一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑及用途
【專利摘要】一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑及用途，屬于植物源農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。其特征在于含有0.5-2.3%喜樹堿提取物干粉，1.2-5.3%無機(jī)堿，82-97%溶劑，0.7-2.1%增效劑，1-5%穩(wěn)定劑。上述一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑及用途，以喜樹堿提取物與無機(jī)堿反應(yīng)后的物質(zhì)為有效組分，同時(shí)添加了一定的增效成分和穩(wěn)定成分，所得制劑參與抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞的分化的過程，從而抑制害蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，而且田間作為農(nóng)藥使用時(shí)可以減少有效成分在環(huán)境中的光解和流失，可持久地發(fā)揮生物活性，起到抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞的分化和田間防治病蟲害的作用；且制造方便，成本低、效果平穩(wěn)、制劑穩(wěn)定且用量少。
【專利說明】一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物源農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑及用途。
【背景技術(shù)】
[0002]喜樹(Camptothecia acuminata Decaisne)為一種古老、優(yōu)秀的殺蟲植物,且是我國特有樹種，速生。一般產(chǎn)于江蘇南部、浙江、福建、江西、湖南、湖北、四川、貴州、廣西、廣東、云南等省區(qū)，在四川西部成都平原和江西東南部均較常見。喜樹的根、莖、葉和種子中共發(fā)現(xiàn)了三十多個(gè)化合物，其中喜樹堿及其他生物堿十余個(gè)，包括喜樹堿、喜樹次堿、羥基喜樹堿、甲基喜樹堿等，其中喜樹堿含量最高，是其中主要的活性物質(zhì)。這些生物堿具抗癌、殺蟲、抑菌多種功效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已充分證實(shí)喜樹堿及其部分衍生物具有顯著的抗癌作用并已將其成功開發(fā)為抗癌藥物。從農(nóng)藥學(xué)的角度來看，喜樹堿作為植物體內(nèi)的一種生物堿，具有可以開發(fā)為殺蟲劑的多種優(yōu)點(diǎn)。
[0003]喜樹堿在結(jié)構(gòu)上屬于一種喹啉類生物堿，其合成來自單萜吲哚生物堿。喜樹堿由五環(huán)駢合而成，分別為喹啉環(huán)，吡咯環(huán)，吡啶酮結(jié)構(gòu)，一個(gè)具有S型手性碳的a —羥基內(nèi)酯。分子式C20H16N204 ;分子量348.34。喜樹堿為淺黃色針狀結(jié)晶(甲醇-乙腈)，分解點(diǎn)264-267?。在紫外燈下表現(xiàn)強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光。和酸不能生成穩(wěn)定的鹽。X-射線研究(碘乙酰)，發(fā)現(xiàn)其唯一的手性C20為S型。喜樹堿不溶于水，除氯仿、甲醇、二甲基亞砜等少數(shù)溶劑外，不溶于一般的有機(jī)溶劑，在濃硫酸中溶解呈黃綠色。喜樹堿的化學(xué)性質(zhì)不同于普通生物堿，與一般生物堿試劑無反應(yīng)，如常用檢測(cè)試劑=Dragendoffs reagent (碘化秘鉀試劑)和苯酚-三氯化鐵，呈陰性；吲哚分析，負(fù)反應(yīng)；不能用重氮甲烷和二甲基硫酸酯進(jìn)行甲基化；室溫下其內(nèi)酯環(huán)經(jīng)稀堿處理，易開環(huán)成水溶性羧酸鹽；酸化則又重新內(nèi)酯化成環(huán)。喜樹堿具有開發(fā)為一種高效、低毒、環(huán)境相容性好的農(nóng)藥品種的潛質(zhì)，張立欽等已將其開發(fā)成一定的農(nóng)藥制劑進(jìn)行推廣，本發(fā)`明研制的一種含喜樹堿提取物能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的農(nóng)藥制劑為喜樹堿致毒機(jī)理方面工作的開展提供了一定的研究基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)外對(duì)喜樹堿的致毒機(jī)理方面仍呈現(xiàn)出大片的空白，我們研究發(fā)現(xiàn)，喜樹堿可通過改變細(xì)胞氧化還原狀態(tài)來引起昆蟲細(xì)胞凋亡，改變生物體內(nèi)極為重要的中間代謝產(chǎn)物苯二酚，從而抑制細(xì)胞分化，導(dǎo)致害蟲生長(zhǎng)發(fā)育障礙。