一種荸薺組培苗高效增殖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種荸薺組培苗高效增殖的方法，該方法使用間歇浸沒式生物反應(yīng)器對(duì)荸薺組培苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)，利用間歇浸沒培養(yǎng)的方法，先后使用液體繼代培養(yǎng)基和液體生根培養(yǎng)基進(jìn)行荸薺組培苗的增殖培養(yǎng)。本發(fā)明方法可有效的防止?fàn)I養(yǎng)沉積和有害物質(zhì)在培養(yǎng)基中的積累，從而更有效利用培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分；本發(fā)明的培養(yǎng)基配方適合于使用間歇浸沒式培養(yǎng)增殖荸薺組培苗，在本發(fā)明的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件下，荸薺組培苗的長勢和增殖率大大優(yōu)于傳統(tǒng)方法，生根苗移栽馴化的成活率高，縮短生產(chǎn)時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，并且降低了生產(chǎn)成本和勞動(dòng)力成本，可大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【專利說明】一種荸薺組培苗高效增殖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種荸薺組培苗高效增殖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]荸莽(Eleocharis tuberosaRoem.et.Schlt)屬莎草科荸莽屬，又叫馬蹄、烏芋、通天草等，是我國原產(chǎn)的一種多年水生草本植物。荸薺不僅是廣西名特優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品之一，也是我國傳統(tǒng)的重要出口創(chuàng)匯產(chǎn)品之一。近十年來我國荸薺產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展。為了保持新品種的優(yōu)良性狀，學(xué)者研究發(fā)展了荸薺組織培養(yǎng)技術(shù)。但傳統(tǒng)荸薺組培主要是采用半固體培養(yǎng)，該方法在組織培養(yǎng)操作過程中需要大量的手工勞動(dòng)，成本高，增殖率較低，需要增殖7~8代才能獲得大量組培苗，是一種勞動(dòng)密集型技術(shù)。因此，改善荸薺培養(yǎng)工藝，建立新的培養(yǎng)方法體系，減少勞動(dòng)力耗費(fèi)，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化培養(yǎng)是降低成本實(shí)現(xiàn)荸薺商業(yè)培養(yǎng)的一種趨勢。
[0003]自20世紀(jì)80年代中期開始，西方國家開始了大規(guī)模液體浸沒組織培養(yǎng)的研究，到90年代中后期取得了突破性的進(jìn)展。間歇浸沒式生物反應(yīng)器(TIBs)是近20年來國際上新創(chuàng)造的一種用于植物組織快繁及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的系統(tǒng)，其主要是利用液體培養(yǎng)基以經(jīng)過過濾的空氣壓力為動(dòng)力對(duì)植物組培苗進(jìn)行間歇式的培養(yǎng)，相對(duì)于傳統(tǒng)的方法而言，它不僅擁有液體培養(yǎng)的優(yōu)勢，又避免了由于液體培養(yǎng)過程中周期長而帶來的玻璃化畸形和次生代謝物的傷害帶來的生理問題。間歇浸沒式生物反應(yīng)器(TIBs)自動(dòng)化程度高，在兩個(gè)月的培養(yǎng)周期中，材料無需轉(zhuǎn)接，節(jié)省人力物力，在組織培養(yǎng)過程中大大的降低生產(chǎn)成本。該培養(yǎng)方式結(jié)合了固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)而舍棄其缺點(diǎn)，使培養(yǎng)材料達(dá)到最大的增殖數(shù)。國外利用浸沒式生物反應(yīng)器進(jìn)行(TIBs)進(jìn)行組培快繁研究的植物組培品種較多，而國內(nèi)卻鮮少有相關(guān)報(bào)道。目前國內(nèi)外研究報(bào)道的植物種類主要集中在果樹上，水生蔬菜作物未見報(bào)道。主要有菠蘿(Aragone.ral.2010)、香蕉(楊柳，2010; Ikraul akqe.ral.,2007; Roelseral.，2005;Matsumotoeral.，2002)、海蔥(wroseh.ral.