一種可有效降低山葵多倍體植物回復(fù)突變率的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可有效降低山葵多倍體植物回復(fù)突變率的培養(yǎng)方法，該方法采用將山葵種子消毒后，依次用5-氨基尿嘧啶和丙二醇、胺磺靈和戊炔草胺、秋水仙素和富民隆的混合溶液進(jìn)行培養(yǎng)，可使所得到的多倍體種子培育的多倍體幼苗的回復(fù)突變率有效降低，本發(fā)明為山葵優(yōu)良品種的快速培育提供了一條新途徑。
【專利說明】一種可有效降低山葵多倍體植物回復(fù)突變率的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種山葵植物的組織培養(yǎng)方法，特別是涉及一種可有效降低山葵多倍體植物回復(fù)突變率的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]山葵(Wasabi japonica Matsum)又名山箭菜，為十字花科多年生草本半陰生植物。
[0003]山葵植物的繁殖多采用分株繁殖和種子繁殖。分株繁殖不僅存在多代營養(yǎng)繁殖后品種退化嚴(yán)重的問題，而且還存在繁殖系數(shù)低、種苗帶菌嚴(yán)重等問題，極易導(dǎo)致病害大面積發(fā)生。目前山葵資源十分稀少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需求，所以有必要培育出優(yōu)質(zhì)的山葵新品種。多倍體植物具有器官巨大性的特點(diǎn)，并且由于細(xì)胞染色體加倍，染色體上基因調(diào)控有效化學(xué)成分含量也往往較正常二倍體高，因此開展山葵植物多倍體誘導(dǎo)對于提高其產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要的作用。
[0004]從現(xiàn)有多倍體誘導(dǎo)研究中發(fā)現(xiàn)，多倍體誘導(dǎo)過程中易出現(xiàn)嵌合體，嵌合體植物主要是由二倍體和多倍體細(xì)胞組成，由于嵌合體植物隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長，其植物多倍體“巨大性”特征極不穩(wěn)定，常表現(xiàn)出不同程度的回復(fù)突變情況。這主要是由于未加倍的二倍體細(xì)胞分裂速度比誘導(dǎo)后的多倍體細(xì)胞分裂速度快，因此在嵌合體植物生長過程中，二倍體細(xì)胞最終可能會(huì)把多倍體細(xì)胞“淹沒”，從而出現(xiàn)誘導(dǎo)的多倍體植物又回復(fù)變成二倍體，最終導(dǎo)致植物多倍體誘導(dǎo)的失敗。
[0005]針對上述問題，有必要提出一種能有效降低山葵多倍體植物回復(fù)突變率的培養(yǎng)方法，由此引出了本發(fā)明方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種可有效降低山葵多倍體植物回復(fù)突變率的培養(yǎng)方法。
[0007]本發(fā)明提供的可有效降低山葵多倍體植物回復(fù)突變率的培養(yǎng)方法包括如下步驟:
[0008](I)取山葵種子，先用0.01%~0.07%的過氧乙酸消毒10~30min，再用無菌水清洗后，置于3~10°C的條件下保存10~15天；
[0009](2)將經(jīng)低溫保存的山葵種子，放在浸有5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液的濾紙上培養(yǎng)10~24h，培養(yǎng)溫度為5~9°C，所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液由濃度為
0.5~2.5mmol.T的5-氨基尿嘧啶溶液和濃度為0.3~0.7mol.T的丙二醇溶液按體積比 1: (0.95 ~1.05)配制；
[0010](3)將培養(yǎng)后的山葵種子用無菌水清洗后，置于12~18°C的條件下培養(yǎng)5~9h，再轉(zhuǎn)放在浸有胺磺靈和戊炔草胺混合溶液的濾紙上培養(yǎng)3~10h，培養(yǎng)溫度為4~10°C，光照強(qiáng)度為2000~30001x，所述胺磺靈和戊炔草胺混合溶液由濃度為50~IOOumol.T的胺磺靈溶液和濃度為20~50umo`l.T的戊炔草胺溶液按體積比1: (0.95~1.05)配制；[0011](4)將步驟(3)培養(yǎng)的種子用無菌水清洗后，轉(zhuǎn)放在浸有秋水仙素和富民隆混合溶液的濾紙上，在無光照和4~15°C的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，所述秋水仙素和富民隆混合溶液由濃度為0.2~0.8%的秋水仙素溶液和濃度為0.03~0.08%的富民隆溶液按體積比1:(0.95 ~1.05)配制；
