一種復合微生物肥料的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種復合微生物肥料的制備方法，步驟如下：將桔黃假單胞菌JD37菌或熒光假單胞菌P13接種入液體培養(yǎng)基中，28℃下200r/min振蕩培養(yǎng)16～20小時；離心后取菌體，與滅菌的保護劑溶液懸浮，混合均勻，得到懸浮菌液；將懸浮菌液與滅菌的基質(zhì)混合，基質(zhì)與懸浮菌液的質(zhì)量體積比為1～2g/ml；將混合過菌懸液的基質(zhì)與滅菌的市售蚯蚓糞按質(zhì)量比1:1混合。本發(fā)明組合了兩株植物根際促生細菌，既能促進農(nóng)作物的生長，又能防治一些植物病原菌；提供了一種適合本發(fā)明的復合保護劑，效果比單一保護劑的效果更加顯著；選用了一種成本低廉、易獲取的基質(zhì)，不僅不會對環(huán)境造成污染和危害，而且能提高土壤品質(zhì)。
【專利說明】一種復合微生物肥料的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種復合微生物肥料的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]為了追求高產(chǎn)量，傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)采用化肥作為農(nóng)作物的肥力來源，而在長期使用化肥的過程中所呈現(xiàn)的問題也變得越來越突出。主要有三個方面:第一，制造化肥的礦物原料及化工原料中，含有多種重金屬放射性物質(zhì)和其它有害成分，它們隨施肥進入農(nóng)田土壤造成重金屬污染。第二，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量施用化肥，使氮、磷等營養(yǎng)元素大量進入水體，引起水體富營養(yǎng)化，造成化肥對地表水的非點源污染。據(jù)估計，沉入河、湖的氮素約有60%來自化肥。第三，長期使用化肥會起土壤酸化和板結(jié)，導致土壤肥力下降。據(jù)調(diào)查，由于長年施用化肥，華北平原土壤有機質(zhì)已降到1%左右，全氮含量不到0.1%，在東北三江平原，多年重用輕養(yǎng)，使土壤有機質(zhì)的含量從10%~11.5%下降到3%~5%。通過以上數(shù)據(jù)，說明長期使用化肥已經(jīng)對我國的農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境質(zhì)量造成了巨大的負面影響。
[0003]植物根際促生菌是一類生活在植物根際并能促進植物生長的有益微生物，這類細菌能合成某種化合物供植物利用，包括分泌有機酸把土壤中難溶解的無效態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，使其能夠被植物吸收和利用；自生固氮；分泌植物激素；通過分泌鐵載體供給植物生長過程中所需的鐵營養(yǎng)；通過合成ACC脫氨酶能夠調(diào)控植物乙烯水平。同時，植物根際促生菌也具有生物防治的功能，能夠通過抑制或減輕某些植物病蟲害對植株生長發(fā)育造成的不良影響，如產(chǎn)生抗生素抑制植物病原菌的生長繁殖，與病原微生物競爭根際生態(tài)位；誘導植株產(chǎn)生抗性等方式抑制植物病害。由此可見，植物根際促生菌不僅能促進農(nóng)作物的生長，還能有效地控制農(nóng)作物病害。
[0004]微生物的生長需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)，而蚯`蚓糞富含有機質(zhì)，并且具有很好的孔性、通氣性、排水性和高的持水量，蚯蚓糞有很大的表面積，使得許多有益微生物得以生存并具有良好的吸收和保持營養(yǎng)物質(zhì)的能力，同時經(jīng)過蚯蚓消化，有益于蚯蚓糞中水穩(wěn)性團聚體的形成，經(jīng)過微生物發(fā)酵處理的蚯蚓糞有機肥具有合理的團粒結(jié)構(gòu)以及孔隙度，通氣性好，保水力強，能夠提高作物抗旱性能，改善根際土壤的通氣性，保水透氣能力比一般土壤提高3倍，施過蚯蚓糞的農(nóng)田土質(zhì)松軟，比施用其它肥料根系發(fā)達。