參與調(diào)控黃瓜葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種參與調(diào)控黃瓜葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220及其應用，它是首次在黃瓜基因組中發(fā)現(xiàn)的控制苦味合成的兩個bHLH轉(zhuǎn)錄因子（Csa5G157230和Csa5G156220）之一，兩個bHLH轉(zhuǎn)錄因子分別在果實和葉片中控制苦味的形成。利用酵母單雜交、凝膠組織體系和煙草瞬時表達證明了這兩個轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合到與苦味合成啟動子區(qū)域結(jié)合并激活合成基因的轉(zhuǎn)錄；同時在無苦味的黃瓜葉片或果實中大量表達對應的轉(zhuǎn)錄因子能夠恢復黃瓜植株的苦味性狀。本發(fā)明進一步揭示了黃瓜苦味形成的分子機制，為無苦味黃瓜育種提供了理論依據(jù)和分子輔助育種目標。
【專利說明】參與調(diào)控黃瓜葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學領(lǐng)域，具體地說，涉及參與調(diào)控黃瓜葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002]黃瓜的苦味是由一類稱為葫蘆素C的三萜化合物導致的。黃瓜果實中積累葫蘆素C會嚴重影響黃瓜的口感及品質(zhì)。早期的經(jīng)典遺傳學試驗發(fā)現(xiàn)黃瓜的苦味由Bi和Bt兩個基因控制。最近研究發(fā)現(xiàn)一個由8個基因組成的基因簇參與黃瓜苦味的合成。其中Bi基因編碼氧化角鯊烯環(huán)化酶，它催化生成葫蘆2烯醇，是葫蘆素C合成的第一步，也是合成中最關(guān)鍵的一步。
[0003]盡管已經(jīng)基本確定了黃瓜中苦味合成的分子機制，但調(diào)控苦味形成的分子機制目前還不清楚，相關(guān)合成基因也未被克隆。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供參與調(diào)控黃瓜葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220及其應
用。
[0005]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種參與調(diào)控黃瓜葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0006]本發(fā)明還提供編碼所述轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220的基因，其核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。
[0007]本發(fā)明還提供含有編碼所述轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220基因的載體、工程菌、宿主細胞及轉(zhuǎn)化的植物。
[0008]本發(fā)明還提供編碼所述轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220的基因在調(diào)控黃瓜苦味合成中的應用。
[0009]本發(fā)明還提供編碼所述轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220的基因在無苦味黃瓜分子育種中的應用。
[0010]本發(fā)明還提供一種在植物中瞬時表達基因的方法，采用農(nóng)桿菌介導的方法，將含有編碼所述轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220基因的載體轉(zhuǎn)入植物體(如煙草)中，獲得目的基因大量表達。
[0011]本發(fā)明進一步提供用于PCR擴增編碼所述轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220基因的引物對，包括上游引物5 ' -TCTCTTTCCTCTCTCATTACGGGTGA-3 '和下游引物5' -CGCACATCAAGGCAATCAACTCG-3'。
[0012]從來自湖南的一個葉片無苦味的黃瓜突變體(XY - 3)，它是由苦味黃瓜(XY - 2)自然突變而來。在突變體XY - 3中，檢測了之前發(fā)現(xiàn)的苦味合成基因的表達，發(fā)現(xiàn)苦味合成基因簇在突變體中的表達量非常的低。由此推測該突變體中調(diào)控苦味合成的基因可能發(fā)生了突變。將XY — 2和XY — 3的基因組DNA進行測序。通過比較基因組序列，重點尋找發(fā)生在轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)部突變。通過分析，找到一個SNP，位于Csa5G156220這個轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)部。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)該基因只在葉片中大量表達。進一步檢測該基因在突變體XY —3中的表達，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子在突變體中的表達也大幅降低。此外，還發(fā)現(xiàn)干旱以及ABA等逆境處理都可以使該轉(zhuǎn)錄因子及苦味合成基因表達升高，具有很高的一致性。因此，推測該突變可能導致該轉(zhuǎn)錄因子表達量降低，從而使合成基因表達大幅降低，最終導致了葉片從苦變?yōu)椴豢唷?br> [0013]為了進一步驗證，進行了酵母單雜交和凝膠阻滯實驗，證明該轉(zhuǎn)錄因子的確能夠結(jié)合到苦味合成基因的啟動子區(qū)域。此外，還將苦味合成基因的啟動子連上報告基因(LUC)，在煙草中檢測轉(zhuǎn)錄因子對啟動子區(qū)域的激活作用，發(fā)現(xiàn)它可以激活報告基因的表達。由于穩(wěn)定的黃瓜轉(zhuǎn)基因體系還不成熟，因此，本發(fā)明建立了黃瓜子葉瞬時表達系統(tǒng)，利用農(nóng)桿菌將轉(zhuǎn)錄因子導入黃瓜XY - 3的無無苦味子葉中，一周后檢測子葉，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子和合成基因大量表達，從而導致子葉由不苦變成苦。綜合上述研究結(jié)果，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了在葉片中調(diào)控苦味合成基因表達的轉(zhuǎn)錄因子。將該基因命名為Bf，它通過調(diào)控合成基因的表達從而進一步調(diào)控葉片苦味的形成。
[0014]之前的遺傳分析發(fā)現(xiàn)黃瓜果實基因是由Bt基因控制。由于野生黃瓜果實非常的苦，因此在黃瓜馴化過程中，Bt基因必然發(fā)生了突變，導致黃瓜果實不苦，該突變受到人為選擇而保留下來。在之前的研究中，對114份黃瓜核心種質(zhì)材料進行重測序分析，通過生物信息學分析黃瓜馴化發(fā)生的區(qū)域，再結(jié)合圖位克隆，將Bt基因定位到5號染色體442kb的區(qū)間內(nèi)。此區(qū)間有68個候選基因。進一步分析這些基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其中Csa5G157230只在野生黃瓜的果實中表達，在栽培黃瓜果實中不表達。并且Csa5G157230基因與同時發(fā)現(xiàn)的調(diào)控葉片苦味合成的基因是同源基因，都是bHLH類轉(zhuǎn)錄因子。通過檢測Csa5G157230基因和苦 味合成Bi基因在不同黃瓜品種中以及Bt基因分離群體個體中的基因表達情況。發(fā)現(xiàn)它們的表達量與果實中苦味素的含量呈正相關(guān)。即Csa5G157230基因的表達量越高，則Bi基因表達量越高，從而黃瓜果實越苦。根據(jù)這些信息，推測這個基因很有可能就是Bt基因，它通過類似Bf調(diào)控苦味合成的機制調(diào)控黃瓜果實中的苦味合成。
[0015]基于之前已報道的研究體系，如酵母單雜交、凝膠阻滯證明Csa5G157230基因的確可以轉(zhuǎn)錄激活苦味合成基因的表達。由于穩(wěn)定的黃瓜轉(zhuǎn)基因體系還不成熟，因此本發(fā)明建立了黃瓜果實瞬時表達系統(tǒng)，利用農(nóng)桿菌將Csa5G157230基因?qū)胄绿┟艽坦麑嵵校芎髾z測注射區(qū)域的果實，發(fā)現(xiàn)Csa5G157230基因和合成基因大量表達，從而導致果實由不苦變成苦。綜合上述研究結(jié)果，認為Csa5G157230基因即為Bt基因。它通過調(diào)控合成基因的表達從而進一步調(diào)控果實苦味的形成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明實施例1中涉及的XY-3無苦味突變體相關(guān)信息；其中，A為突變體中葫蘆素C的相對濃度，XY-2為苦味黃瓜；B為突變體中苦味合成基因的表達情況；C為重測序發(fā)現(xiàn)突變的位置位于Bf轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)部。
[0017]圖2為本發(fā)明實施例1中用干旱和ABA處理后Csa5G156220及苦味合成基因的表達情況。
[0018]圖3為本發(fā)明實施例1中用生物信息學分析結(jié)合圖位克隆，將Bt基因定位于5號染色體的情況；其中，有67個候補基因，它們在野生和栽培黃瓜果實及葉片中的表達用漸變色區(qū)分，越深代表含量越高。
[0019]圖4為本發(fā)明實施例1中檢測不同種類的黃瓜以及Bt分離群體中的個體中苦味合成基因B1、苦味調(diào)控基因Bt的表達及葫蘆素C的含量。
[0020]圖5為本發(fā)明實施例1中用酵母單雜交系統(tǒng)和煙草瞬時表達系統(tǒng)證明Bf可以結(jié)合到苦味合成基因的啟動子上，并激活下游報告基因轉(zhuǎn)錄。
[0021]圖6為本發(fā)明實施例1中用凝膠阻滯系統(tǒng)證明Bf可以結(jié)合到苦味合成基因的啟動子上。
[0022]圖7為本發(fā)明實施例1中用酵母單雜交系統(tǒng)和煙草瞬時表達系統(tǒng)證明Bt可以結(jié)合到苦味合成基因的啟動子上，并激活下游報告基因轉(zhuǎn)錄。
[0023]圖8為本發(fā)明實施例1中用凝膠阻滯系統(tǒng)證明Bf可以結(jié)合到苦味合成基因的啟動子上。
[0024]圖9為本發(fā)明實施例2中分別用葉片和果實瞬時表達系統(tǒng)來證明Bf和Bt的生物學功能，當Bf或Bt表達后導致苦味合成基因Bt表達升高，最終使苦味物質(zhì)葫蘆素C的含 量升高。
【具體實施方式】
[0025]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0026]實施例1調(diào)控黃瓜葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子挖掘與獲得
[0027]1、候補基因的挖掘
[0028]在湖南發(fā)現(xiàn)了一個葉片無苦味的黃瓜突變體(XY - 3)，它是由苦味黃瓜(XY - 2)自然突變而來(圖1，A)。在突變體XY - 3中，苦味合成基因簇在突變體中的表達量非常的低(圖1，B)，推測該突變體中調(diào)控苦味合成的基因可能發(fā)生了突變。將XY — 2和XY — 3的基因組DNA進行重測序。利用生物信息學分析，尋找發(fā)生在轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)部突變。該分析找到一個SNP，位于Csa5G156220這個轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)部(圖1，C)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示該基因只在葉片中大量表達，且該轉(zhuǎn)錄因子在突變體中的表達也大幅降低(圖1，B)。此外，干旱以及ABA等逆境處理都可以使該轉(zhuǎn)錄因子及苦味合成基因表達升高(圖2)。因此，將該轉(zhuǎn)錄因子列為候補基因，命名為Bf。
[0029]之前的遺傳分析發(fā)現(xiàn)黃瓜果實苦味是由Bt基因控制。在黃瓜馴化過程中，Bt基因必然發(fā)生了突變，導致黃瓜果實不苦。對114份黃瓜核心種質(zhì)材料進行重測序分析，通過生物信息學分析黃瓜馴化發(fā)生的區(qū)域，再結(jié)合圖位克隆，將Bt基因定位到5號染色體442kb的區(qū)間內(nèi)。此區(qū)間有68個候選基因(圖3)。進一步分析這些基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其中Csa5G157230只在野生黃瓜的果實中表達，在栽培黃瓜果實中不表達(圖3)。檢測Csa5G157230基因和苦味合成Bi基因在不同黃瓜品種中以及Bt基因分離群體個體中的基因表達情況。發(fā)現(xiàn)它們的表達量與果實中苦味素的含量呈正相關(guān)(圖4)。即Csa5G157230基因的表達量越高，則Bi基因表達量越高，從而黃瓜果實越苦。并且Csa5G157230基因與我們發(fā)現(xiàn)的調(diào)控葉片苦味合成的基因是同源基因，都是bHLH類轉(zhuǎn)錄因子。根據(jù)這些信息，推測這個基因很有可能就是Bt基因，它通過類似Bf調(diào)控苦味合成的機制調(diào)控黃瓜果實中的苦味合成。
[0030]2、黃瓜Csa5G156220基因功能驗證
[0031 ] 首先制備黃瓜葉片和果實的cDNA文庫，然后利用正向引物和反向弓丨物進行PCR擴增(引物序列見表1)。
[0032]表1引物序列(5' -3')
[0033]
【權(quán)利要求】
1.參與調(diào)控黃瓜葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述基因的工程菌。
6.權(quán)利要求2或3所述基因在調(diào)控黃瓜苦味合成中的應用。
7.權(quán)利要求2或3所述基因在無苦味黃瓜分子育種中的應用。
8.一種在植物中瞬時表達基因的方法，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導的方法，將權(quán)利要求4所述的載體轉(zhuǎn)入植物體中，獲得目的基因大量表達。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物包括但不限于黃瓜、煙草。
10.用于PCR擴增權(quán)利要求2或3所述基因的引物對，其特征在于，包括上游引物5' -TCTCTTTCCTCTCT CATTACGGGTGA-3'和下游引物 5' -CGCACATCAAGGCAATCAACTCG-3'。
【文檔編號】A01H5/00GK103755791SQ201310701069
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】黃三文, 尚軼, 張慧明, 陳惠明, 張忠華 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所