一種芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物的組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體提供一種芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法，具體步驟如下：將經(jīng)滅菌消毒的芍藥莖段先后接種到啟動培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，并將獲得的愈傷組織接種到不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行光照培養(yǎng)或黑暗培養(yǎng)，獲得芍藥組培苗。本發(fā)明所提供的芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法操作簡單，成本廉價，能夠廣泛適用于多數(shù)芍藥品種，有效解決了芍藥傳統(tǒng)分株繁殖不能滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需求，芍藥地下芽組培均存在困難的問題。本發(fā)明還提供所述芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法在芍藥繁育中的應(yīng)用。
【專利說明】一種芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物的組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]芍藥(Peaonia lactiflora Pal1.)為芍藥科芍藥屬的多年生宿根草本花卉，在我國栽培歷史悠久，達(dá)3900多年的歷史。
[0003]芍藥通常以分株繁殖為主，3-5年分一次，繁殖周期較長且繁殖系數(shù)較低。播種繁殖法較簡單，但繁殖周期長，通常4-5年才可開花，且無法保持母本的優(yōu)良性狀，不宜進(jìn)行大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。組織培養(yǎng)可以避免以上缺點，并具有繁殖速度快、不受環(huán)境條件限制等優(yōu)點，因而可大面積推廣。以植物的葉片、莖段等作為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，從而誘導(dǎo)新的植株產(chǎn)生，是目前芍藥重要的快速繁殖和育種途徑之一，但尚未形成一套完整的體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了建立一套完整的芍藥快速繁殖體系，本發(fā)明的目的在于提供一種芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法，具體步驟如下:
[0005]將經(jīng)滅菌消毒的芍藥莖段先后接種到啟動培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，并將獲得的愈傷組織接種到不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行光照培養(yǎng)或黑暗培養(yǎng)，獲得芍藥組培苗。
[0006]其中，芍藥莖段取材的時間為4月初。
[0007]其中，所述滅菌消毒的具體方法為:將芍藥嫩莖沖洗干凈，用洗潔精和質(zhì)量百分比
`0.26%的NaClO浸泡20~30min，沖洗后吸干水分，用體積百分比75%的酒精消毒30s，無菌水沖洗，再用質(zhì)量百分比0.1%的HgCl2消毒lOmin，無菌水沖洗，橫切成長0.1-0.3cm的莖段備用。
[0008]其中，所述啟動培養(yǎng)基為:以Ca2+濃度加倍的1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有TDZ的濃度為0.5mg/L、2，4-D的濃度為0.5mg/L、NAA的濃度為0.5mg/L的培養(yǎng)基。
[0009]其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:以WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有TDZ的濃度為0.5mg/L、2，4-D的濃度為0.5mg/L的培養(yǎng)基。
[0010]其中，所述增殖培養(yǎng)基為:以Ca2+濃度加倍的1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有TDZ的濃度為0.lmg/L, NAA的濃度為0.2mg/L的培養(yǎng)基。
[0011]其中，所述分化培養(yǎng)基為:以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有TDZ的濃度為0.1-0.5mg/L、2，4-D的濃度為0-1.0mg/L、NAA的濃度為0-0.5mg/L的培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)基優(yōu)選為:以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有TDZ的濃度為0.5mg/L、NAA的濃度為0.5mg/L的培養(yǎng)基。
[0012]其中，所述不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:以Ca2+濃度加倍的1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有IBA的濃度為1.0mg/L的培養(yǎng)基。
[0013]其中，所述獲得的愈傷組織接種到不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，優(yōu)選進(jìn)行光照培養(yǎng)。[0014]其中，以啟動培養(yǎng)基培養(yǎng)的時間為30天；以誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的時間為30天；以增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)的時間為30天；以分化培養(yǎng)基培養(yǎng)的時間為30天；以不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的時間為30天。
[0015]其中，所述常規(guī)培養(yǎng)和光照培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均為溫度23±2°C，光照時間14小時/天，光照強(qiáng)度2000-30001x ;所述黑暗培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為黑暗條件下溫度23±2°C。
[0016]其中，所述芍藥為芍藥品種珊瑚落日。
[0017]本發(fā)明還提供所述的一種芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法在芍藥繁育中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明的有益效果在于:
[0019](1)芍藥組培一直是國內(nèi)外的難題，本發(fā)明通過基本培養(yǎng)基的篩選、不同培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方式的比較、不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和分化的影響等步驟，提供了一種有效的芍藥愈傷組織培養(yǎng)方法。
[0020](2)本發(fā)明為芍藥愈傷組織誘導(dǎo)的組培方法，操作簡單，成本廉價，能夠廣泛適用于多數(shù)芍藥品種的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是實施例1中4月份抽莖期取材時芍藥生長狀況的照片；
[0022]圖2是實施例1中‘珊瑚落日’在1/2MS(Ca2+加倍)為基本培養(yǎng)基的啟動培養(yǎng)上的生長情況照片；
[0023]圖3是實施例1中‘珊瑚落日’在激素組合為0.5mg/L TDZ+0.5mg/L2, 4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的生長情況照片；
[0024]圖4是實施例1中‘珊瑚落日’在增殖培養(yǎng)基0.2mg/L TDZ+0.2mg/L NAA上的生長情況照片；
[0025]圖5是實施例1中固體培養(yǎng)條件下1/2MS (Ca2+加倍)+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L NAA對‘珊瑚落日’愈傷組織分化的影響照片。
【具體實施方式】
[0026]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0027]若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0028]實施例1
[0029]1.材料與方法
[0030]試驗材料于2011年4月初取自北京市昌平區(qū)小湯山國家花卉工程中心，取材時芍藥的生長狀況見圖1。以嫩莖作為外植體采自3年生以上的芍藥品種‘珊瑚落日’。
[0031]將取回來的嫩莖在流水下沖洗干凈，再用洗潔精和質(zhì)量百分比濃度為0.26%的NaClO浸泡20~30min，再在流水下沖洗30~40min，用吸水紙吸取所帶的水分，放置到超凈工作臺上進(jìn)行消毒處理。用體積百分比75%的酒精消毒30s，無菌水沖洗2遍，再用質(zhì)量百分比0.1%的HgCl2消毒lOmin，無菌水沖洗4次，接種時，將莖段橫切成0.1-0.3cm的薄片，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面。
[0032]將‘珊瑚落日’莖段接種到以三種不同固體基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的啟動培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基為 MS+0.5mg/L TDZ (苯基噻二唑基脲)+0.5mg/L 2，4_D (2，4- 二氯苯氧乙酸)+0.5mg/L NAA(萘乙酸)、l/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L 2，4-D+0.5mg/L NAA.WPM+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L 2, 4-D+0.5mg/L NAA，30d 后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。其中，MS+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L2，4-D+0.5mg/L NAA即為:以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有TDZ的濃度為0.5mg/L、2，4_D的濃度為0.5mg/L、NAA的濃度為0.5mg/L的培養(yǎng)基，其它的培養(yǎng)基以此類推。
[0033]將‘珊瑚落日’的莖段接種于三種不同激素組合的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為 WPM+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L2, 4_D、ffPM+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L NAA、WPM+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L 2，4-D+0.5mg/L NAA 培養(yǎng)基中，30d 后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
[0034]愈傷組織增殖培養(yǎng)基采用L9(34)的正交設(shè)計，為固體培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)基分別為㈠ l/2MS(Ca2+加倍)+0.lmg/L TDZ+0.2mg/L NAA、㈡ 1/2MS (Ca2+加倍)+0.2mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+1.0mg/L6-BA、㈢ l/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L TDZ+1.0mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA、(四)l/2MS(Ca2+ 加倍)+0.5mg/L 2, 4-D+0.lmg/L TDZ+0.5mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA,㈤l/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L 2, 4-D+0.2mg/L TDZ+1.0mg/L NAA、㈥ 1/2MS (Ca2+加倍)+0.5mg/L 2, 4-D+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA,㈦ l/2MS(Ca2+ 加倍)+1.0mg/L 2, 4-D+0.lmg/L TDZ+1.0mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA,㈧ l/2MS(Ca2+ 加倍)+1.0mg/L 2, 4-D+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA,(九)1/2MS (Ca2+ 加倍)+1.0mg/L2，4-D+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L NAA，30d 后統(tǒng)計增殖倍數(shù)等數(shù)據(jù)。