，2005)、辰星草(廉美蘭，2004)、甘蔗(Bernal`e.ral.2008;劉麗敏，2009; Angelaeral.2009;楊柳，2010)、山藥(Jova.ral., 2005)、木薯(Pat1.ral., 2007)、按樹(MeAliste.ral., 2005)、蘋果(Zhu.ral., 2005) > Aragoneq.ral.,2006)、馬鈴薯(Jimnez.ral., 1999)等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)上述技術(shù)問題，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)，針對(duì)荸薺的植物特點(diǎn)和生長特性設(shè)計(jì)了一種荸薺組培苗高效增殖的方法，該方法利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器對(duì)荸薺組培苗進(jìn)行增殖，增殖效率高、成本低。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0006]一種荸薺組培苗高效增殖的方法，該方法使用間歇浸沒式生物反應(yīng)器對(duì)荸薺組培苗進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，包括以下步驟:
[0007](I)將脫毒培養(yǎng)的荸薺組培苗接種入間歇浸沒式生物反應(yīng)器中；
[0008](2)利用間歇浸沒式培養(yǎng)方法，使用液體繼代培養(yǎng)基對(duì)荸薺組培苗進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)；
[0009](3)利用間歇浸沒式培養(yǎng)方法，使用液體生根培養(yǎng)基對(duì)繼代增殖培養(yǎng)后的荸薺組培苗進(jìn)行生根培養(yǎng)。
[0010]優(yōu)選地，步驟(1)所述的荸薺組培苗為第4代或第5代荸薺組培苗。
[0011 ] 優(yōu)選地，步驟(1)中，將荸薺組培苗接種入間歇浸沒式生物反應(yīng)器中的接種密度是10 ~15 叢 /Lo
[0012]優(yōu)選地，步驟(2)中，液體繼代培養(yǎng)基的配方為:MS液體培養(yǎng)基+6-BA2.5mg/L+NAA
0.01mg/L+ 白糖 30g/L，pH 值為 5.8 ~6.2。
[0013]優(yōu)選地，步驟(2)中，間歇式浸沒培養(yǎng)的浸沒頻率為每4小時(shí)浸沒10分鐘，連續(xù)培養(yǎng)40天。
[0014]優(yōu)選地，步驟(3)中，液體生根培養(yǎng)基的配方為:MS液體培養(yǎng)基+6-BA0.lmg/L+NAA
1.0mg/L+ 白糖 30g/L，pH 值為 5.8 ~6.2。
[0015]優(yōu)選地，步驟(3)中，間歇式浸沒培養(yǎng)的浸沒頻率為每6小時(shí)浸沒10分鐘，連續(xù)培養(yǎng)30天。
[0016]優(yōu)選地，在使用間 歇浸沒式生物反應(yīng)器對(duì)荸薺組培苗進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的整個(gè)過程中，控制培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度15001χ，培養(yǎng)溫度28°C，壓力0.05~0.08Mpa,光照 16h/d,黑暗 8h/d。
[0017]通過以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果如下:
[0018](I)本發(fā)明使用間歇浸沒式生物反應(yīng)器對(duì)荸薺組培苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)，可有效的防止?fàn)I養(yǎng)沉積和有害物質(zhì)在培養(yǎng)基中的積累，從而更有效利用培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分；
[0019](2)本發(fā)明的培養(yǎng)基配方適合于使用間歇浸沒式培養(yǎng)增殖荸薺組培苗，通過合適的6-BA和NAA濃度配合恰當(dāng)?shù)拈g歇浸沒頻率，在繼代培養(yǎng)時(shí)加速了外植體的誘導(dǎo)分化，提高了增殖系數(shù)，在生根培養(yǎng)時(shí)提高了生根效果和壯苗率，生根苗移栽馴化的成活率較傳統(tǒng)方法高；在本發(fā)明的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件下，荸薺組培苗的長勢和增殖率大大優(yōu)于傳統(tǒng)方法；
[0020](3)本發(fā)明在兩個(gè)月的培養(yǎng)周期中，材料無需轉(zhuǎn)接，降低了勞動(dòng)力成本，節(jié)約了生產(chǎn)成本，增加經(jīng)濟(jì)效益；
[0021](4)傳統(tǒng)方法獲得大量組培苗需要增殖7~8代，而本發(fā)明方法增殖2~3代即可滿足，大大縮短生產(chǎn)時(shí)間，生產(chǎn)效率更高，更適于工廠規(guī)?；a(chǎn)，可大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和本質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0023]實(shí)施例使用間歇浸沒式生物反應(yīng)器進(jìn)行荸薺組培苗的高效增殖
[0024](I)建立無菌培養(yǎng)體系，選用荸薺莖尖脫毒培養(yǎng)的第4代組培苗，在超凈工作臺(tái)上，用無菌水洗去基部固體培養(yǎng)基，打頂，轉(zhuǎn)接于間歇浸沒式生物反應(yīng)器容器中，接種密度為10叢/L ;
[0025](2)繼代增殖培養(yǎng)
[0026]利用間歇浸沒式培養(yǎng)方法，使用液體繼代培養(yǎng)基對(duì)荸薺組培苗進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，繼代增殖培養(yǎng)基的配方為:MS液體培養(yǎng)基+6-BA 2.5mg/L+NAA0.01mg/L+白糖30g/L，pH值為6.0 ;浸沒頻率為每4小時(shí)一次,浸沒時(shí)間為10分鐘；控制培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度15001x,培養(yǎng)溫度28°C，壓力0.05~0.08Mpa,光照16h/d，黑暗8h/d ;連續(xù)培養(yǎng)40天。統(tǒng)計(jì)增殖效果。
[0027](4)生根培養(yǎng)
[0028]利用間歇浸沒式培養(yǎng)方法，使用液體生根培養(yǎng)基對(duì)繼代增殖培養(yǎng)后的荸薺組培苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，待增殖培養(yǎng)結(jié)束后，更換液體生根培養(yǎng)基，液體生根培養(yǎng)基的配方為:MS液體培養(yǎng)基+6-BA 0.lmg/L+NAA 1.0mg/L+白糖30g/L，pH值為6.0 ;浸沒頻率為每6小時(shí)一次，浸沒時(shí)間為10分鐘；控制培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度15001x，培養(yǎng)溫度28°C，壓力0.05~0.08Mpa，光照16h/d，黑暗8h/d ;連續(xù)培養(yǎng)30天。
[0029]結(jié)束生根培養(yǎng)后，將組培苗移栽馴化，統(tǒng)計(jì)成活率。
[0030]其中，MS液體培養(yǎng)基的各組分的質(zhì)量濃度為:硝酸鉀1900mg/L、硝酸銨1650mg/L、磷酸二氫鉀170mg/L、七水硫酸鎂370mg/L、二水合氯化鉀440mg/L、碘化鉀0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水合硫酸錳22.3mg/L、七水合硫酸鋅8.6mg/L、二水合鑰酸納0.25mg/L、五水合硫酸銅0.025mg/L、氯化鈷0.025mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L、七水合硫酸亞鐵27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、鹽酸硫胺素0.lmg/L、鹽酸批卩多醇0.5mg/L、鹿糖30g/L。
[0031]對(duì)照例使用傳統(tǒng)固體組培進(jìn)行荸薺組培苗的增殖
[0032]固體培養(yǎng)參照杭玲等組培快繁技術(shù)設(shè)計(jì)(荸薺脫毒及組培快繁技術(shù)研究與應(yīng)用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2007 (6):143-144、荸薺的組織培養(yǎng)和快速繁殖探討[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011 (6): 1241—1243)，培養(yǎng)瓶為250ml翠綠色玻璃瓶，瓶高13cm，直徑7cm，固體培養(yǎng)基體積30ml，凝固劑用卡拉膠；培養(yǎng)40天時(shí)統(tǒng)計(jì)增殖效果與實(shí)施例進(jìn)行比較，結(jié)果見表1，結(jié)束生根培養(yǎng)后，將組培苗移栽馴化，統(tǒng)計(jì)成活率。
[0033]試驗(yàn)例I荸薺不同繼代組培苗對(duì)荸薺組培苗增殖的影響
[0034]使用本發(fā)明方法對(duì)不同繼代數(shù)的荸薺組培苗進(jìn)行培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)萌芽時(shí)間、增殖芽數(shù)和增值系數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。
[0035]試驗(yàn)例2不同間歇頻率對(duì)荸薺組培苗增殖的影響
[0036]使用本發(fā)明方法對(duì)荸薺組培苗進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)共分6組，在繼代培養(yǎng)時(shí)每組采用不同的浸沒間歇頻率，統(tǒng)計(jì)各組荸薺組培苗的增殖情況，試驗(yàn)結(jié)果見表3。
[0037]試驗(yàn)例3不同激素組合對(duì)荸薺組培苗增殖的影響
[0038]使用本發(fā)明方法對(duì)荸薺組培苗進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)共分10組，每組的液體繼代培養(yǎng)基采用不同的激素比例，對(duì)比增殖效果，結(jié)果見表4。
[0039]試驗(yàn)例4不同接種密度對(duì)荸薺組培苗增殖的影響
[0040]使用本發(fā)明方法對(duì)荸薺組培苗進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)共分5組，每組的采用不同的接種密度，統(tǒng)計(jì)各組荸薺組培苗的生長情況，試驗(yàn)結(jié)果見表5。
[0041]試驗(yàn)例5不同間歇頻率對(duì)荸薺組培苗生根的影響
[0042]使用本發(fā)明方法對(duì)荸薺組培苗進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)共分6組，在生根培養(yǎng)時(shí)每組采用不同的浸沒間歇頻率，統(tǒng)計(jì)各組荸薺組培苗的生根情況，試驗(yàn)結(jié)果見表6。
[0043]結(jié)果:[0044]1.荸薺組培苗增殖效果對(duì)比
[0045]表1對(duì)照例與實(shí)施例培養(yǎng)荸薺組培苗40d的效果比較
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種荸薺組培苗高效增殖的方法，其特征在于:使用間歇浸沒式生物反應(yīng)器對(duì)荸薺組培苗進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種荸薺組培苗高效增殖的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將脫毒培養(yǎng)的荸薺組培苗接種入間歇浸沒式生物反應(yīng)器中； (2)利用間歇浸沒式培養(yǎng)方法，使用液體繼代培養(yǎng)基對(duì)荸薺組培苗進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng); (3)利用間歇浸沒式培養(yǎng)方法，使用液體生根培養(yǎng)基對(duì)繼代增殖培養(yǎng)后的荸薺組培苗進(jìn)行生根培養(yǎng)。
3.按照權(quán)利要求2所述的一種荸薺組培苗高效增殖的方法，其特征在于:步驟(1)所述的荸薺組培苗為第4代或第5代荸薺組培苗。
4.按照權(quán)利要求2所述的一種荸薺組培苗高效增殖的方法，其特征在于:步驟(1)中，將荸薺組培苗接種入間歇浸沒式生物反應(yīng)器中的接種密度是10~15叢/L。
5.按照權(quán)利要求2所述的一種荸薺組培苗高效增殖的方法，其特征在于:步驟(2)中，液體繼代培養(yǎng)基的配方為:MS液體培養(yǎng)基+6-BA 2.5mg/L+NAA0.01mg/L+白糖30g/L，pH值為 5.8 ~6.2。
6.按照權(quán)利要求2所述的一種荸薺組培苗高效增殖的方法，其特征在于:步驟(2)中，間歇式浸沒培養(yǎng)的浸沒頻率為每4小時(shí)浸沒10分鐘，連續(xù)培養(yǎng)40天。
7.按照權(quán)利要求2所述的一種荸薺組培苗高效增殖的方法，其特征在于:步驟(3)中，液體生根培養(yǎng)基的配方為:MS液體培養(yǎng)基+6-BA 0.lmg/L+NAAl.0mg/L+白糖30g/L，pH值為 5.8 ~6.2。
8.按照權(quán)利要求2所述的一種荸薺組培苗高效增殖的方法，其特征在于:步驟(3)中，間歇式浸沒培養(yǎng)的浸沒頻率為每6小時(shí)浸沒10分鐘，連續(xù)培養(yǎng)30天。
9.按照權(quán)利要求1~6任一項(xiàng)所述的一種荸薺組培苗高效增殖的方法，其特征在于: 在使用間歇浸沒式生物反應(yīng)器對(duì)荸薺組培苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)的整個(gè)過程中，控制培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度15001χ，培養(yǎng)溫度28°C，壓力0.05~0.08Mpa，光照16h/d，黑暗8h/d。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103688862SQ201310700988
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月16日
【發(fā)明者】高美萍, 陳麗娟, 蔡炳華, 江文, 周瑜, 郭暢, 閉志強(qiáng), 唐軍, 董偉清, 周維, 楊柳 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所