因此，研究喜樹堿的血液毒性和對(duì)害蟲細(xì)胞的分化對(duì)探討喜樹堿藥劑的毒性機(jī)制具有極其重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑及用途的技術(shù)方案，以天然存在的喜樹堿提取物與無機(jī)堿反應(yīng)后的物質(zhì)為有效組分，同時(shí)添加了一定的增效成分和穩(wěn)定成分，所得制劑不僅穩(wěn)定高效，而且可以減少有效成分在環(huán)境中的光解和流失，所得制劑在使用中可以持久地發(fā)揮生物活性，起到抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞的分化作用。[0005]所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑，其特征在于含有重量百分含量的以下物質(zhì):0.2-2.3%的喜樹堿提取物干粉，1.2-5.3%的無機(jī)堿，82-97%的溶劑，
0.7-2.1%的增效劑，1-5%的穩(wěn)定劑；所述的無機(jī)堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、碳酸氫鈉中的一種以上混合物，所述的溶劑為蒸餾水、自來水、甲醇、乙醇中的一種以上混合物，所述的增效劑為有機(jī)硅聚氧乙烯醚、異丙醇、維生素E、丙酮中的一種以上混合物，所述的穩(wěn)定劑為季銨鹽、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸銨、木質(zhì)素磺酸鈉、月桂醇硫酸鈉中的一種以上混合物；
所述的喜樹堿提取物干粉采用以下方法制得:
O將等量喜樹葉、喜樹種子、喜樹堿果實(shí)在通風(fēng)處陰干，用粉碎機(jī)粉碎至200-400目，然后用自來水浸泡10-15小時(shí)，再加熱到50-75°C持續(xù)加熱煎煮25-35min，壓濾進(jìn)行固液分離，分別收集濾液和濾渣，所得濾液稱為A液，備用；
2)將步驟I)中的濾渣回收，再加入適量自來水重復(fù)步驟I)，得濾液，稱為B液，備用；
3)合并兩次濾液，超聲處理3-10min，然后在濾液中加入與濾液等體積的甲醇回流提取2-3次，每次40-70 min，然后20_25°C下靜置10-16小時(shí)，抽濾除去沉淀，在50_55°C下減壓回收甲醇，將提取液在水浴溫度90°C -100°C下，待濃縮液進(jìn)液流速為300-370 mL.mirT1的條件下采用真空薄膜濃縮裝置進(jìn)行閃蒸濃縮至原體積的4-6%，得到喜樹堿的濃縮液，最后將濃縮液在55-70°C條件下繼續(xù)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)薄膜濃縮、真空干燥成干粉，用研缽研細(xì)并通過100-200目篩，即得喜樹堿提取物提取物干粉。
[0006]所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑，其特征在于所述喜樹堿提取物干粉的重量百分含量為0.5-2.0%，優(yōu)選1.0-1.7%。
[0007]所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑，其特征在于所述無機(jī)堿的重量百分含量為1.5-4%，優(yōu)選2-3.5%，更優(yōu)選2.5-3.0%。
[0008]所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑，其特征在于所述溶劑的重量百分含量為85-95%，優(yōu)選89-90%。
[0009]所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑，其特征在于所述增效劑的重量百分含量為0.8-1.9%，優(yōu)選1.0-1.6%。
[0010]所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑，其特征在于所述穩(wěn)定劑的重量百分含量為1.5-4.0%，優(yōu)選2.5-3.0%。
