一種昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)復(fù)壯的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)復(fù)壯的方法，步驟如下：（1）應(yīng)用大蠟螟活體擴(kuò)繁昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)，并收集其侵染期幼蟲(chóng)，得到線蟲(chóng)懸浮液；（2）確定一塊有昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)寄主昆蟲(chóng)分布，但無(wú)昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)分布的地塊，將擴(kuò)繁收集得到的線蟲(chóng)懸浮液噴施到田間；（3）在上述地塊采集土樣，利用大蠟螟誘集線蟲(chóng)，獲得復(fù)壯后的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)。本發(fā)明可以有效的將昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)復(fù)壯，使其致病力恢復(fù)到自然系統(tǒng)中的真實(shí)狀態(tài)：復(fù)壯后的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)對(duì)大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為100%，與當(dāng)初剛剛誘集分離得到時(shí)對(duì)大蠟螟的致病力一致；而未復(fù)壯的線蟲(chóng)對(duì)大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為80.0%。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)復(fù)壯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)復(fù)壯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)是指體內(nèi)攜帶有具有病原性的共生細(xì)菌，因而能引起昆蟲(chóng)致病的一類(lèi)線蟲(chóng)。作為控制害蟲(chóng)的手段，昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)較化學(xué)防治有明顯的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)的研究表明:昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)無(wú)污染，對(duì)環(huán)境和人類(lèi)安全，可以大量使用，而且它們既可以主動(dòng)發(fā)現(xiàn)寄主，也可以被動(dòng)接觸寄主，已被證實(shí)，對(duì)靶標(biāo)昆蟲(chóng)進(jìn)行控制時(shí)，昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的防效要優(yōu)于化學(xué)農(nóng)藥。昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的另一優(yōu)點(diǎn)是可以在寄主體內(nèi)大量繁殖，因此，新繁殖的侵染線蟲(chóng)可以侵染更多的寄主昆蟲(chóng)。因此，昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)將成為生物防治中的主要手段，可以預(yù)計(jì)昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)在未來(lái)的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)生物生態(tài)控制系統(tǒng)中將會(huì)發(fā)揮重要的作用。
[0003]昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)推廣應(yīng)用的前提是篩選出致病力較高的種類(lèi)或品系，所以昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)對(duì)靶標(biāo)昆蟲(chóng)的致病力測(cè)定是開(kāi)展昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)應(yīng)用研究的基礎(chǔ)。昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)致病力的高低主要是通過(guò)其侵染期線蟲(chóng)對(duì)靶標(biāo)昆蟲(chóng)的防治效果來(lái)反映，供試線蟲(chóng)一般情況下都是經(jīng)過(guò)利用大蠟螟活體擴(kuò)繁復(fù)壯的侵染期幼蟲(chóng)，但是由于室內(nèi)擴(kuò)繁代數(shù)和保存時(shí)間的遞增，侵染期線蟲(chóng)的致病力會(huì)下降，不能很好的應(yīng)用其開(kāi)展昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)應(yīng)用研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)復(fù)壯的方法，應(yīng)用本發(fā)明的方法可以 有效的將昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)復(fù)壯，使其致病力恢復(fù)到自然系統(tǒng)中的真實(shí)狀態(tài)，為致病力測(cè)定的準(zhǔn)確性提供了保障。
[0005]本發(fā)明提供一種昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)復(fù)壯的方法，步驟如下:
1)應(yīng)用大蠟螟活體擴(kuò)繁昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)，并收集其侵染期幼蟲(chóng)，得到線蟲(chóng)懸浮液；
2)確定一塊有昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)寄主昆蟲(chóng)分布，但無(wú)昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)分布的地塊，將擴(kuò)繁收集得到的線蟲(chóng)懸浮液噴施到田間；
3)在上述地塊采集土樣，利用大蠟螟誘集線蟲(chóng)，獲得復(fù)壯后的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)。
[0006]優(yōu)選地，步驟(2)中，所述線蟲(chóng)懸浮液以10000-15000頭/m2的濃度噴施。
[0007]此濃度范圍便于線蟲(chóng)寄生寄主昆蟲(chóng)，并易于收集。
[0008]更優(yōu)選地，步驟(2)中，所述線蟲(chóng)懸浮液以10000頭/m2的濃度噴施。
[0009]優(yōu)選地，步驟(3)中，經(jīng)過(guò)三個(gè)月后，在上述地塊采集土樣。
[0010]優(yōu)選地，所述采集土樣采取多點(diǎn)采樣法。
[0011]優(yōu)選地，步驟(3)中，所述利用大蠟螟誘集線蟲(chóng)是將大蠟螟老熟幼蟲(chóng)放入瓶中，加入采集的土樣,使大蠟螟充分接觸昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng),將表現(xiàn)為受線蟲(chóng)侵染癥狀的死亡大蠟螟老熟幼蟲(chóng)單頭放入線蟲(chóng)收集盤(pán)上收集昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)。
[0012]優(yōu)選地，所述使大蠟螟充分接觸昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的方法是每天翻動(dòng)瓶，使大蠟螟在土中上下爬動(dòng)。[0013]優(yōu)選地，所述線蟲(chóng)收集盤(pán)里為質(zhì)量百分濃度為0.1%的甲醛溶液。
[0014]昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)復(fù)壯是其致病力研究的前提和關(guān)鍵步驟，有效的復(fù)壯是其致病力測(cè)定準(zhǔn)確性的保障，本發(fā)明可以有效的將昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)復(fù)壯，使其致病力恢復(fù)到自然系統(tǒng)中的真實(shí)狀態(tài):復(fù)壯后的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)對(duì)大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為100%，與當(dāng)初剛剛誘集分離得到時(shí)對(duì)大蠟螟的致病力一致；而未復(fù)壯的線蟲(chóng)對(duì)大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為80.0%。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0016]實(shí)施例1
本發(fā)明的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)復(fù)壯的方法步驟如下:
1.1試驗(yàn)材料
供試線蟲(chóng):甘肅省土著昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)種:Steinernema feltiae。
[0017]試驗(yàn)所需器材:人工氣候箱、顯微鏡、解剖鏡、冷光源解剖鏡、智能冰箱、恒溫箱、微量移液槍、直徑60_培養(yǎng)皿、直徑90_培養(yǎng)皿、黑光燈、濾紙、小噴壺等。[0018]1.2試驗(yàn)方法
1.應(yīng)用大臘螟活體擴(kuò)繁Steinernema feltiae線蟲(chóng),并收集其侵染期幼蟲(chóng)；具體方法如下:在24孔板中，每孔裝2克細(xì)沙,然后每孔將200ii I Steinernema feltiae線蟲(chóng)液(含約200頭抗逆性幼蟲(chóng))滴入孔中，每孔放入一頭末齡大蠟螟幼蟲(chóng)，用封口膜密封24孔板，在25°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)，然后將因昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)侵染死亡的大蠟螟幼蟲(chóng)取出，放到鋪有一層干燥濾紙的培養(yǎng)皿中，在25°C條件下再培養(yǎng)72小時(shí)，然后將尸體放到線蟲(chóng)收集盤(pán)中，待線蟲(chóng)游出，每隔24小時(shí)收集一次線蟲(chóng)，將收集的線蟲(chóng)用無(wú)菌水沖洗三遍后，得到線蟲(chóng)懸浮液，置于5~8°C冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0019]2.確定一塊有Steinernema feltiae線蟲(chóng)寄主昆蟲(chóng)(如常見(jiàn)地下害蟲(chóng)類(lèi):擠贈(zèng))分布，但無(wú)Steinernema feltiae線蟲(chóng)分布的地塊，并將擴(kuò)繁收集得到的線蟲(chóng)懸浮液以10000頭/m2的濃度噴施到田間；此濃度便于線蟲(chóng)寄生寄主昆蟲(chóng)，并易于收集。
[0020]3.經(jīng)過(guò)三個(gè)月(線蟲(chóng)可在自然環(huán)境中擴(kuò)繁多代)后再在此地塊采集土樣并誘集Steinernema feltiae線蟲(chóng)；具體方法如下:
①采集土樣:采取5點(diǎn)采樣法。即在某一地點(diǎn)，除去表層土，在10~20cm的土深處取土，樣品量至少200cm3,以便采取到足夠量的Steinernema feltiae線蟲(chóng)。在每個(gè)地面2~4m2的范圍內(nèi)取5個(gè)點(diǎn)，將5點(diǎn)采的樣混合，裝入雙層塑料袋中。
[0021]②大臘螟誘集法誘集Steinernema feltiae線蟲(chóng):將室內(nèi)人工飼料飼養(yǎng)的10頭大蠟螟老熟幼蟲(chóng)放入塑料瓶?jī)?nèi)，然后分別裝入500g采集的土樣，在25°C的恒溫箱內(nèi)保持5~7天，期間每天翻倒塑料瓶，使大蠟螟在土中上下爬動(dòng)，以充分接觸線蟲(chóng)。放置2天后每天檢查大蠟螟幼蟲(chóng)的死亡情況。將表現(xiàn)受線蟲(chóng)侵染癥狀的死亡幼蟲(chóng)單頭放入線蟲(chóng)收集盤(pán)(培養(yǎng)皿)上收集Steinernema feltiae線蟲(chóng)(培養(yǎng)皿里加入少量質(zhì)量百分濃度為0.1%的甲醒溶液，溶劑為無(wú)菌水，起保濕和消毒的作用)。7~10天后線蟲(chóng)開(kāi)始從大蠟螟尸體內(nèi)爬出，爬到大培養(yǎng)皿的無(wú)菌水甲醛溶液中，就可獲得侵染期線蟲(chóng)的水懸液。每天將線蟲(chóng)水懸液換入新的容器中，貼上品系名稱(chēng)和日期標(biāo)簽，放在5~8°C冰箱中保存?zhèn)溆?，再在大培養(yǎng)皿中重新加入適量的無(wú)菌水甲醛溶液。
[0022]4.將收集得到的線蟲(chóng)懸浮液進(jìn)行形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定，分離鑒定得到的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)為 Steinernema feltiae。
[0023]5.保存于4°C的冰箱中，備用。
[0024]應(yīng)用本發(fā)明的方法得到的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)具有很好的致病力，具體試驗(yàn)過(guò)程如下: 試驗(yàn)在溫度為25°C，相對(duì)濕度為80%條件下的恒溫箱內(nèi)進(jìn)行。在直徑為60mm的培養(yǎng)
皿中墊一層濾紙，加入適量的水，使濾紙保持濕潤(rùn)。每個(gè)培養(yǎng)皿中加入50條應(yīng)用本發(fā)明的方法獲得的線蟲(chóng)，同時(shí)每培養(yǎng)皿放入大蠟螟老熟幼蟲(chóng)一頭。每處理10頭供試幼蟲(chóng)，3次重復(fù)。并將未復(fù)壯的線蟲(chóng)作為對(duì)照試驗(yàn)。每隔8小時(shí)檢查大蠟螟幼蟲(chóng)的死亡情況并作記錄，比較復(fù)壯前后Steinernema feltiae線蟲(chóng)對(duì)大臘螟的致病力，結(jié)果為:復(fù)壯后的Steinernemafeltiae線蟲(chóng)對(duì)大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為100%，與當(dāng)初剛剛誘集分離得到時(shí)對(duì)大蠟螟的致病力一致；而未復(fù)壯的線蟲(chóng)對(duì)大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為80.0%。
[0025]實(shí)施例2
本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于:步驟2中，將擴(kuò)繁收集得到的線蟲(chóng)懸浮液以12000頭/m2的濃度噴施到田間；其余步驟均與實(shí)施例1中相同。
[0026]實(shí)施例3
本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于:步驟2中，將擴(kuò)繁收集得到的線蟲(chóng)懸浮液以15000頭/m2的濃度噴施到田間`；其余步驟均與實(shí)施例1中相同。
[0027]最后應(yīng)說(shuō)明的是:以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)復(fù)壯的方法，其特征在于:步驟如下: (1)應(yīng)用大蠟螟活體擴(kuò)繁昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)，并收集其侵染期幼蟲(chóng)，得到線蟲(chóng)懸浮液； (2)確定一塊有昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)寄主昆蟲(chóng)分布，但無(wú)昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)分布的地塊，將擴(kuò)繁收集得到的線蟲(chóng)懸浮液噴施到田間； (3)在上述地塊采集土樣，利用大蠟螟誘集線蟲(chóng)，獲得復(fù)壯后的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述線蟲(chóng)懸浮液以10000-15000頭/m2的濃度噴施。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述線蟲(chóng)懸浮液以10000頭/m2的濃度噴施。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，經(jīng)過(guò)三個(gè)月后，在上述地塊采集土樣。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述采集土樣采取多點(diǎn)采樣法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述利用大蠟螟誘集線蟲(chóng)是將大蠟螟老熟幼蟲(chóng)放入瓶中，加入采集的土樣，使大蠟螟充分接觸昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)，將表現(xiàn)為受線蟲(chóng)侵染癥狀的死亡大蠟螟老熟幼蟲(chóng)單頭放入線蟲(chóng)收集盤(pán)上收集昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述使大蠟螟充分接觸昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的方法是每天翻動(dòng)瓶，使大蠟螟在土中上下爬動(dòng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述 的 方法，其特征在于:所述線蟲(chóng)收集盤(pán)里為質(zhì)量百分濃度為0.1%的甲醛溶液。
【文檔編號(hào)】A01M1/10GK103688907SQ201310663719
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】錢(qián)秀娟, 劉長(zhǎng)仲, 孫小玲 申請(qǐng)人:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)