一種雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法，包括：1）從健康茁壯的雨城丹桂樹上，選取盛花期時(shí)的新鮮花梗，進(jìn)行消毒處理；2）無菌條件下，將處理后的材料接種于誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基上，溫度25±1℃，全黑暗條件下，培養(yǎng)至分化；其中，誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基為：B5+6-BA2.0~3.0mg/L+2,4-D0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.8g/L，pH5.5；3）將已分化的愈傷組織接種于增殖培養(yǎng)基中，溫度25±1℃，光照時(shí)間為12h/天，光照強(qiáng)度為2500lx，25天繼代增殖一次，即可；其中，增殖培養(yǎng)基為：B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.8g/L，pH5.5。本發(fā)明以花梗為外植體進(jìn)行愈傷組織的分化及增殖培養(yǎng)，先經(jīng)過30天的誘導(dǎo)培養(yǎng)，愈傷組織的分化率較高，達(dá)到90%；然后經(jīng)過25天的繼代增殖培養(yǎng)，愈傷組織的增殖系數(shù)較高，可以達(dá)到1.8，具有很好的實(shí)用性。
【專利說明】一種雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物組培【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]桂花(Osmanthus fragrans Lour.)，亦稱山桂、巖桂、九里香、木犀，木犀科木犀屬的代表種，常綠灌木至小喬木。它不僅是我國的十大傳統(tǒng)名花之一，而且集綠化、美化、香化為一體，屬觀賞和實(shí)用兼具的優(yōu)良園林、經(jīng)濟(jì)樹種，深受我國人民的喜愛。
[0003]雨城丹桂(Osmanthus fragrans iYucheng Dan’)是丹桂品種群中的一個(gè)優(yōu)良品種，常綠大灌木，樹冠卵形， 花期9月中旬，著花繁密花冠斜展，花色橙紅香味中等，觀賞性極佳。此外環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，耐高溫較耐寒，對(duì)土壤的要求不太嚴(yán)格，生長速度快，種植范圍廣，如此之多的優(yōu)點(diǎn)使之在丹桂家族中成為珍貴的品種。
[0004]以往桂花的繁殖多以嫁接為主，扦插、壓條為輔，繁殖系數(shù)?。徊シN繁殖存在生理后熟等原因，不能滿足生產(chǎn)上的需要；而雨城丹桂花冠雌蕊退化，花后不結(jié)實(shí)，采用何種途徑使之快速繁育成為很有價(jià)值的研究方向。組織培養(yǎng)作為新興的生物繁殖技術(shù)，不但繁殖系數(shù)大，還能保持品種的優(yōu)良性狀，同時(shí)也是高等植物細(xì)胞工程、基因工程和改良的重要基礎(chǔ)之一，可以短時(shí)間獲得大量植物材料，從而使雨城丹桂得到快速繁殖與推廣。而目前關(guān)于雨城丹桂組織培養(yǎng)快繁體系研究的內(nèi)容較少，還不能滿足使用需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法，為短時(shí)間內(nèi)獲得大量雨城丹桂小苗提供了科學(xué)的培養(yǎng)基配方，豐富了雨城丹桂這一珍貴的桂花品種的組織培養(yǎng)快繁方法，為以后的相關(guān)研究提供一些借鑒和參考意義。
[0006]技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法，包括以下步驟:
O從健康茁壯的雨城丹桂樹上，選取盛花期時(shí)的新鮮花梗，進(jìn)行消毒處理；
2)無菌條件下，將處理后的材料接種于誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基上，溫度25±1°C，全黑暗條件下，培養(yǎng)至分化；其中，誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基為:Β5+6-ΒΑ2.0-3.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L+蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6.8g/L，ρΗ5.5 ；
3)將已分化的愈傷組織接種于增殖培養(yǎng)基中，溫度25±1°C，光照時(shí)間為12h/天，光照強(qiáng)度為25001x，25天繼代增殖一次，即可；其中，增殖培養(yǎng)基為:B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6.8g/L, pH 5.5。
[0007]步驟I)中，從健康茁壯的雨城丹桂樹上選取盛花期時(shí)的新鮮花梗，先用加入少量去污粉的自來水浸泡I小時(shí)，然后用流水沖洗3小時(shí)；在水平超凈工作臺(tái)的無菌條件下，將沖洗過的花梗在75%的酒精中浸泡30秒后，在2%的次氯酸鈉溶液中浸泡3分鐘，再用無菌水仔細(xì)沖洗5遍。
[0008]步驟2)中，誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基為:B5+6-BA2.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L+ 蔗糖 30g/L+瓊脂 6.8g/L，pH5.5。