[0012](5)將誘導(dǎo)培養(yǎng)2~5天的種子轉(zhuǎn)放在只有無菌水的濾紙上，在溫度為8~18°C、光照強(qiáng)度為25001x~30001x、光照8~12h的條件下使其萌發(fā)生長；
[0013](6)選取已萌發(fā)出胚根的多倍體種子，將其置于育苗盤中進(jìn)行25~35天的多倍體幼苗的培育生長，統(tǒng)計(jì)山葵多倍體幼苗的回復(fù)突變率。
[0014]進(jìn)一步地，步驟(2)中所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液由濃度為0.5~
2.5mmol.l-1的5-氨基尿嘧啶溶液和濃度為0.3~0.7mol.L-1的丙二醇溶液按體積比1:1配制。
[0015]進(jìn)一步地，步驟(3)中所述胺磺靈和戍炔草胺混合溶液由濃度為50~lOOumol.L—1的胺磺靈溶液和濃度為20~50umol.L-1的戊炔草胺溶液按體積比1:1配制。
[0016]進(jìn)一步地，步驟(4)中所述秋水仙素和富民隆混合溶液由濃度為0.2~0.8%的秋水仙素溶液和濃度為0.03~0.08%的富民隆溶液按體積比1:1配制。
[0017]本發(fā)明能有效地降低山葵植物在多倍體誘導(dǎo)中的回復(fù)突變率，可確保誘導(dǎo)的山葵多倍體植物的遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，為山葵優(yōu)良品種的快速培育提供了一條新途徑。
[0018]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1
[0020](I)選取當(dāng)年生飽滿的山葵種子，先用0.01%的過氧乙酸消毒lOmin，再用無菌水清洗2次，然后置于3°C的低溫條件下保存10天；
[0021](2)將經(jīng)低溫保存的山葵種子，放在浸有5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液的濾紙上培養(yǎng)10h，培養(yǎng)溫度為5°C，所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液由濃度為0.5mmol.L-1的5-氨基尿嘧啶溶液和濃度為0.3mol.L-1的丙二醇溶液按體積比1:0.95配制；
[0022](3)將培養(yǎng)后的山葵種子用無菌水清洗2次后，置于12°C的條件下用無菌水進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)5h,再轉(zhuǎn)放在浸有胺磺靈溶液和戍炔草胺混合溶液的濾紙上培養(yǎng)3h,培養(yǎng)溫度為4°C，光照強(qiáng)度為20001x，所述胺磺靈和戊炔草胺混合溶液由濃度為50umol.L-1的胺磺靈溶液和濃度為20umol.L-1的戊炔草胺溶液按體積比1:0.95配制；
[0023](4)將步驟(3)培養(yǎng)的種子用無菌水清洗清洗2次后，轉(zhuǎn)放在浸有秋水仙素和富民隆混合溶液的濾紙上，在無光照和4°C的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)2~5天，所述秋水仙素和富民隆混合溶液由濃度為0.2%的秋水仙素溶液和濃度為0.03%的富民隆溶液按體積比1:0.95配制；
[0024](5)將經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的種子取出，放在只有無菌水的濾紙上萌發(fā)生長，培養(yǎng)條件為:溫度8°C、光照強(qiáng)度25001x、光照8h ；
[0025](6)選取步驟(5)中已萌發(fā)出胚根的多倍體種子，將其播種于育苗盤中，每穴3粒種子，在溫度為20°C、每天光照12h和光照強(qiáng)度為25001x的條件下培養(yǎng)25天，觀察到山葵多倍體幼苗生長健康，統(tǒng)計(jì)山葵多倍體幼苗的回復(fù)突變率為31.54%。[0026]實(shí)施例2
[0027](1)選取當(dāng)年生飽滿的山葵種子，先用0.04%的過氧乙酸消毒20min，再用無菌水清洗3次，然后置于6°C的低溫條件下保存12天；
[0028](2)將經(jīng)低溫保存的山葵種子，放在浸有5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液的濾紙上培養(yǎng)18h，培養(yǎng)溫度為8°C，所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液由濃度為1.5mmol.L—1的5-氨基尿嘧啶溶液和濃度為0.5mol.L_1的丙二醇溶液按體積比1:1配制；
[0029](3)將培養(yǎng)后的山葵種子用無菌水清洗3次后，置于15°C的條件下用無菌水進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)7h,再轉(zhuǎn)放在浸有胺磺靈和戍炔草胺混合溶液的濾紙上培養(yǎng)7h,培養(yǎng)溫度為6°C,光照強(qiáng)度為25001x，所述胺磺靈和戊炔草胺混合溶液由濃度為70umol.L—1的胺磺靈溶液和濃度為40umol.L_1的戊炔草胺溶液按體積比1:1配制；
