一種篩選轉(zhuǎn)基因植物種子的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種篩選轉(zhuǎn)基因種子的方法，該方法包括：（1）、對(duì)需要篩選的種子進(jìn)行消毒處理；（2）、提供無菌培養(yǎng)皿，在無菌培養(yǎng)皿中放置一張或多張無菌濾紙，使抗生素溶液濕潤每一張濾紙；（3）將經(jīng)過步驟1消毒的種子播種在步驟2的培養(yǎng)皿中的濾紙表面上；其中，所述的種子為T0代煙草或擬南芥轉(zhuǎn)基因種子。通過該方法，可以提高后期苗的成活率，大大降低篩選成本和提交生產(chǎn)效率,特別的,在配置抗生素的時(shí)候,采用未滅菌的蒸餾水替代滅菌的水作為溶劑。
【專利說明】一種篩選轉(zhuǎn)基因植物種子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，特別的，屬于一種植物轉(zhuǎn)基因種子篩選技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生物技術(shù)研究及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。如何快速、便捷、高通量的篩選與種植轉(zhuǎn)基因植物是其中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。
[0003]傳統(tǒng)的方法是將L代種子播種于含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中，生長一定時(shí)間后出現(xiàn)表型分離，一般，帶有目標(biāo)基因的陽性植株呈正常綠色，陰性植株則出現(xiàn)黃化。繼續(xù)生長至適宜苗齡時(shí)，從瓶中移出陽性植株栽種。該法雖被廣泛使用，但存在如下缺點(diǎn):首先，要制備大量的培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基需要經(jīng)過濕熱滅菌后，再加抗生素，最后倒制平板，然后再把種子播種在還有抗生素的培養(yǎng)基上，同時(shí)，種子也必須經(jīng)過嚴(yán)格的消毒。這樣做不僅增加了試劑成本，且對(duì)無菌操作技術(shù)也提出了較高要求，整個(gè)過程都需要在無菌換進(jìn)下進(jìn)行操作，而且篩選的時(shí)間長。整個(gè)過程繁瑣，耗時(shí)長；其次，將組培苗移至營養(yǎng)土中時(shí)，由于根系扎入培養(yǎng)基，在去除殘留培養(yǎng)基時(shí)易損傷根系，及其顯著降低組培苗成活率；第三，在培養(yǎng)基中生長的小苗如果移栽太早，苗小，長勢(shì)弱，成活率非常低，需苗在組培瓶中生長至較大時(shí)再進(jìn)行移栽，這樣做雖增加了移栽的成活率，卻延誤了時(shí)間；第四，種子消毒必須徹底，與清水相t匕，在培養(yǎng)基的長時(shí)間培養(yǎng)更易導(dǎo)致污染。有鑒于此，需要開發(fā)快速、高效與簡(jiǎn)潔的播種及篩選轉(zhuǎn)基因種子技 術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服傳統(tǒng)方法的缺陷，本發(fā)明提供一種新型的轉(zhuǎn)基因種子播種及篩選技術(shù)，它有效地解決了傳統(tǒng)方法存在的上述弊端。
[0005]一方面，該本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因植物種子的篩選方法，該方法包括:對(duì)需要篩選的種子進(jìn)行消毒處理；2、提供無菌培養(yǎng)皿，在無菌培養(yǎng)皿中放置一張或多張無菌濾紙，使抗生素溶液濕潤每一張濾紙；3、將經(jīng)過步驟1消毒的種子播種在步驟2的培養(yǎng)皿中的濾紙表面上；其中，所述的種子為T0代煙草或擬南芥轉(zhuǎn)基因種子。
[0006]在一些優(yōu)選的方式中，當(dāng)種子為T0代煙草種子的時(shí)候，其中該轉(zhuǎn)基因種子中部分種子含有抗潮霉素的基因，濕潤所述濾紙的抗生素為40 mg/L的潮霉素溶液，讓每克濾紙吸收7毫升的潮霉素溶液。