[0009]采用誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基B5+6-BA2.0~3.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L,這種激素配比的培養(yǎng)基配方，經(jīng)過30天的培養(yǎng)，愈傷組織的分化率較高,達(dá)到90%，而且整個(gè)花梗變成愈傷組織團(tuán)狀愈傷，淡黃白色顆粒，狀態(tài)較好。
[0010]采用增殖培養(yǎng)基為B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L,這種激素配比的培養(yǎng)基配方，經(jīng)過25天的培養(yǎng)，愈傷組織的增殖系數(shù)較高，可以達(dá)到1.8。
[0011]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比 ，本發(fā)明的雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法，以花梗為外植體進(jìn)行愈傷組織的分化及增殖培養(yǎng)，采用誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基B5+6-BA2.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L進(jìn)行誘導(dǎo)，經(jīng)過30天的培養(yǎng)，愈傷組織的分化率較高，達(dá)到90%，而且整個(gè)花梗變成愈傷組織團(tuán)狀愈傷，淡黃白色顆粒，狀態(tài)較好；采用增殖培養(yǎng)基為B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L進(jìn)行繼代增殖，經(jīng)過25天的培養(yǎng)，愈傷組織的增殖系數(shù)較高，可以達(dá)到1.8，具有很好的實(shí)用性，可為后期的叢生芽誘導(dǎo)和基因改良工作提供大量的實(shí)驗(yàn)材料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是雨城丹桂花梗愈傷組織分化示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0014]實(shí)施例1
本實(shí)施例的雨城丹桂，以幼嫩花梗為外植體的愈傷組織分化及增殖，是先從健康茁壯的雨城丹桂樹上，選取盛花期時(shí)的新鮮花梗，后進(jìn)行消毒處理，然后將其在無菌操作臺(tái)上接種于事先配好的分化培養(yǎng)基上，I個(gè)月后將已分化的愈傷組織接種于繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖。
[0015]I)新鮮外植體的選取與消毒滅菌
從健康茁壯的雨城丹桂樹上選取盛花期時(shí)的新鮮花梗，先用加入少量去污粉的自來水浸泡I小時(shí)，然后用流水沖洗3小時(shí)；在水平超凈工作臺(tái)的無菌條件下，將沖洗過的花梗在75%的酒精中浸泡30秒后，在2%的次氯酸鈉溶液中浸泡3分鐘，再用無菌水仔細(xì)沖洗5遍。
[0016]2)無菌培養(yǎng)基的制備
誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基:Β5+6-ΒΑ2.0-3.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L，pH 調(diào)至 5.5，蔗糖 30g/L，瓊脂 6.8g/L。
[0017]增殖培養(yǎng)基為:B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L, pH 調(diào)至 5.5，蔗糖 30g/L，瓊脂6.8g/L。
[0018]培養(yǎng)基分裝后盡快將培養(yǎng)瓶口密封，并及時(shí)放入高壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行消毒滅菌。滅菌條件為121°C、0.1MPa下滅菌15分鐘，滅好的培養(yǎng)基從高壓鍋中取出后，放入干凈的準(zhǔn)備室中讓其自然冷卻凝固。
[0019]3)接種
將滅菌后的花梗在無菌條件下剪掉兩端成0.5cm左右的小段，接種于誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基上，每瓶接種5個(gè)材料。
[0020]4)培養(yǎng)
將接種后的培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)室進(jìn)行愈傷組織的分化，條件為:溫度25±1°C，全黑暗處理，30天后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率分別為90% (B5+6-BA2.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L)和80%(B5+6-BA3.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L)。其中，該誘導(dǎo)率為成功誘導(dǎo)出愈傷的花梗與花?？偨臃N數(shù)的比值。
[0021]30天后發(fā)現(xiàn)，如圖1所示，整個(gè)花梗變成愈傷組織團(tuán)狀愈傷，淡綠色或淺黃綠色的顆粒，狀態(tài)較好。有些花梗基部和周圍都形成淡綠色或淺黃綠色的顆粒或團(tuán)狀物質(zhì)，經(jīng)鑒別為分化形成的愈傷組織， 這些花梗就是用此分化培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)出愈傷的花梗，
