段。但是許多植物需要在特殊的環(huán)境下才能完成發(fā)芽，生長(zhǎng)，開花，結(jié)果等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，同時(shí)花青素也僅僅在植物特定器官中，如花中積累，其本身生物量較小，極大地限制了更多種類的花青素被人們使用。
[0005]毛狀根是發(fā)根農(nóng)桿菌侵染宿主植物受傷部位的細(xì)胞產(chǎn)生的大量不定根。其生長(zhǎng)迅速，激素自主，分化水平高，遺傳性狀穩(wěn)定，是理想的生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)的組織。但自然情況下植物毛狀根中花青素的合成代謝積累較少。植物中花青素合成代謝的結(jié)構(gòu)基因受MYB基因和bHLH基因的調(diào)控。已有研究者將分別過(guò)量表達(dá)MYB基因和bHLH基因的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行雜交，獲得同時(shí)過(guò)量表達(dá)MYB基因和bHLH基因的轉(zhuǎn)基因植株，該植株中花青素合成代謝的結(jié)構(gòu)基因被誘導(dǎo)表達(dá)，在植物體內(nèi)積累大量的花青素。毛狀根不能進(jìn)行有性雜交，并且在一個(gè)載體中同時(shí)過(guò)量表達(dá)兩個(gè)基因的構(gòu)建工作較為困難，因此高花青素含量的植物毛狀根的獲得較為困難。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006]針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種獲得植物高花青素含量毛狀根的方法。
[0007]本發(fā)明的一種獲得植物高花青素含量毛狀根的方法，它獲得的步驟如下:
[0008](一)、設(shè)計(jì)包含AttBladapter和AttB2adapter的引物，將植物中調(diào)控花青素合成代謝的MYB基因AmROSl和bHLH基因AmDEL通過(guò)Gateway克隆的BP反應(yīng)連接到載體pD0NR207 ;然后利用Gateway克隆的LR反應(yīng)將AmROSI和AmDEL分別連接到載體PJAMl502 (卡那霉素抗性)和載體pK7WG2D (壯觀霉素抗性)中獲得PJAM1502: =AmROSl和PK7WG2D: =AmDEL ；
[0009]( 二 )、利用電轉(zhuǎn)化的方法將PJAM1502: =AmROSl和pK7WG2D: =AmDEL轉(zhuǎn)化到發(fā)根農(nóng)桿菌Arll93(利福平抗性)中，通過(guò)利福平、卡那霉素和壯觀霉素抗生素篩選，獲得PJAMl502: =AmROSl 和 pK7WG2D: =AmDEL 的發(fā)根農(nóng)桿菌；
[0010](三)、煙草在無(wú)菌培養(yǎng)基上發(fā)芽生長(zhǎng)19天，在超凈臺(tái)中將煙草葉片剪成小方塊，侵染20分鐘，共培養(yǎng)2天后，在MS固體培養(yǎng)基(250mg/L塞福隆，50mg/L卡那霉素)培養(yǎng)20天后，在煙草的傷口處出現(xiàn)紫色毛狀根； [0011](四)、將毛狀根放入三角瓶中，并加入MS液體培養(yǎng)基(250mg/L塞福隆，50mg/L卡那霉素)，培養(yǎng)28天后，測(cè)定毛狀根中花青素含量為132mg/100g，接近水果藍(lán)莓中的花青素含量；
[0012](五)、質(zhì)譜鑒定毛狀根中含有3種花青素類化合物，與煙草花中花青素種類與結(jié)構(gòu)相同。
[0013]本發(fā)明在植物毛狀根中同時(shí)表達(dá)調(diào)控花青素合成代謝的轉(zhuǎn)錄因子MYB基因和bHLH基因，獲得植物高花青素含量的毛狀根。
【具體實(shí)施方式】:
[0014]本【具體實(shí)施方式】采用以下技術(shù)方案:它獲得的步驟如下:
[0015](一 )、設(shè)計(jì)包含AttBladapter和AttB2adapter的引物,將植物中調(diào)控花青素合成代謝的MYB基因AmROSl和AmDEL通過(guò)Gateway克隆的BP反應(yīng)連接到載體pD0NR207 ;然后利用Gateway克隆的LR反應(yīng)將AmROSl和AmDEL分別連接到載體PJAM1502 (卡那霉素抗性)和載體PK7WG2D (壯觀霉素抗性)中獲得PJAMl502::AmROSI和pK7WG2D: =AmDEL ；