[0007]在一些優(yōu)選的方式中，，當(dāng)種子為T0代擬南芥種子的時(shí)候，其中該轉(zhuǎn)基因種子中部分種子含有抗卡納霉素的基因，濕潤所述濾紙的抗生素為100 mg/L的卡納霉素溶液，讓每克濾紙吸收14毫升的卡納霉素溶液。
[0008]在一些優(yōu)選的方式中，消毒處理的步驟如下:先將適量待播的轉(zhuǎn)基因種子倒入1.5mL無菌離心管中，加入75%乙醇處理30 s;棄去75%乙醇，加入20%次氯酸鈉處理20 s ;棄去20%次氯酸鈉，用無菌蒸餾水洗滌種子3-4次。
[0009]在另一些優(yōu)選的方式中，先對(duì)種子進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，待種子萌發(fā)至剛露出胚根，且胚根的長度為1-3毫米時(shí)，進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照培養(yǎng)的條件為:溫度24 土 1°C、光照強(qiáng)度2000 Lux，光周期為16 h，直至轉(zhuǎn)基因幼苗長出兩片綠色子葉且陰性對(duì)照出現(xiàn)黃化后，將葉片呈綠色的幼苗播于營養(yǎng)土中。優(yōu)選的，培根的長度小于2毫米的時(shí)候進(jìn)行光照培養(yǎng)。優(yōu)選的，用封口膜密封無菌培養(yǎng)皿，并讓密封的培養(yǎng)皿處于黑暗環(huán)境，溫度24 土1°C，濕度為60%-75%下暗培養(yǎng)2-3天進(jìn)行發(fā)芽。
[0010]在一些優(yōu)選的方式中，種子是轉(zhuǎn)基因煙草?；代種子。這里所所的?；代種子是目標(biāo)基因被插入到組織或細(xì)胞基因組中獲得的當(dāng)代種子，例如，當(dāng)通過組織培養(yǎng)的方法，對(duì)某個(gè)植物的愈傷組織進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把某個(gè)目的外源基因插入到該植物的組織細(xì)胞中的基因序列中的某一個(gè)位置，然后通過培養(yǎng)獲得小苗，該小苗上的種子為I代。在?；的種子中，有些可能還有目的基因，有的可能不含有目的基因。另外，在進(jìn)行目的基因轉(zhuǎn)化中，可以把一些抗抗生素的基因與目的基因連接，如果轉(zhuǎn)化的種子中含有抗生素基因，就表示目的基因也被包含在該轉(zhuǎn)基因植物的種子中，當(dāng)然，單獨(dú)的抗潮霉素或卡納霉素的基因也可以被轉(zhuǎn)入到植物中。常用的抗生素為抗潮霉素或卡納霉素的基因，這些基因的序列為現(xiàn)有公知的技術(shù)，轉(zhuǎn)基因植物的獲得方法也是本領(lǐng)域的公知技術(shù)。
[0011]在一些優(yōu)選的方式中，消毒處理的步驟如下:先將適量待播的轉(zhuǎn)基因種子倒入1.5mL無菌離心管中，加入75%乙醇處理30 s;棄去75%乙醇，加入20%次氯酸鈉處理20 s ;棄去20%次氯酸鈉，用無菌蒸餾水洗滌種子3-4次。
[0012]在一些優(yōu)選的方式中，濕潤濾紙的抗生素為40 mg/L,讓每克濾紙吸收大約7毫升的抗生素溶液，也可以是讓每克濾紙吸收大約6-9毫升的抗生素溶液。處理濾紙的抗生素溶液的量特別關(guān)鍵，我們發(fā)現(xiàn)，如果是煙草種子，且抗生素的濃度為40 mg/L的情況下，每克濾紙?zhí)幚砜股氐牧刻幱?毫升左右時(shí)篩選效果最好，有85-98%的正確率。相反，不在此篩選濃度左右下，篩選效果差，幾乎不能滿足篩選目的。含量太低，假陽性的種子特別多，絕大多數(shù)種子均發(fā)芽并正常生長，也不能滿足要求；含量太高，幾乎所有的種子(90%-95%)都不能萌發(fā)或正常的后期生長。
[0013]在優(yōu)選的方式中，抗生素為潮霉素或卡納霉素。在一些優(yōu)選的方式中，種子為煙草或擬南芥T0代轉(zhuǎn)基因種子。當(dāng)轉(zhuǎn)基因種子為T0代擬南芥種子的時(shí)候，且種子中含有抗卡納霉素的基因的時(shí)候，讓每克濾紙吸`收大約14毫升的100 mg/L含卡納霉素的溶液。