[0030](4)將步驟(3)培養(yǎng)的種子用無菌水清洗清洗4次后，轉(zhuǎn)放在浸有秋水仙素和富民隆混合溶液的濾紙上，在無光照和8°C的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)4天，所述秋水仙素和富民隆混合溶液由濃度為0.6%的秋水仙素溶液和濃度為0.05%的富民隆溶液按體積比1:1配制；
[0031](5)將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的種子取出，放在只有無菌水的濾紙上萌發(fā)生長，培養(yǎng)條件為:溫度15°C、光照強(qiáng)度28001x、光照IOh ；
[0032](6)選取步驟(5)中已萌發(fā)出胚根的多倍體種子，將其播種于育苗盤中，每穴3粒種子，在溫度為20°C、每天光照12h和光照強(qiáng)度為25001x的條件下培養(yǎng)25天，觀察到山葵多倍體幼苗生長健康， 統(tǒng)計(jì)山葵多倍體幼苗的回復(fù)突變率為15.54%。
[0033]實(shí)施例3
[0034](I)選取當(dāng)年生飽滿的山葵種子，先用0.07%的過氧乙酸消毒30min，再用無菌水清洗5次，然后置于10°C的低溫條件下保存15天；
[0035](2)將經(jīng)低溫保存的山葵種子，放在浸有5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液的濾紙上培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為9°C，所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液由濃度為2.5mmol.L_1的5-氨基尿嘧啶溶液和濃度為0.7mol.L_1的丙二醇溶液按體積比1: 1.05配制；
[0036](3)將培養(yǎng)后的山葵種子用無菌水清洗5次后，置于18°C的條件下用無菌水進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)9h,再轉(zhuǎn)放在浸有胺磺靈和戍炔草胺混合溶液的濾紙上培養(yǎng)IOh,培養(yǎng)溫度為10°C，光照強(qiáng)度為30001x，所述胺磺靈和戊炔草胺混合溶液由濃度為lOOumol.L_1的胺磺靈溶液和濃度為50umol.L_1的戊炔草胺溶液按體積比1: 1.05配制；
[0037](4)將步驟(3)培養(yǎng)的種子用無菌水清洗清洗3次后，轉(zhuǎn)放在浸有秋水仙素和富民隆混合溶液的濾紙上，在無光照和15°C的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)5天，所述秋水仙素和富民隆混合溶液由濃度為0.8%的秋水仙素溶液和濃度為0.08%的富民隆溶液按體積比1: 1.05配制；
[0038](5)將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的種子取出，放在只有無菌水的濾紙上萌發(fā)生長，培養(yǎng)條件為:溫度18°C、光照強(qiáng)度30001x、光照12h ；
[0039](6)選取步驟(5)中已萌發(fā)出胚根的多倍體種子，將其播種于育苗盤中，每穴3粒種子，在溫度為20°C、每天光照12h和光照強(qiáng)度為25001x的條件下培養(yǎng)32天，統(tǒng)計(jì)山葵多倍體幼苗的回復(fù)突變率為12.16%，但觀察發(fā)現(xiàn)山葵多倍體幼苗生長緩慢。
[0040]實(shí)施例4
[0041]將實(shí)施例2步驟(3)中所述胺磺靈溶液的濃度改為50umol.L—1，其它步驟同實(shí)施例2，培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)恢復(fù)突變率為22.43%。
[0042]實(shí)施例6
[0043]將實(shí)施例2步驟(4)中秋水仙素的濃度改為0.3%，富民隆溶液的濃度改為0.04%,其它步驟同實(shí)施例2，培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)恢復(fù)突變率為26.17%。
[0044]比較實(shí)施例1
[0045]取消實(shí)施例2的步驟(2)，其它步驟同實(shí)施例2，培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)回復(fù)突變率為49.15%。