[0011]所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑，其特征在于喜樹堿提取物干粉的制備方法步驟I)中:自來水浸泡時(shí)間為12-13小時(shí)；再加熱到55-70°C，優(yōu)選60-650C ;加熱煎煮時(shí)間為28-30min。
[0012]所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑，其特征在于喜樹堿提取物干粉的制備方法步驟3)中:超聲處理時(shí)間為5-8min，回流提取時(shí)間為50_60min，優(yōu)選55-58min ;靜置12-14小時(shí)；水浴溫度92-95°C下，進(jìn)液流速為320-350 mL.min—1。
[0013]所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑在制備抑制秀麗隱桿線蟲、松材線蟲、蚜蟲、二化螟、煙粉虱、小綠葉蟬生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化、殺蟲致毒機(jī)理研究制劑中的應(yīng)用。
[0014]上述一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑及用途，以天然存在的喜樹堿提取物與無機(jī)堿反應(yīng)后的物質(zhì)為有效組分，同時(shí)添加了一定的增效成分和穩(wěn)定成分，所得制劑參與抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞的分化的過程，從而抑制害蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，而且田間作為農(nóng)藥使用時(shí)可以減少有效成分在環(huán)境中的光解和流失，可持久地發(fā)揮生物活性，起到抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞的分化和田間防治病蟲害的作用；且具有制造方便，成本低廉、效果平穩(wěn)、制劑穩(wěn)定且用量少等優(yōu)點(diǎn)。
[0015]本申請(qǐng)文件中涉及的百分含量除另有說明外，均指重量百分含量。
【具體實(shí)施方式】
[0016]本發(fā)明所述的一種含喜樹堿提取物能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑通過以下具體技術(shù)方案實(shí)施。
[0017]實(shí)施例1
本發(fā)明制劑的制備方法為:將等量喜樹葉、種子、果實(shí)在通風(fēng)處陰干，用粉碎機(jī)粉碎至400目，然后用自來水浸泡13小時(shí)，再加熱到50°C持續(xù)加熱煎煮34min，壓濾進(jìn)行固液分離，分別收集濾液和濾渣，所得濾液稱為A液，再將濾渣回收，加入適量自來水重復(fù)上述步驟，得濾液B，合并兩次濾液，超聲處理7min，然后在濾液中加入與濾液等量的甲醇回流提取2次，每次65min，然后25°C下靜置10小時(shí)，抽濾除去沉淀，在55°C下減壓回收甲醇，將提取液在水浴溫度98°C下，待濃縮液進(jìn)液流速為300 mL.mirT1的條件下采用真空薄膜濃縮裝置進(jìn)行閃蒸濃縮至原體積的5%，得到喜樹堿的濃縮液，最后將濃縮液在68°C條件下繼續(xù)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)薄膜濃縮、真空干燥成干粉，用研缽研細(xì)并通過100目篩，即得喜樹堿提取物提取物干粉。然后向50L攪拌爸內(nèi)投入20kg蒸懼水和26.85kg乙醇,再加入0.25kg喜樹堿提取物干粉，然后慢慢攪拌并投入1.3kg氫氧化鈉，再加入0.2kg有機(jī)硅聚氧乙烯醚和0.3kg丙酮，攪拌均勻，再加入0.6kg季銨鹽、0.4kg脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸銨和0.1kg木質(zhì)素磺酸鈉，攪拌至所有物質(zhì)溶解，即成最終制劑。
[0018]實(shí)施例2
本發(fā)明制劑的制備方法為:將等量喜`樹葉、種子、果實(shí)在通風(fēng)處陰干，用粉碎機(jī)粉碎至200目，然后用自來水浸泡12小時(shí)，再加熱到75°C持續(xù)加熱煎煮32min，壓濾進(jìn)行固液分離，分別收集濾液和濾渣，所得濾液稱為A液，再將濾渣回收，加入適量自來水重復(fù)上述步驟，得濾液B，合并兩次濾液，超聲處理6min，然后在濾液中加入與濾液等量的甲醇回流提取3次，每次55 min，然后25°C下靜置16小時(shí)，抽濾除去沉淀，在55°C下減壓回收甲醇，將提取液在水浴溫度97°C下，待濃縮液進(jìn)液流速為370 mL ^mirT1的條件下采用真空薄膜濃縮裝置進(jìn)行閃蒸濃縮至原體積的5%，得到喜樹堿的濃縮液，最后將濃縮液在65°C條件下繼續(xù)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)薄膜濃縮、真空干燥成干粉，用研缽研細(xì)并通過200目篩，即得喜樹堿提取物提取物干粉。然后向50L攪拌釜內(nèi)投入22.6kg蒸餾水和22kg自來水，再加入0.85kg喜樹堿提取物干粉，然后慢慢攪拌并投入0.5kg氫氧化鈉、0.5kg氫氧化鉀、0.4kg氫氧化鈣和0.65kg碳酸氫鈉，再加入0.3kg異丙醇和0.5kg丙酮,攪拌均勻,再加入1.7kg月桂醇硫酸鈉,攪拌至所有物質(zhì)溶解，即成最終制劑。
