一種海藻酚酸類物質的分離純化方法與用途
【專利摘要】本發(fā)明是一種海藻酚酸類物質的分離純化方法，取新鮮江蘺烘干后，粉碎，用甲醇/丙酮/蒸餾水混合溶劑浸泡提取，得濃縮浸提液；調(diào)pH至2.0，離心，上清液萃取，混合有機溶劑萃取下層溶液，收集上層，蒸干得酚酸粗提物；粗提物溶解于甲醇，點樣于硅膠GF254上，展開；合并收集相同Rf處條帶，重新溶解于丙酮，經(jīng)離心和減壓濃縮，制備到4種組分，記為組分A1、組分A2、組分A3和組分A4；減壓蒸干，制備到4種酚酸類物質。本發(fā)明方法工藝設計合理、工藝可操作性強、提取產(chǎn)物純度高。本發(fā)明所述方法制得的酚酸類物質可以用來抑制米氏凱倫藻、中肋骨條藻和塔瑪亞歷山大藻的生長。
【專利說明】一種海藻酚酸類物質的分離純化方法與用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于海洋生化工程領域，具體涉及一種海藻酚酸類物質的分離純化方法。本發(fā)明還涉及前述方法制得的酚酸類物質的抑藻用途。
【背景技術】
[0002]海藻不僅能夠凈化水質，還能與赤潮微藻進行營養(yǎng)競爭，防止赤潮微藻的爆發(fā)性繁殖與增長；同時，通過向環(huán)境中分泌某些化感物質，抑制赤潮微藻的生長。研究表明，海藻體內(nèi)的某些次生代謝物是引起這種生長抑制作用的主要原因。目前，已經(jīng)鑒定出墨角藻中的聚酚、海頭紅體內(nèi)的單萜、川蔓體內(nèi)的二萜、小珊瑚藻中的溴仿和孔石莼體內(nèi)的不飽和脂肪酸等化感物質能抑制某些微藻生長的物質。海藻分泌的化感物質還包括生物堿、酚酸、硫化物、糖苷、內(nèi)酯、鞣酸、有機酸和糖類等，通過滲濾、揮發(fā)和分泌等多種方式釋放到環(huán)境中。其中，酚酸類物質是研究最多、也是被證實化感活性較強的一類物質。大部分酚酸類物質具有化感作用，植物種子的萌發(fā)以及植物的生長都能受酚酸類物質的抑制，然而，現(xiàn)有技術中海藻酚酸類物質的分離純化研究很少。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種工藝設計合理、工藝可操作性強、提取產(chǎn)物純度高的一種海藻酚酸類物質的分離純化方法。
[0004]本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供上述方法制得的酚酸類物質的抑藻用途。
[0005]本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種海藻酚酸類物質的分離純化方法，其特點是，其步驟如下:
(1)取新鮮江蘺50°C下烘干后，粉碎至0.3 mm干粉末；采用體積比為1:1:1的甲醇/丙酮/蒸餾水混合溶劑對江蘺干粉末進行浸泡提取，經(jīng)離心、過濾和減壓蒸餾，獲得濃縮浸提液；
(2)用2mol/L HCl調(diào)濃縮浸提液pH至2.0，離心后，上清液用正已烷萃取，棄去上層，保留下層溶液；用體積比為0.8:1的乙醚/乙酸乙酯混合有機溶劑萃取下層溶液，收集上層，上層經(jīng)無水硫酸鈉除水后，40°C下減壓蒸干，制備到酚酸粗提物；
(3)將酚酸粗提物重新溶解于甲醇，獲得待分離甲醇溶液；將此溶液點樣于硅膠GF254上，以體積比為15:3:2的氯仿/丙酮/甲酸為展開劑展開；在紫外254 nm下，出現(xiàn)4個斑點，< 分別為0.22,0.37,0.63和0.77 ;在此基礎上，以劃線法多次點樣，合并收集相同/Pf處條帶，重新溶解于丙酮，經(jīng)離心和減壓濃縮，制備到4種組分，記為組分Al、組分A2、組分A3和組分A4 ；