所以，發(fā)明一種植物根際促生細菌與蚯蚓糞相結(jié)合的復合微生物肥料對于保護土壤環(huán)境、促進農(nóng)作物生長和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展有著重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于利用桔黃假單胞菌JD37 (CGMCC N0.7099)、熒光假單胞菌P13(CCTCC AB209102)，提供一種復合微生物肥料的制備方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0007]一種復合微生物肥料的制備方法，具體實施步驟如下:
[0008](1)將桔黃假單胞菌JD37菌或熒光假單胞菌P13接種入液體培養(yǎng)基中，放置搖床中28°C下200r/min振蕩培養(yǎng)16~20小時；離心后取菌體，與滅菌的0.01wt%~10.00wt%保護劑溶液懸浮，混合均勻，得到懸浮菌液；
[0009]液體培養(yǎng)基為KB培養(yǎng)基；
[0010]離心條件為0~10°C，優(yōu)選4°C，8000~lOOOOrpm離心15~20分鐘；
[0011]保護劑優(yōu)選配方和濃度為0.lwt%的海藻酸鈉、1(^丨％的甘油和0.lwt%的羧甲基纖維素鈉；
[0012]菌體的液體培養(yǎng)基與助劑溶液體積比為10~20:1，即:平均每10~20毫升菌液離心后得到的桔黃假單胞菌JD37菌體，與1毫升保護劑溶液混合制備懸浮菌液。
[0013](2)將懸浮菌液與滅菌的基質(zhì)混合，基質(zhì)與懸浮菌液的體積質(zhì)量比為1~2g/ml，優(yōu)選為lg/ml?；|(zhì)可選用草炭土(市售)。
[0014]基質(zhì)使用碳酸韓調(diào)整pH值至6.0~8.0,使用研磨機將基質(zhì)研磨成粉末后振蕩過直徑為0.3mm標準篩。
[0015]基質(zhì)滅菌條件為121 °C , 20~30min,兩次。
[0016]混合方法為:將菌懸液與基質(zhì)攪拌后，自然風干。
[0017](3)將混合過菌懸液的草炭土粉末與滅過菌的蚯蚓糞(市售)混合，混合比為1:1(M:M)。
[0018]使用研磨機將蚯蚓糞研磨成粉末后振蕩過直徑為2.0mm標準篩。
[0019]蚯蚓糞滅菌條件為121°C，20~30min，兩次。
[0020]通過上述方法制備的復合微生物肥料可用于實際生產(chǎn)，活菌數(shù)含量高，保存期限長，菌體釋放能力強，營養(yǎng)物質(zhì)充分，既可促進農(nóng)作物生長，又能防治植物病原菌。
[0021]本發(fā)明有以下特點:
[0022](1)組合了兩株植物根際促生細菌:
[0023]研究資料表明，桔黃假單胞菌JD37能夠分泌植物生長激素IAA，能被誘導產(chǎn)生ACC脫氨酶，具有溶磷活性；對植物有較好的促生作用；而熒光假單胞菌是報道較多的一類生防菌株。本發(fā)明中使用到的熒光假單胞菌P13對油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、番爺灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)和玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)均有明顯的拮抗作用。將這兩株菌種聯(lián)合使用既能促進農(nóng)作物的生長，又能防治一些植物病原菌。
[0024](2)研制了一種適合本發(fā)明的復合保護劑:
[0025]保護劑對菌劑的保存期限影響很大，它不僅影響菌劑中菌體的存活率，也影響保藏期間菌體的穩(wěn)定性，同時保護劑可以改變菌體的物理化學環(huán)境，減輕或防止干燥對菌體的損害，盡可能保持菌體原有的各種生理生化特性和生物活性。研究資料表明，復合保護劑的保護效果往往比單一保護劑的效果更加顯著；根據(jù)之前的研究結(jié)果表明，甘油，海藻酸鈉，羧甲基纖維素鈉對菌體均有一定的保護作用，在此基礎(chǔ)上研制出了一款復合保護劑。
[0026](3)選用了一種成本低廉、易獲取的基質(zhì):