[0046]比較實(shí)施例2[0047]取消實(shí)施例2的步驟(3)，其它步驟同實(shí)施例2，培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)回復(fù)突變率為53.01%。
[0048]比較實(shí)施例3
[0049]在實(shí)施例2步驟(4)中，改為只采用濃度為0.6%的秋水仙素溶液，不用富民隆溶液，其它步驟同實(shí)施例(2)，培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)回復(fù)突變率為40.23%。
[0050]比較實(shí)施例4
[0051]取消實(shí)施例2的步驟(2)和步驟(3)，其它步驟同實(shí)施例2，培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)回復(fù)突變率為 78%ο
【權(quán)利要求】
1.一種可有效降低山葵多倍體植物回復(fù)突變率的培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟: (1)取山葵種子，先用0.01%~0.07%的過氧乙酸消毒10~30min，再用無菌水清洗后，置于3~10°C的條件下保存10~15天； (2)將經(jīng)低溫保存的山葵種子，放在浸有5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液的濾紙上培養(yǎng)10~24h，培養(yǎng)溫度為5~9°C，所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液由濃度為0.5~2.5mmol.L-1的5-氨基尿嘧啶溶液和濃度為0.3~0.7mol.L-1的丙二醇溶液按體積比1:(0.95 ~1.05)配制； (3)將培養(yǎng)后的山葵種子用無菌水清洗后，置于12~18°C的條件下培養(yǎng)5~9h，再轉(zhuǎn)放在浸有胺磺靈和戍炔草胺混合溶液的濾紙上培養(yǎng)3~IOh,培養(yǎng)溫度為4~10°C,光照強(qiáng)度為2000~30001x，所述胺磺靈和戊炔草胺混合溶液由濃度為50~IOOumol.1/1的胺磺靈溶液和濃度為20~50umol.L-1的戊炔草胺溶液按體積比1: (0.95~1.05)配制； (4)將步驟(3)培養(yǎng)的種子用無菌水清洗后，轉(zhuǎn)放在浸有秋水仙素和富民隆混合溶液的濾紙上，在無光照和4~15°C的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，所述秋水仙素和富民隆混合溶液由濃度為0.2~0.8%的秋水仙素溶液和濃度為0.03~0.08%的富民隆溶液按體積比1:(0.95 ~1.05)配制； (5)將誘導(dǎo)培養(yǎng)2~5天的種子轉(zhuǎn)放在只有無菌水的濾紙上，在溫度為8~18°C、光照強(qiáng)度為25001x~30001x、光照8~12h的條件下使其萌發(fā)生長； (6)選取已萌發(fā)出胚根的多倍體種子，將其置于育苗盤中進(jìn)行25~35天的多倍體幼苗的培育生長，統(tǒng)計(jì)山葵多倍體幼苗的回復(fù)突變率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可有效降低山葵多倍體植物回復(fù)突變率的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2)中所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液由濃度為0.5~2.5mmol.L-1的5-氨基尿嘧啶溶液和濃度為0.3~0.7mol.L-1的丙二醇溶液按體積比1:1配制。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可有效降低山葵多倍體植物回復(fù)突變率的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(3)中所述胺磺靈和戊炔草胺混合溶液由濃度為50~lOOumol.L—1的胺磺靈溶液和濃度為20~50umol.L-1的戊炔草胺溶液按體積比1:1配制。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可有效降低山葵多倍體植物回復(fù)突變率的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(4)中所述秋水仙素和富民隆混合溶液由濃度為0.2~0.8%的秋水仙素溶液和濃度為0.03~0.08%的富民隆溶液按體積比1:1配制。
【文檔編號】A01H4/00GK103704137SQ201310722658
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】王躍華, 孫雁霞, 段茂華, 任三軍, 陳傳鳳, 彭雙, 嚴(yán)幸林, 梅英, 徐恩琴, 唐鳳如, 宋超, 劉銀花, 唐川 申請人:成都大學(xué)