一個(gè)月后將分化良好的愈傷組織轉(zhuǎn)于繼代增殖培養(yǎng)基中，條件為:溫度25土1°C，光照時(shí)間為12h/天，光照強(qiáng)度為25001x，30天后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)達(dá)1.8。其中，增殖系數(shù)的計(jì)算公式為:
增殖系數(shù)=(增殖后愈傷組織重量一增殖前愈傷組織重量)/增殖前愈傷組織重量。
[0022]對(duì)比實(shí)施例1
方法同實(shí)施例1，其中，誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基分別為:MS+6-BA2mg/L+2，4-D0.05mg/L、B5+6-BA1.0mg/L+2, 4_D1.0Omg/L, 30天后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率僅為20%、50%，同發(fā)明中的誘導(dǎo)率達(dá)90%差距較大。
[0023]對(duì)比實(shí)施例2
方法同實(shí)施例1，其中，增殖培養(yǎng)基為B5+6-BA1.0mg/L+NAA0.10mg/L，實(shí)驗(yàn)步驟同本發(fā)明，30天后統(tǒng)計(jì)增值系數(shù)僅為0.9，同發(fā)明中的增值系數(shù)達(dá)1.8差距較大。
[0024]因此，本發(fā)明的結(jié)果為:以幼嫩花梗為外植體接種于誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基:B5+6-BA2.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L中，30天后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率達(dá)90% ;將已分化的愈傷組織接于增殖培養(yǎng)基:B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L中，30天后統(tǒng)計(jì)增值系數(shù)達(dá)1.8。
[0025]以上實(shí)施例中，B5和MS均為基本培養(yǎng)基，其配方參照分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。其中，B5 培養(yǎng)基配方為:150mg/L NaH2PO4.H20、3000mg/L KN03、150mg/L CaCl2.2H20、134mg/L (NH4) 2S04、250mg/L MgSO4.7H20、37.3 mg/L Na2-EDTA,27.8mg/L FeSO4.7H20、lOmg/L MnSO4.7H20、2mg/L ZnSO4.7H20、0.025mg/L CoCl2.6H20、0.75mg/L KI,0.25mg/LNa2Mo0.2H20、3mg/L H3B03、0.025mg/L CuSO4.5H20、10mg/L 維生素 B1、1.0mg/L 維生素 B6、2.0mg/L 甘氨酸、1.0mg/L 煙酸、100.0mg/L 肌醇、30g/L 鹿糖，pH5.5。
【權(quán)利要求】
1.一種雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)從健康茁壯的雨城丹桂樹上，選取盛花期時(shí)的新鮮花梗，進(jìn)行消毒處理； 2)無菌條件下，將處理后的材料接種于誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基上，溫度25±1°C，全黑暗條件下，培養(yǎng)至分化；其中，誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基為:Β5+6-ΒΑ2.0-3.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L+蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6.8g/L，ρΗ5.5 ； 3)將已分化的愈傷組織接種于增殖培養(yǎng)基中，溫度25±1°C，光照時(shí)間為12h/天，光照強(qiáng)度為25001x，25天繼代增殖一次，即可；其中，增殖培養(yǎng)基為:B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6.8g/L, pH 5.5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法，其特征在于:步驟I)中，從健康茁壯的雨城丹桂樹上選取盛花期時(shí)的新鮮花梗，先用加入少量去污粉的自來水浸泡I小時(shí)，然后用流水沖洗3小時(shí)；在水平超凈工作臺(tái)的無菌條件下，將沖洗過的花梗在 75%的酒精中浸泡30秒后,在2%的次氯酸鈉溶液中浸泡3分鐘,再用無菌水仔細(xì)沖洗5遍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法，其特征在于:步驟2)中，誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基為:B5+6-BA2.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6.8g/L，pH5.5。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103733998SQ201310725163
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】王良桂, 楊秀蓮, 王亞莉, 張春霞, 凌敏 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)