[0027]草炭土是一種經(jīng)過幾千年所形成的天然沼澤地產(chǎn)物，具有無毒、無污染，通氣性能好，質(zhì)輕、持水、保肥的特性，并且有利于微生物活動，增強生物性能，營養(yǎng)豐富，并含有很高的有機質(zhì)，腐殖酸及營養(yǎng)成份。使用該材料作為基質(zhì)，應用于大田中不僅不會對環(huán)境造成污染和危害，而且能提高土壤品質(zhì)。
【具體實施方式】
[0028]實施例1
[0029](1)將研磨過的草炭土粉末按9:1 (M:M)加入碳酸鈣后進行高壓(1.034X 105Pa)滅菌兩次(12rC，30min)，烘干備用；
[0030](2)將研磨過的蚯蚓糞進行高壓(1.034父10^)滅菌兩次(1211:，301^11)，烘干備用；
[0031](3)制備液體培養(yǎng)基:蛋白胨 20g、甘油 10mL、Κ2ΗΡ041.5g、MgS04.7Η201.5g、去離子水1L,混合后121°C滅菌20min ；
[0032](4)配制保護劑溶液:0.5wt%的海藻酸鈉、15wt%的甘油和0.lwt%的羧甲基纖維素鈉；去離子水1L, 121°C滅菌20min后常溫保存；
[0033](5)挑取桔黃假單胞菌JD37單菌落至50mL液體KB培養(yǎng)基中，28°C、200rpm培養(yǎng)18h后，按1%接種量取10mL發(fā)酵液于lOOOmL新鮮液體KB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期(28°C , 200rpm, 18h),在無菌條件下，將發(fā)酵液在lOOOOrpm下離心20min,去除上清液，用lOOmL保護劑溶液輕輕吹打使之充分懸?。?br> [0034](6)將lOOmL菌懸液與100g滅菌過的草炭土粉末混勻后吹干；然后與滅過菌的100g蚯蚓糞混勻，裝入塑封袋中保存。
[0035]實施例2
[0036](1)將研磨過的草炭土粉末按9:1 (M:M)加入碳酸鈣后進行高壓(1.034X 105Pa)滅菌兩次(12rC，30min)，烘干備用；
[0037](2)將研磨過的蚯蚓糞進行高壓(1.034父10^)滅菌兩次(1211:，301^11)，烘干備用；
[0038](3)制備液體培養(yǎng)基:蛋白胨 20g、甘油 10mL、Κ2ΗΡ041.5g、MgS04.7Η201.5g、去離子水1L,混合后121°C滅菌20min ；
[0039](4)配制保護劑溶液:0.5wt%的海藻酸鈉、15wt%的甘油和0.lwt%的羧甲基纖維素鈉；去離子水1L, 121°C滅菌20min后常溫保存；
[0040](5)挑取熒光假單胞菌P13單菌落至50mL液體KB培養(yǎng)基中，28°C、200rpm培養(yǎng)20h后，按1%接種量取10mL發(fā)酵液于1000mL新鮮液體KB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期(28°C，200rpm, 20h),在無菌條件下，將發(fā)酵液在lOOOOrpm下離心20min,去除上清液,用lOOmL保護劑溶液輕輕吹打使之充分懸?。?br> [0041](6)將lOOmL菌懸液與100g滅菌過的草炭土粉末混勻后吹干；然后與滅過菌的100g蚯蚓糞混勻，裝入塑封袋中保存。
[0042]實施例3
[0043](1)將研磨過的草炭土粉末按9:1 (M:M)加入碳酸鈣后進行高壓(1.034X 105Pa)滅菌兩次(12rC，30min)，烘干備用；
[0044](2)將研磨過的·蚯蚓糞進行高壓(1.034父10^)滅菌兩次(1211:，301^11)，烘干備用；
[0045](3)制備液體培養(yǎng)基:蛋白胨 20g、甘油 10mL、Κ2ΗΡ041.5g、MgS04.7Η201.5g、去離子水1L,混合后121°C滅菌20min ；
[0046](4)配制保護劑溶液:0.5wt%的海藻酸鈉、15wt%的甘油和0.lwt%的羧甲基纖維素鈉；去離子水1L, 121°C滅菌20min后常溫保存；
[0047](5)挑取桔黃假單胞菌JD37單菌落至50mL液體KB培養(yǎng)基中，28°C、200rpm培養(yǎng)18h，挑取熒光假單胞菌P13單菌落至50mL液體KB培養(yǎng)基中，28°C、200rpm培養(yǎng)20h后分別按1%接種量取10mL發(fā)酵液于lOOOmL新鮮液體KB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期(28°C，200rpm),在無菌條件下，將發(fā)酵液在lOOOOrpm下離心20min,去除上清液,分別用100mL保護劑溶液輕輕吹打使之充分懸??；
[0048](6)將200mL菌懸液與200g滅菌過的草炭土粉末混勻后吹干；然后與滅過菌的200g蚯蚓糞混勻，裝入塑封袋中保存。
[0049]實施例4
[0050]實施例1、2、3的有效活菌數(shù)檢測
[0051](1)分別稱取以上三種肥料10g，加入帶有玻璃珠的90mL的無菌水中，靜置20min后在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分旋轉(zhuǎn)振蕩30min ；
[0052](2)用移液器吸取0.5mL上述菌懸液加入4.5mL無菌水中，混勻成1:10稀釋的菌懸液，這樣依次稀釋5次；
[0053](3)用移液器分別吸取不同稀釋度菌懸液0.lmL，加至直徑為9cm平皿的瓊脂培養(yǎng)基表面，用無菌玻璃刮刀將菌懸液均勻地徐于瓊脂表面；每個樣品取2個連續(xù)適宜稀釋度，每一稀釋度重復4次，28°C條件下培養(yǎng)2天后計數(shù)；
[0054]結(jié)果如下:
[0055]表1采用不同制備方法制作的肥料有效活菌數(shù)檢測結(jié)果
[0056]
【權(quán)利要求】
1.一種復合微生物肥料的制備方法，其特征在于，具體實施步驟如下:(1)將桔黃假單胞菌JD37菌或熒光假單胞菌P13接種入液體培養(yǎng)基中，28°C下200r/min振蕩培養(yǎng)16~20小時；離心后取菌體，與滅菌的0.01wt%~10.00wt%保護劑溶液懸浮，混合均勻，得到懸浮菌液；(2)將懸浮菌液與滅菌的基質(zhì)混合，基質(zhì)與懸浮菌液的質(zhì)量體積比為1~2g/ml；(3)將混合過菌懸液的基質(zhì)與滅菌的市售蚯蚓糞按質(zhì)量比1:1混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(1)中液體培養(yǎng)基為KB培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(1)中離心條件為0~10°C，8000~lOOOOrpm離心15~20分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(1)中保護劑為0.lwt%的海藻酸鈉、10wt%的甘油或0.lwt%的羧甲基纖維素鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(1)中菌體的液體培養(yǎng)基與保護劑溶液體 積比為10~20:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(2)中基質(zhì)為市售草炭土。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的復合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(2)中基質(zhì)與懸浮菌液的質(zhì)量體積比為lg/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(2)中基質(zhì)使用碳酸鈣調(diào)整pH值至6.0~8.0，將基質(zhì)研磨成粉末后振蕩過直徑為0.3mm標準篩。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(2)中混合方法為:將菌懸液與基質(zhì)攪拌后，自然風干。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(3)中市售蚯蚓糞研磨成粉末后振蕩過直徑為2.0mm標準篩。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(2)和(3)中基質(zhì)和蚯蚓糞滅菌條件為121°C，20~30min，兩次。
【文檔編號】C05F15/00GK103664254SQ201310671396
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】肖明, 周晨昊, 蔣秋悅, 陳兵 申請人:上海師范大學