[0014]在一些優(yōu)選的方式中，用封口膜密封無菌培養(yǎng)皿，并讓密封的培養(yǎng)皿處于黑暗環(huán)境，溫度24 ±1°C，濕度為60%-75%下暗培養(yǎng)2-3天進(jìn)行發(fā)芽。
[0015]在另一些優(yōu)選的方式中，待種子萌發(fā)至剛露出胚根后，胚根的長度為1-3毫米下，進(jìn)行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)的條件為:溫度24 土 1°C、光照強(qiáng)度2000 Lux，光周期為16 h，直至轉(zhuǎn)基因幼苗長出兩片綠色子葉且陰性對(duì)照出現(xiàn)黃化后，將葉片呈綠色的幼苗播于營養(yǎng)土中，蓋保鮮膜以減少水分蒸發(fā)，繼續(xù)光照培養(yǎng)，培養(yǎng)的條件為:培養(yǎng)溫度24 土 1°C、光照強(qiáng)度2000 Lux，光周期為16 h0
[0016]有益效果
本發(fā)明通過濾紙上還有抗生素來篩選轉(zhuǎn)基因種子，相對(duì)與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基篩選，更快速、更高效與簡(jiǎn)潔，而且成本低。特別適用篩選T0代煙草和擬南芥轉(zhuǎn)基因種子。
【專利附圖】

【附圖說明】[0017]圖1為實(shí)施例子2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。A:陽性對(duì)照(培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙用不含相應(yīng)濃度抗生素的蒸餾水浸潤，種子為野生型本氏煙);B:陰性對(duì)照(培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙用含相應(yīng)濃度抗生素的蒸餾水浸潤，種子為野生型本氏煙);C 代轉(zhuǎn)基因種子。
[0018]圖2實(shí)施例子2的結(jié)果實(shí)驗(yàn)圖。A:幼苗移栽時(shí)合適的根長(3毫米);B:幼苗移栽時(shí)不適宜的根長(實(shí)際為23毫米)。
[0019]圖3為實(shí)施例子2中轉(zhuǎn)基因苗生長的不同階段的結(jié)果圖。A 代轉(zhuǎn)基因種子播種于含相應(yīng)濃度抗生素蒸餾水的培養(yǎng)皿中:T0代轉(zhuǎn)基因種子暗培養(yǎng)2-3 d后剛長出胚根；C:!；代轉(zhuǎn)基因種子經(jīng)光照培養(yǎng)后已長出兩片綠色子葉，并產(chǎn)生3:1的分離比；D-E:移至營養(yǎng)土后的I代轉(zhuǎn)基因幼苗。
[0020]圖4為轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因擬南芥不同生長階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；萌發(fā)A:6 d；B:移苗ID C:移苗5 D D:移苗15D。
【具體實(shí)施方式】
[0021]現(xiàn)以潮霉素抗性轉(zhuǎn)基因煙草為例來說明本發(fā)明的一個(gè)具體方式，該方式并不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0022]實(shí)施1:濾紙中不同含暈的抗生素溶液對(duì)T0代煙草種子萌發(fā)率和篩選效果的影響。
[0023]1.實(shí)驗(yàn)材料
含無菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿、1.0 mL無菌槍頭(剪去槍頭頂端)、1.5 mL無菌離心管、75%乙醇、20%次氯酸鈉及無菌蒸餾水。
[0024]2.種子的消毒與播·種的步驟如下:
①240顆待播的轉(zhuǎn)基因煙草T0代種子倒入1.5mL無菌離心管中，加入1 mL的75%乙醇處理30 s;
②棄去75%乙醇，加入1mL的20%次氯酸鈉處理20 s ；
③棄去20%次氯酸鈉，用無菌蒸餾水洗滌3-4次；
④棄去無菌蒸懼水；