[0019]實(shí)施例3
本發(fā)明制劑的制備方法為:將等量喜樹葉、種子、果實(shí)在通風(fēng)處陰干，用粉碎機(jī)粉碎至250目，然后用自來水浸泡11小時(shí)，再加熱到55°C持續(xù)加熱煎煮30min，壓濾進(jìn)行固液分離，分別收集濾液和濾渣，所得濾液稱為A液，再將濾渣回收，加入適量自來水重復(fù)上述步驟，得濾液B，合并兩次濾液，超聲處理5min，然后在濾液中加入與濾液等量的甲醇回流提取3次，每次60 min，然后25°C下靜置12小時(shí)，抽濾除去沉淀，在55°C下減壓回收甲醇，將提取液在水浴溫度95°C下，待濃縮液進(jìn)液流速為310 mL.min—1的條件下采用真空薄膜濃縮裝置進(jìn)行閃蒸濃縮至原體積的5%，得到喜樹堿的濃縮液，最后將濃縮液在62°C條件下繼續(xù)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)薄膜濃縮、真空干燥成干粉，用研缽研細(xì)并通過150目篩，即得喜樹堿提取物提取物干粉。然后向50L攪拌爸內(nèi)投入30kg甲醇和16.55kg乙醇,再加入0.3kg喜樹堿提取物干粉，然后慢慢攪拌并投入Ikg氫氧化鉀和0.4kg氫氧化鈣，再加入0.25kg有機(jī)硅聚氧乙烯醚和0.3kg異丙醇,攪拌均勻,再加入0.6kg木質(zhì)素磺酸鈉和0.6kg月桂醇硫酸鈉,攪拌至所有物質(zhì)溶解，即成最終制劑。
[0020]實(shí)施例4
本發(fā)明制劑的制備方法為:將等量喜樹葉、種子、果實(shí)在通風(fēng)處陰干，用粉碎機(jī)粉碎至300目，然后用自來水浸泡14小時(shí)，再加熱到65°C持續(xù)加熱煎煮28min，壓濾進(jìn)行固液分離，分別收集濾液和濾渣，所得濾液稱為A液，再將濾渣回收，加入適量自來水重復(fù)上述步驟，得濾液B，合并兩次濾液，超聲處理8min，然后在濾液中加入與濾液等量的甲醇回流提取2次，每次50 min，然后25°C下靜置14小時(shí)，抽濾除去沉淀，在55°C下減壓回收甲醇，將提取液在水浴溫度92°C下，待濃縮液進(jìn)液流速為340 mL.mirT1的條件下采用真空薄膜濃縮裝置進(jìn)行閃蒸濃縮至原體積的5%，得到喜樹堿的濃縮液，最后將濃縮液在60°C條件下繼續(xù)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)薄膜濃縮、真空干燥成干粉，用研缽研細(xì)并通過200目篩，即得喜樹堿提取物提取物干粉。然后向50L攪拌釜內(nèi)投入46.05kg自來水，再加入0.4kg喜樹堿提取物干粉，然后慢慢攪拌并投入1.55kg氫氧化鉀,再加入0.2kg有機(jī)娃聚氧乙烯醚、0.2kg異丙醇和0.2kg維生素E，攪拌均勻，再加入0.4kg脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸銨、0.5kg木質(zhì)素磺酸鈉和0.5kg月桂醇硫酸鈉，攪拌至所有物質(zhì)溶解，即成最終制劑。
[0021]實(shí)施例5
本發(fā)明制劑的制備方法為:將等量喜樹葉、種子、果實(shí)在通風(fēng)處陰干，用粉碎機(jī)粉碎至350目，然后用自來水浸泡15小時(shí)，再加熱到60°C持續(xù)加熱煎煮35min，壓濾進(jìn)行固液分離，分別收集濾液和濾渣，所得濾液稱為A液，再將濾渣回收，加入適量自來水重復(fù)上述步驟，得濾液B，合并兩次濾液，超聲處理lOmin，然后在濾液中加入與濾液等量的甲醇回流提取2次，每次70 min，然后25°C下靜置15小時(shí)，抽濾除去沉淀，在55°C下減壓回收甲醇，將提取液在水浴溫度100°C下，待濃縮液進(jìn)液流速為350 mL.min-1的條件下采用真空薄膜濃縮裝置進(jìn)行閃蒸濃縮至原體積的5%，得到喜樹堿的濃縮液，最后將濃縮液在70°C條件下繼續(xù)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)薄膜濃縮、真空干燥成干粉，用研缽研細(xì)并通過100目篩，即得喜樹堿提取物提取物干粉。然后向50L攪拌釜內(nèi)投入45.55kg甲醇，再加入0.6kg喜樹堿提取物干粉，然后慢慢攪拌并投入0.9kg氫氧化韓和0.8kg碳酸氫鈉,再加入0.65kg有機(jī)娃聚氧乙烯醚,攪拌均勻，再加入0.9kg季銨鹽和0.6kg月桂醇硫酸鈉，攪拌至所有物質(zhì)溶解，即成最終制劑。