(4)取0.1 mL 4種組分的濃縮液，加入到質量溶度為1-5%的三氯化鐵溶液中，觀察顏色反應，發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)藍綠色，為酚酸類物質的陽性反應；將此4種組分溶液點樣于硅膠GF254上，分別在氯仿/甲醇，環(huán)己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水3種展開劑下展開，發(fā)現(xiàn)此4種組分均呈現(xiàn)單一斑點，其中組分A1、A2展開劑條件為體積比4:1的氯仿/甲醇、體積比1:2的環(huán)己烷/乙酸乙酯、體積比4:1:2的正丁醇/醋酸/水；組分A3、A4展開劑條件為體積比8:1的氯仿/甲醇、體積比1:1的環(huán)己烷/乙酸乙酯、體積比4:1:1正丁醇/醋酸/水；同時，采用通用型顯色劑10%硫酸溶液和碘以及專屬顯色劑三氯化鐵溶液，發(fā)現(xiàn)在此3種顯色劑下，此4種組分同樣呈現(xiàn)單一斑點，表明純度達到了薄層純；減壓蒸干，制備到4種酚酸類物質。[0006]本發(fā)明的原料江籬(JJreicileiriei lemanei formis)分類上歸屬于紅藻門(Rhodovhyta),真紅藻綱(Florideophyceae),杉藻目(Gigartinales),江籬科(Gracilariaccac),廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶海區(qū),在我國常見的一種經(jīng)濟海藻。在實驗過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)江籬溶劑提取物中可能含有較高含量的酚酸，并且這些溶劑提取物具有抑制米氏凱倫藻、中肋骨條藻和塔瑪亞歷山大藻等赤潮微藻生長的作用。鑒于此，通過一系列實驗，進行江蘺酚酸類物質的分離純化研究，不僅填補了國內(nèi)外關于江蘺酚酸類物質的分離純化工藝空白，而且為其他海藻酚酸類物質的分離純化研究提供了參考，具有重要的理論意義和實際應用價值。
【具體實施方式】
[0007]以下進一步描述本發(fā)明的具體技術方案，以便于本領域的技術人員進一步地理解本發(fā)明，而不構成對其權利的限制。
[0008]實施例1，一種海藻酚酸類物質的分離純化方法，其步驟如下:
(1)取新鮮江蘺50°C下烘干后，粉碎至0.3 mm干粉末；采用體積比為1:1:1的甲醇/丙酮/蒸餾水混合溶劑對江蘺干粉末進行浸泡提取，經(jīng)離心、過濾和減壓蒸餾，獲得濃縮浸提液；
(2)用2mol/L HCl調(diào)濃縮浸提液pH至2.0，離心后，上清液用正已烷萃取，棄去上層，保留下層溶液；用體積比為0.8:1的乙醚/乙酸乙酯混合有機溶劑萃取下層溶液，收集上層，上層經(jīng)無水硫酸鈉除水后，40°C下減壓蒸干，制備到酚酸粗提物；
(3)將酚酸粗提物重新溶解于甲醇，獲得待分離甲醇溶液；將此溶液點樣于硅膠GF254上，以體積比為15:3:2的氯仿/丙酮/甲酸為展開劑展開；在紫外254 nm下，出現(xiàn)4個斑點，< 分別為0.22,0.37,0.63和0.77 ;在此基礎上，以劃線法多次點樣，合并收集相同/Pf處條帶，重新溶解于丙酮，經(jīng)離心和減壓濃縮，制備到4種組分，記為組分Al、組分A2、組分A3和組分A4 ；
(4)取0.1 mL 4種組分的濃縮液，加入到質量溶度為1-5%的三氯化鐵溶液中，觀察顏色反應，發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)藍綠色，為酚酸類物質的陽性反應；將此4種組分溶液點樣于硅膠GF254上，分別在氯仿/甲醇，環(huán)己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水3種展開劑下展開，發(fā)現(xiàn)此4種組分均呈現(xiàn)單一斑點，其中組分A1、A2展開劑條件為體積比4:1的氯仿/甲醇、體積比1:2的環(huán)己烷/乙酸乙酯、體積比4:1:2的正丁醇/醋酸/水；組分A3、A4展開劑條件為體積比8:1的氯仿/甲醇、體積比1:1的環(huán)己烷/乙酸乙酯、體積比4:1:1正丁醇/醋酸/水；同時，采用通用型顯色劑10%硫酸溶液和碘以及專屬顯色劑三氯化鐵溶液，發(fā)現(xiàn)在此3種顯色劑下，此4種組分同樣呈現(xiàn)單一斑點，表明純度達到了薄層純；減壓蒸干，制備到4種酚酸類物質。[0009]實施例2，一種海藻酚酸類物質的分離純化方法實驗:
稱取江蘺干粉末80 g，溶解于400 mL甲醇/丙酮/蒸餾水混合溶劑(體積比1:1:1)中，黑暗、室溫下浸泡提取3d。提取3次后，合并浸提液，經(jīng)離心、過濾和減壓蒸餾，獲得40mL濃縮浸提液；(2)用2mol/LHCl調(diào)濃縮浸提液pH至2.0,離心后，上清液用正已烷萃取3次后，棄去上層，保留下層溶液。用混合有機溶劑乙醚/乙酸乙酯(體積比0.8:1)萃取此溶液3次，收集上層。上層經(jīng)無水硫酸鈉除水后，40°C下減壓蒸干，制備到1.03 g酚酸粗提物；(3)酚酸粗提物重新溶解于甲醇，獲得待分離甲醇溶液5 mL0將此溶液點樣于硅膠GF254上，以氯仿/丙酮/甲酸(15:3:2)為展開劑展開。在紫外254 nm下，出現(xiàn)4個斑點，TPf分別為0.22、0.37、0.63和0.77。在此基礎上，以劃線法多次點樣，合并收集相同/Pf處條帶，重新溶解于丙酮，經(jīng)離心、過濾和減壓濃縮，制備到4種組分，記為組分Al、組分A2、組分A3和組分A4 ;(4)取0.1 mL 4種組分的濃縮液，完全揮發(fā)后，加入I mol/L冰醋酸溶液I mL，充分振蕩，加入鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑(0.6 %鐵氰化鉀溶液和0.9 %三氯化鐵溶液，使用前按0.9:1.0混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配)，觀察顏色反應，發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)污綠色，為酚酸類物質的陽性反應；波長掃描顯示，此4種組分在260-330 nm范圍內(nèi)有特征吸收峰，為酚酸類物質的特征吸收峰。將此4種組分溶液點樣于硅膠GF254上，分別在氯仿/甲醇，環(huán)己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3種展開劑(展開劑體積比與實施例1同)下展開，發(fā)現(xiàn)此4種組分均呈現(xiàn)單一斑點；同時，采用通用型顯色劑(10%硫酸溶液和碘)以及專屬顯色劑(鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液)，發(fā)現(xiàn)在此3種顯色劑下，此4種組分同樣呈現(xiàn)單一斑點，表明純度達到了薄層純。40°C下減壓蒸干，制備到4種酚酸類物質，Al黃褐色粉末0.101 g，A2黃褐色結晶性粉末0.184 g，A3黃色粉末0.113 g和A4黃色結晶粉末0.129 g。
[0010]實施例3，一種海藻酚酸類物質的分離純化方法實驗:
稱取江蘺干粉末200 g，溶解于800 mL甲醇/丙酮/蒸餾水混合溶劑(體積比1:1:1)中，黑暗、室溫下浸泡提取3d。提取3次后，合并浸提液，經(jīng)離心、過濾和減壓蒸餾，獲得40mL濃縮浸提液；(2)用2mol/LHCl調(diào)濃縮浸提液pH至2.0,離心后，上清液用正已烷萃取3次后，棄去上層，保留下層溶液。用混合有機溶劑乙醚/乙酸乙酯(體積比0.8:1)萃取此溶液3次，收集上層。上層經(jīng)無水硫酸鈉除水后，40°C下減壓蒸干，制備到2.20 g酚酸粗提物；(3)酚酸粗提物重新溶解于甲醇，獲得待分離甲醇溶液5 mL。將此溶液點樣于硅膠GF254上，以氯仿/丙酮/甲酸(15:3:2)為展開劑展開。在紫外254 nm下，出現(xiàn)4個斑點，TPf分別為0.22、0.37、0.63和0.77。在此基礎上，以劃線法多次點樣，合并收集相同/Pf處條帶，重新溶解于丙酮，經(jīng)離心、過濾和減壓濃縮，制備到4種組分，記為組分Al、組分A2、組分A3和組分A4 ;(4)取0.1 mL 4種組分的濃縮液，完全揮發(fā)后，加入I mol/L冰醋酸溶液I mL，充分振蕩，加入鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑(0.6 %鐵氰化鉀溶液和0.9 %三氯化鐵溶液，使用前按0.9:1.0混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配)，觀察顏色反應，發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)污綠色，為酚酸類物質的陽性反應；波長掃描顯示，此4種組分在260-330 nm范圍內(nèi)有特征吸收峰，為酚酸類物質的特征吸收峰。將此4種組分溶液點樣于硅膠GF254上，分別在氯仿/甲醇，環(huán)己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3種展開劑(展開劑體積比與實施例1同)下展開，發(fā)現(xiàn)此4種組分均呈現(xiàn)單一斑點；同時，采用通用型顯色劑(10%硫酸溶液和碘)以及專屬顯色劑(鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液)，發(fā)現(xiàn)在此3種顯色劑下，此4種組分同樣呈現(xiàn)單一斑點，表明純度達到了薄層純。40°C下減壓蒸干，制備到4種酚酸類物質，Al黃褐色粉末0.218 g，A2黃褐色結晶性粉末0.372 g，A3黃色粉末0.206 g和A4黃色結晶粉末0.270 g。
[0011]實施例4，一種海藻酚酸類物質的分離純化方法實驗:
稱取江蘺干粉末500 g，溶解于2500 mL甲醇/丙酮/蒸餾水混合溶劑(體積比1:1:1)中，黑暗、室溫下浸泡提取4d。提取4次后，合并浸提液，經(jīng)離心、過濾和減壓蒸餾，獲得300mL濃縮浸提液；(2)用2mol/LHCl調(diào)濃縮浸提液pH至2.0,離心后，上清液用正已烷萃取4次后，棄去上層，保留下層溶液。用混合有機溶劑乙醚/乙酸乙酯(體積比0.8:1)萃取此溶液4次，收集上層。上層經(jīng)無水硫酸鈉除水后，40°C下減壓蒸干，制備到5.82 g酚酸粗提物；
(3)酚酸粗提物重新溶解于甲醇，獲得待分離甲醇溶液25 mL。將此溶液點樣于硅膠GF254上，以氯仿/丙酮/甲酸(15:3:2)為展開劑展開。在紫外254 nm下，出現(xiàn)4個斑點，TPf分別為0.22、0.37、0.63和0.77。在此基礎上，以劃線法多次點樣，合并收集相同/Pf處條帶，重新溶解于丙酮，經(jīng)離心、過濾和減壓濃縮，制備到4種組分，記為組分Al、組分A2、組分A3和組分A4 ;(4)取0.1 mL 4種組分的濃縮液，完全揮發(fā)后，加入I mol/L冰醋酸溶液I mL，充分振蕩，加入鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑(0.6 %鐵氰化鉀溶液和0.9 %三氯化鐵溶液，使用前按0.9:1.0混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配)，觀察顏色反應，發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)污綠色，為酚酸類物質的陽性反應；波長掃描顯示，此4種組分在260-330 nm范圍內(nèi)有特征吸收峰，為酚酸類物質的特征吸收峰。將此4種組分溶液點樣于硅膠GF254上，分別在氯仿/甲醇，環(huán)己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3種展開劑(展開劑體積比與實施例1同)下展開，發(fā)現(xiàn)此4種組分均呈現(xiàn)單一斑點；同時，采用通用型顯色劑(10%硫酸溶液和碘)以及專屬顯色劑(鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液)，發(fā)現(xiàn)在此3種顯色劑下，此4種組分同樣呈現(xiàn)單一斑點，表明純度達到了薄層純。40°C下減壓蒸干，制備到4種酚酸類物質，Al黃褐色粉末0.513 g，A2黃褐色結晶性粉末0.912 g，A3黃色粉末0.556 g和A4黃色結晶粉末0.625 g。