⑤提供含無菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿，提供用無菌蒸餾水作為溶劑配置的40mg/L含潮霉素的溶液，用以上含潮霉素的溶液將培養(yǎng)皿內(nèi)的無菌濾紙打濕，其中，讓培養(yǎng)皿里的無菌紙含有不同含量的抗生素，具體如下(毫升/克濾紙):0、2.2,4.4,7.0,14.0。在露出胚根的時(shí)候統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率(培根的長度為2毫米)。待種子萌發(fā)至剛露出胚根(2毫米長)后，光照培養(yǎng)4d后，統(tǒng)計(jì)綠葉和黃化頁數(shù)目，并計(jì)算比率。培養(yǎng)的條件為:溫度24 土 1°C、光照強(qiáng)度2000Lux,光周期為16 h)。
[0025]⑥用無菌1.0 mL槍頭將種子均勻播種于上述培養(yǎng)皿中的無菌紙表面上；
⑦在培養(yǎng)皿上封上封口膜，讓培養(yǎng)皿暗培養(yǎng)2-3 d，待種子萌發(fā)。
[0026]結(jié)果如下:
表1:濾紙上不同含量抗生素對(duì)煙草T0代轉(zhuǎn)基因種子發(fā)芽和篩選結(jié)果影響
【權(quán)利要求】
1.一種篩選轉(zhuǎn)基因種子的方法，該方法包括:(1)、對(duì)需要篩選的種子進(jìn)行消毒處理；(2)、提供無菌培養(yǎng)皿，在無菌培養(yǎng)皿中放置一張或多張無菌濾紙，使抗生素溶液濕潤每一張濾紙；(3)將經(jīng)過步驟1消毒的種子播種在步驟2的培養(yǎng)皿中的濾紙表面上；其中，所述的種子為TO代煙草或TO代擬南芥轉(zhuǎn)基因種子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)種子為TO代煙草種子的時(shí)候，其中該轉(zhuǎn)基因種子中部分種子含有抗潮霉素的基因，濕潤所述濾紙的抗生素為40 mg/L的潮霉素溶液，讓每克濾紙吸收7毫升的潮霉素溶液，其中，配置抗生素的溶劑為未滅菌的蒸餾水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)種子為T0代擬南芥種子的時(shí)候，其中該轉(zhuǎn)基因種子中部分種子含有抗卡納霉素的基因，濕潤所述濾紙的抗生素為100 mg/L的卡納霉素溶液，讓每克濾紙吸收14毫升的卡納霉素溶液，其中，配置抗生素的溶劑為未滅菌的蒸餾水。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的消毒處理的步驟如下:先將適量待播的轉(zhuǎn)基因種子倒入1.5 mL無菌離心管中，加入75%乙醇處理30 s;棄去75%乙醇，加入20%次氯酸鈉處理20 s ;棄去20%次氯酸鈉，用無菌蒸餾水洗滌種子3-4次。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在步驟3后，用封口膜密封無菌培養(yǎng)皿，并讓密封的培養(yǎng)皿處于黑暗環(huán)境，溫度24 ±1°C，濕度為60%-75%下暗培養(yǎng)2-3天進(jìn)行發(fā)芽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，對(duì)種子進(jìn)行黑暗培養(yǎng)后，待種子萌發(fā)至剛露出胚根，且胚根的長度為1-3毫米時(shí)，進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照培養(yǎng)的條件為:溫度24 土1°C、光照強(qiáng)度2000 Lux，光周期為16 h，直至轉(zhuǎn)基因幼苗長出兩片綠色子葉且陰性對(duì)照出現(xiàn)黃化后，將葉片呈綠色的`幼苗播于營養(yǎng)土中。
【文檔編號(hào)】A01G31/00GK103651078SQ201310677142
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】王長春, 苗爽, 馮彩芬, 湯湖斌, 閔康康, 楊玲, 胡海濤, 張維林 申請(qǐng)人:浙江師范大學(xué)