[0022]實(shí)施例6
本發(fā)明制劑的制備方法為:將等量喜樹葉、種子、果實(shí)在通風(fēng)處陰干，用粉碎機(jī)粉碎至380目，然后用自來水浸泡10小時(shí)，再加熱到70°C持續(xù)加熱煎煮25min，壓濾進(jìn)行固液分離，分別收集濾液和濾渣，所得濾液稱為A液，再將濾渣回收，加入適量自來水重復(fù)上述步驟，得濾液B，合并兩次濾液，超聲處理3min，然后在濾液中加入與濾液等量的甲醇回流提取3次，每次40 min，然后25°C下靜置11小時(shí)，抽濾除去沉淀，在55°C下減壓回收甲醇，將提取液在水浴溫度90°C下，待濃縮液進(jìn)液流速為360 mL.mirT1的條件下采用真空薄膜濃縮裝置進(jìn)行閃蒸濃縮至原體積的5%，得到喜樹堿的濃縮液，最后將濃縮液在55°C條件下繼續(xù)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)薄膜濃縮、真空干燥成干粉，用研缽研細(xì)并通過200目篩，即得喜樹堿提取物提取物干粉。然后向50L攪拌爸內(nèi)投入24.97kg自來水和20kg甲醇,再加入0.8kg喜樹堿提取物干粉，然后慢慢攪拌并投入0.9kg氫氧化鈉和1.0kg碳酸氫鈉，再加入0.33kg維生素E和
0.4kg丙酮,攪拌均勻,再加入0.6kg季銨鹽、0.3kg脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸銨、0.3kg木質(zhì)素磺酸鈉和0.4kg月桂醇硫酸鈉，攪拌至所有物質(zhì)溶解，即成最終制劑。
[0023]為進(jìn)一步說明本發(fā)明的有益試驗(yàn)結(jié)果，下面通過對(duì)上述方法制備的喜樹堿提取物干粉及制劑進(jìn)行效果測(cè)定來說明本發(fā)明的有益結(jié)果。
[0024]具體試驗(yàn):喜樹堿提取物農(nóng)藥制劑對(duì)生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化活性的檢測(cè)
試驗(yàn)所用蚜蟲細(xì)胞來源于浙江農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)研究所,青菜上自行培養(yǎng)的菜蚜,喜樹堿提取物干粉干粉浙江農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)研究所按權(quán)利要求自行提取，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0025]蚜蟲內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng):在無菌條件下，取蚜蟲研磨液5mL，加入15%的胎牛血清，15 μ g/mL內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充因子的M199培養(yǎng)基充分混勻制成細(xì)胞懸浮液，置于25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)后用0.3%的蛋白酶消化傳代，取生長(zhǎng)良好的3-5代內(nèi)皮細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。通過免疫熒光檢測(cè)和鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。然后置于離心管，以Ficoll淋巴細(xì)胞分離液梯度離心，挑取界面的云霧狀白膜層即為單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞。將單個(gè)細(xì)胞以lX86/mL細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶，置25°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。72 h后去除未貼壁的細(xì)胞懸液，每天換液I次，7天后待貼壁細(xì)胞達(dá)85%以上融合時(shí)，用0.1%的蛋白酶消化，2X 103/cm2的細(xì)胞密度傳代；每3天傳代I次。顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