[0016]( 二 )、利用電轉(zhuǎn)化的方法將PJAM1502: =AmROSl和pK7WG2D: =AmDEL轉(zhuǎn)化到發(fā)根農(nóng)桿菌(利福平抗性)中，通過(guò)利福平、卡那霉素和壯觀霉素抗生素篩選，獲得PJAM1502::AmROSl和pK7WG2D: =AmDEL的發(fā)根農(nóng)桿菌；
[0017](三)、煙草在無(wú)菌培養(yǎng)基上發(fā)芽生長(zhǎng)19天，在超凈臺(tái)中將煙草葉片剪成小方塊，侵染20分鐘，共培養(yǎng)2天后，在MS固體培養(yǎng)基(塞福隆，卡那霉素)培養(yǎng)20天后，在煙草的傷口處出現(xiàn)紫色毛狀根；
[0018](四)、將毛狀根放入三角瓶中，加入MS液體培養(yǎng)基(250mg/L塞福隆，50mg/L卡那霉素)，培養(yǎng)28天后，測(cè)定毛狀根中花青素含量為132mg/100g，接近水果藍(lán)莓中的花青素含量(145mg/100g)；
[0019](五)、質(zhì)譜鑒定毛狀根中含有3種花青素類化合物，與煙草花中花青素種類與結(jié)構(gòu)相同。
[0020]本【具體實(shí)施方式】將調(diào)控花青素合成代謝的MYB基因和bHLH基因同時(shí)轉(zhuǎn)化到同一個(gè)發(fā)根農(nóng)桿菌中，轉(zhuǎn)化植物組織器官，獲得高花青素含量的毛狀根。
[0021]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
【權(quán)利要求】
1.一種獲得植物高花青素含量毛狀根的方法，其特征在于:它獲得的步驟如下: (一)、設(shè)計(jì)包含AttBladapter和AttB2adapter的引物,將植物中調(diào)控花青素合成代謝的MYB基因AmROSl和bHLH基因AmDEL通過(guò)Gateway克隆的BP反應(yīng)連接到載體pD0NR207 ；然后利用Gateway克隆的LR反應(yīng)將AmROSl和AmDEL分別連接到載體PJAM1502 (卡那霉素抗性)和載體PK7WG2D (壯觀霉素抗性)中獲得PJAMl502: =AmROSl和pK7WG2D: =AmDEL ；(二 )、利用電轉(zhuǎn)化的方法將PJAM1502: =AmROSl和pK7WG2D: =AmDEL轉(zhuǎn)化到發(fā)根農(nóng)桿菌Arll93中，通過(guò)利福平、卡那霉素和壯觀霉素抗生素篩選，獲得包含PJAM1502: =AmROSl和pK7WG2D: =AmDEL的發(fā)根農(nóng)桿菌； (三)、煙草在無(wú)菌培養(yǎng)基上發(fā)芽生長(zhǎng)19天，在超凈臺(tái)中將煙草葉片剪成小方塊，侵染20分鐘，共培養(yǎng)2天后，在MS固體培養(yǎng)基(250mg/L塞福隆，50mg/L卡那霉素)培養(yǎng)20天后，在煙草的傷口處出現(xiàn)紫色毛狀根； (四)、將毛狀根放入三角瓶后，加入MS液體培養(yǎng)基(250mg/L塞福隆，50mg/L卡那霉素)，震蕩培養(yǎng)28天后，測(cè)定毛狀根中花青素含量為132mg/100g，接近水果藍(lán)莓中的花青素含量; (五)、質(zhì)譜鑒定毛狀根中含有3種花青素類化合物，與煙草花中花青素種類與結(jié)構(gòu)相同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種獲得植物高花青素含量毛狀根的方法，其特征在于:將調(diào)控花青素合成代謝的MYB基因和bHLH基因轉(zhuǎn)化到同一個(gè)發(fā)根農(nóng)桿菌中，侵染植物的組織器官，獲得高花青素含 量的毛狀根。
【文檔編號(hào)】A01H5/06GK103695460SQ201310656046
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】劉寶龍, 張懷剛, 劉登才, 張波, 陳文杰, 沈?；? 魏樂(lè) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所