[0012]采用抑藻圈實驗進行抑藻活性檢測。在數(shù)個直徑為1.5 cm的圓形濾紙片上，分別滴加5 PL待測組分丙酮 濃縮液和丙酮(作為對照組)，待丙酮完全揮發(fā)后，將濾紙片放分別置于接種對數(shù)生長期的米氏凱倫藻、中肋骨條藻、塔瑪亞歷山大藻的固體培養(yǎng)基上，置于GXZ-260B智能型光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度(26±1) °C，光照強度62 Mmol m-2s—1，光暗比為12:12。2d后，觀察濾紙片及周圍受試微藻的生長，發(fā)現(xiàn)4種待測組分均對米氏凱倫藻、中肋骨條藻和塔瑪亞歷山大藻的生長表現(xiàn)出較為明顯的抑制作用。通過測定抑藻圈，此4種待測組分的抑藻圈均超過1.0 cm。
【權利要求】
1.一種海藻酚酸類物質的分離純化方法，其特征在于，其步驟如下: (1)取新鮮江蘺50°C下烘干后，粉碎至0.3 mm干粉末；采用體積比為1:1:1的甲醇/丙酮/蒸餾水混合溶劑對江蘺干粉末進行浸泡提取，經(jīng)離心、過濾和減壓蒸餾，獲得濃縮浸提液； (2)用2mol/L HCl調(diào)濃縮浸提液pH至2.0，離心后，上清液用正已烷萃取，棄去上層，保留下層溶液；用體積比為0.8:1的乙醚/乙酸乙酯混合有機溶劑萃取下層溶液，收集上層，上層經(jīng)無水硫酸鈉除水后，40 V下減壓蒸干，制備到酚酸粗提物； (3)將酚酸粗提物重新溶解于甲醇，獲得待分離甲醇溶液；將此溶液點樣于硅膠GF254上，以體積比為15:3:2的氯仿/丙酮/甲酸為展開劑展開；在紫外254 nm下，出現(xiàn)4個斑點，< 分別為0.22,0.37,0.63和0.77 ;在此基礎上，以劃線法多次點樣，合并收集相同/Pf處條帶，重新溶解于丙酮，經(jīng)離心和減壓濃縮，制備到4種組分，記為組分Al、組分A2、組分A3和組分A4 ； (4)取0.1 mL 4種組分的濃縮液，加入到質量溶度為1-5%的三氯化鐵溶液中，觀察顏色反應，發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)藍綠色，為酚酸類物質的陽性反應；將此4種組分溶液點樣于硅膠GF254上，分別在氯仿/甲醇，環(huán)己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水3種展開劑下展開，發(fā)現(xiàn)此4種組分均呈現(xiàn)單一斑點，其中組分A1、A2展開劑條件為體積比4:1的氯仿/甲醇、體積比1:2的環(huán)己烷/乙酸乙酯、體積比4:1:2的正丁醇/醋酸/水；組分A3、A4展開劑條件為體積比8:1的氯仿/甲 醇、體積比1:1的環(huán)己烷/乙酸乙酯、體積比4:1:1正丁醇/醋酸/水；同時，采用通用型顯色劑10%硫酸溶液和碘以及專屬顯色劑三氯化鐵溶液，發(fā)現(xiàn)在此3種顯色劑下，此4種組分同樣呈現(xiàn)單一斑點，表明純度達到了薄層純；減壓蒸干，制備到4種酚酸類物質。
2.權利要求1所述方法制得的酚酸類物質在抑制米氏凱倫藻、中肋骨條藻和塔瑪亞歷山大藻生長中的用途。
【文檔編號】A01P13/00GK103704275SQ201310663557
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權日:2013年12月10日
【發(fā)明者】孫穎穎, 閻斌倫, 沈橋, 黃曉斌 申請人:淮海工學院