`[0026]細(xì)胞分組及染毒試驗(yàn):試驗(yàn)細(xì)胞分為1-8組:實(shí)施例1-6組、第7組溶劑對(duì)照組，第8組正常清水對(duì)照組。分別用藥劑處理1-7天后收集各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞。用臺(tái)盼藍(lán)試劑檢測(cè)細(xì)胞的活性，取含有I X 86個(gè)活細(xì)胞的5μ I細(xì)胞懸液，放入37°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10h，離心后丟棄上清液，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組加入10μ I 二甲基亞砜，震蕩25-30 min，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為254 nm處測(cè)量吸光光度值。吸光光度值越大表示細(xì)胞分化程度越大。同時(shí)，按1: 100無血清MDM培養(yǎng)基稀釋，使其終濃度為2 μ mol/L。收集各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，用無血清MDM培養(yǎng)基清洗，將細(xì)胞懸浮于已稀釋的藥劑中，25°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)48 min，每6 min搖動(dòng)一次，取出后用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)。使用365 nm激發(fā)波長(zhǎng)，430 nm發(fā)射波長(zhǎng)。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中喜樹堿的熒光強(qiáng)度，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，以CellQuestTM軟件分析平均熒光強(qiáng)度。重復(fù)測(cè)量采用方差分析。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X土s)表示。
[0027]試驗(yàn)結(jié)果如下:
培養(yǎng)3-4天后，顯微鏡下即可見有稀疏分布的單個(gè)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞以分散，集落方式增殖。培養(yǎng)第6天，見細(xì)胞擴(kuò)大直至鋪滿培養(yǎng)瓶底面。其中傳代培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過1-2天的適應(yīng)期，第3天起細(xì)胞大量增加，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第7天達(dá)到頂峰，以后進(jìn)入穩(wěn)定期。未染毒前可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁呈現(xiàn)多邊形，生長(zhǎng)匯合后細(xì)胞呈典型的鵝卵石狀，符合內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)特征。細(xì)胞染毒后光學(xué)顯微鏡下觀察到，第I天，細(xì)胞形態(tài)無明顯改變；第2-4天，胞體回縮，增殖受抑制；第5-7天，細(xì)胞形態(tài)迅速改變，生長(zhǎng)發(fā)育明顯被抑制。熒光檢測(cè)顯示培養(yǎng)的胞漿呈紅色熒光，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光的亮度有所增加。
[0028]表1實(shí)施例1-6對(duì)蚜蟲內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖的抑制作用
【權(quán)利要求】