[0035]愈傷組織分化培養(yǎng)基采用固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩種方式，分化培養(yǎng)基分別為:㈠固體培養(yǎng) 1/2MS (Ca2+ 加倍)+0.lmg/L TDZ+0.2mg/L NAA、(二)固體培養(yǎng) 1/2MS (Ca2+ 加倍)+1.0mg/L 2，4-D+0.lmg/L TDZ、㈢固體培養(yǎng) 1/2MS (Ca2+ 加倍)+0.5mg/L TDZ+0.5mg/LNAA、㈣固體培養(yǎng) l/2MS(Ca2+ 加倍)+1.0mg/L 2，4-D+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L NAA、㈤液體培養(yǎng) 1/2MS (Ca2+ 加倍)+0.lmg/L TDZ+0.2mg/L NAA、㈥液體培養(yǎng) 1/2MS (Ca2+ 加倍)+1.0mg/L2, 4-D+0.lmg/L TDZ、㈦液體培養(yǎng) 1/2MS (Ca2+加倍)+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L NAA、㈧液體培養(yǎng) l/2MS(Ca2+加倍)+1.0mg/L 2, 4-D+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L NAA，30d 后統(tǒng)計褐化率、增殖倍數(shù)和生長情況。
[0036]將‘珊瑚落日’增殖產(chǎn)生的愈傷組織以光照和黑暗兩種方式培養(yǎng)，不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:㈠光照 1/2MS (Ca2+ 加倍)+0.5mg/L IBA、㈡光照 1/2MS (Ca2+ 加倍)+1.0mg/L IBA、㈢光照 1/2MS(Ca2+ 加倍)+2.0mg/L IBA ;㈣黑暗 1/2MS(Ca2+ 加倍)+0.5mg/L IBA、㈤黑暗1/2MS (Ca2+ 加倍)+1.0mg/L IBA、㈥黑暗 1/2MS (Ca2+ 加倍)+2.0mg/LIBA, 30d 后統(tǒng)計增殖倍數(shù)和生長情況。
[0037]2 .結(jié)果與分析
[0038]( I)不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對啟動培養(yǎng)的影響
[0039]結(jié)果如表1所示:
[0040]表1 ‘珊瑚落日’啟動培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基篩選
【權(quán)利要求】
1.一種芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，具體步驟如下: 將經(jīng)滅菌消毒的芍藥莖段先后接種到啟動培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，并將獲得的愈傷組織接種到不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行光照培養(yǎng)或黑暗培養(yǎng)，獲得芍藥組培苗。
2.如權(quán)利要求1所述一種芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述啟動培養(yǎng)基為:以Ca2+濃度加倍的1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有TDZ的濃度為0.5mg/L、2，4_D的濃度為.0.5mg/L、NAA的濃度為0.5mg/L的培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求1所述一種芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:以WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有TDZ的濃度為0.5mg/L、2，4_D的濃度為0.5mg/L的培養(yǎng)基。
4.如權(quán)利要求1所述一種芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述增殖培養(yǎng)基為:以Ca2+濃度加倍的1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有TDZ的濃度為0.lmg/L、NAA的濃度為0.2mg/L的培養(yǎng)基。
5.如權(quán)利要求1所述一種芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述分化培養(yǎng)基為:以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有TDZ的濃度為0.1-0.5mg/L、2，4_D的濃度為0-1.0mg/L、NAA的濃度為0-0.5mg/L的培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求5所述一種芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述分化培養(yǎng)基為:以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有TDZ的濃度為0.5mg/L、NAA的濃度為0.5mg/L的培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求1所述一種芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:以Ca2+濃度加倍的1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有IBA的濃度為1.0mg/L的培養(yǎng)基。
8.如權(quán)利要求1所述一種芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述獲得的愈傷組織接種到不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行光照培養(yǎng)。
9.如權(quán)利要求1所述一種芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，以啟動培養(yǎng)基培養(yǎng)的時間為30天；以誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的時間為30天；以增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)的時間為30天；以分化培養(yǎng)基培養(yǎng)的時間為30天；以不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的時間為30天。
10.權(quán)利要求1-9任一項所述的一種芍藥愈傷組織誘導(dǎo)方法，在芍藥繁育中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01H4/00GK103733995SQ201310714567
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】于曉南, 沈苗苗, 湯正嬌, 張啟翔 申請人:北京林業(yè)大學(xué)