1.一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑，其特征在于含有重量百分含量的以下物質(zhì):0.2-2.3%的喜樹堿提取物干粉，1.2-5.3%的無機(jī)堿，82-97%的溶劑，0.7-2.1%的增效劑，1-5%的穩(wěn)定劑；所述的無機(jī)堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、碳酸氫鈉中的一種以上混合物，所述的溶劑為蒸餾水、自來水、甲醇、乙醇中的一種以上混合物，所述的增效劑為有機(jī)硅聚氧乙烯醚、異丙醇、維生素E、丙酮中的一種以上混合物，所述的穩(wěn)定劑為季銨鹽、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸銨、木質(zhì)素磺酸鈉、月桂醇硫酸鈉中的一種以上混合物； 所述的喜樹堿提取物干粉采用以下方法制得: 1)將等量喜樹葉、喜樹種子、喜樹堿果實(shí)在通風(fēng)處陰干，用粉碎機(jī)粉碎至200-400目，然后用自來水浸泡10-15小時(shí)，再加熱到50-75°C持續(xù)加熱煎煮25-35min，壓濾進(jìn)行固液分離，分別收集濾液和濾渣，所得濾液稱為A液，備用； 2)將步驟I)中的濾渣回收，再加入適量自來水重復(fù)步驟I)，得濾液，稱為B液，備用； 3)合并兩次濾液，超聲處理3-10min，然后在濾液中加入與濾液等體積的甲醇回流提取2-3次，每次40-70 min，然后20_25°C下靜置10-16小時(shí)，抽濾除去沉淀，在50_55°C下減壓回收甲醇，將提取液在水浴溫度90°C -100°C下，待濃縮液進(jìn)液流速為300-370 mL.mirT1的條件下采用真空薄膜濃縮裝置進(jìn)行閃蒸濃縮至原體積的4-6%，得到喜樹堿的濃縮液，最后將濃縮液在55-70°C條件下繼續(xù)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)薄膜濃縮、真空干燥成干粉，用研缽研細(xì)并通過100-200目篩，即得喜樹堿提取物提取物干粉。
2.如權(quán)利要求1所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑，其特征在于所述喜樹堿提取物干粉的重量百分含量為0.5-2.0%，優(yōu)選1.0-1.7%。
3.如權(quán)利要求1所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑，其特征在于所述無機(jī)堿的重量百分含量為1.5-4%，優(yōu)選2-3.5%，更優(yōu)選2.5-3.0%。
4.如權(quán)利要求1所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑，其特征在于所述溶劑的重量百分含量為85-95%，優(yōu)選89-90%。
5.如權(quán)利要求1所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑，其特征在于所述增效劑的重量百分含量為0.8-1.9%，優(yōu)選1.0-1.6%。
6.如權(quán)利要求1所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑，其特征在于所述穩(wěn)定劑的重量百分含量為1.5-4.0%，優(yōu)選2.5-3.0%。
7.如權(quán)利要求1所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑，其特征在于喜樹堿提取物干粉的制備方法步驟I)中:自來水浸泡時(shí)間為12-13小時(shí)；再加熱到55-70°C，優(yōu)選60-65°C ;加熱煎煮時(shí)間為28-30min。
8.如權(quán)利要求1所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑，其特征在于喜樹堿提取物干粉的制備方法步驟3)中:超聲處理時(shí)間為5-8min，回流提取時(shí)間為50-60min,優(yōu)選55_58min ;靜置12-14小時(shí)；水浴溫度92-95 °C下，進(jìn)液流速為320-350mL.mirT1。
9.如權(quán)利要求1所述的一種能抑制生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化的喜樹堿制劑在制備抑制秀麗隱桿線蟲、松材線蟲、蚜蟲、二化螟、煙粉虱、小綠葉蟬生物體內(nèi)皮細(xì)胞分化、殺蟲致毒機(jī)理研究制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01P5/00GK103688957SQ201310725874
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】張立欽, 童森淼, 陳安良, 胡加付, 馬建義, 王勇軍, 毛勝鳳, 劉洪波, 張紹勇 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué)