影響雄性生育力的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種影響雄性生育力的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，影響雄性生育力的蛋白質(zhì)包括：（a）具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或（b）在（a）中的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有影響雄性生育力的活性的由（a）衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明影響雄性生育力的蛋白質(zhì)OsAmylase為首次分離自水稻品種日本晴的α-淀粉酶，并且能夠降解花粉粒中的淀粉，造成水稻轉(zhuǎn)基因花粉不育，準確性高，有效阻止轉(zhuǎn)基因作物通過花粉將轉(zhuǎn)基因元件傳播給其他野生作物品種；可用于保持雄性不育植株的純合隱性狀態(tài)；同時省去了雜交制種過程中去雄的步驟，減小了勞動力的投入和對產(chǎn)量的影響，具有較大的成本效益。
【專利說明】影響雄性生育力的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種影響雄性生育力的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，特別是涉及一種來自水稻的、通過提前降解淀粉以影響植物雄性生育力的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途。
【背景技術】
[0002]植物雜交育種技術的發(fā)展使得作物的品質(zhì)和數(shù)量均有相當程度的提高。由于雜交技術的應用，使得產(chǎn)量增加和預期特征(例如疾病抗性、昆蟲抗性、耐熱性、耐旱性以及植物組成的變化)的各種組合都成為可能。通常情況下，雜交技術的應用依賴于向母本提供花粉的父本，由此獲得雜交種。
[0003]長期以來，在水稻育種工作和生產(chǎn)上使用的雄性不育系主要通過常規(guī)育種的方法篩選獲得，或者將不育性狀從一個品種通過回交的方法引入另一品種中，這種方法周期長、見效慢，難以滿足生產(chǎn)發(fā)展的迫切需求；同時雄性不育系的資源非常有限，嚴重制約水稻制備和生產(chǎn)雜交種。
[0004]如果植物已空間隔離雄性和雌性的花或者分離雄性和雌性植株，則可以適用雜交種植物生產(chǎn)的機械方法。例如，在玉米植株的頂端花序中具有生產(chǎn)花粉的雄花，雌花在沿著莖的葉軸部。玉米的異交是通過對母本機械去雄以防止自交來確保的。盡管目前去雄被用于植物的雜交種種子生產(chǎn)中，如玉米,但是依據(jù)母本去雄的實際去雄成本和產(chǎn)量損失,上述過程是勞動密集型的且是昂貴的。另外，大部分作物植物的功能性雄性和雌性器官均在同一朵花中，例如，水稻是不嚴格的自花傳粉，約有3%-5%的異花傳粉，且水稻的花粉相當細小，會隨風力、稻的搖擺落到隔壁雌蕊柱頭上，因此去雄不是一個簡單的過程。盡管可以在散粉前用手除去花粉形成器官，但上述雜交種生產(chǎn)的方法是極端勞動密集型的和昂貴的。
[0005]生產(chǎn)雜交植物的化學方法包括使用化學藥品殺死或阻止可育花粉的形成。這些化學藥品被稱為殺配子劑，被用于給予暫時的雄性不育。由于化學藥品的費用和有效性、以及應用的持續(xù)時長和可靠性，使用殺配子劑進行的雜交植物的商業(yè)化生產(chǎn)是受限制的。殺配子劑的一個嚴重的局限性在于其具有植物毒性的影響，其嚴重程度取決于基因型。其它局限性包括這些化學藥品對于延長花期中的作物不一定是有效的，因為生長的新花可能沒有被影響。因此，需要重復應用上述化學藥品。
[0006]此外，近年來隨著轉(zhuǎn)基因植物種類和種植面積的快速增加，轉(zhuǎn)基因生物的大規(guī)模環(huán)境釋放以及可能帶來的環(huán)境生物安全問題已經(jīng)日益成為當前倍受關注的話題之一。而轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因可能通過天然雜交的方式整合到環(huán)境中的非轉(zhuǎn)基因品種或其野生近緣種中，從而帶來環(huán)境生物安全問題。在雜交親和的植物種類之間，花粉介導的基因漂移是不可避免的。
[0007]上世紀九十年代，Mariani等人開創(chuàng)了人工制備雄性不育系的新途徑，他們利用來自煙草的花藥絨氈層的特異啟動子(TA29)和核糖核酸酶基因(Barnase)構建表達盒轉(zhuǎn)化煙草和油菜，導致轉(zhuǎn)基因植株的花藥絨氈層被破壞，形成雄性不育系，而并未影響轉(zhuǎn)基因植株的其它性狀。除利用Barnase構建雄性不育系之外，當前很多研究表明其它的功能基因也可被廣泛應用于基因工程方法來構建轉(zhuǎn)基因雄性不育植株。
[0008]在花粉發(fā)育后期，淀粉的積累為后續(xù)的花粉萌發(fā)和花粉管的延伸儲備能量，當花粉粒中的淀粉提前被α-淀粉酶降解能夠使花粉粒能量來源崩潰，從而花粉發(fā)育被遏制，導致植物雄性育性喪失。已有報道將玉米α-淀粉酶基因與雄性組織優(yōu)先型啟動子重組，使轉(zhuǎn)基因玉米植株通過表達α-淀粉酶，出現(xiàn)了不同程度的雄性不育現(xiàn)象。為了利用上述技術獲得新的雄性不育株系，從而降低花粉介導的基因漂移的風險，需要不同來源的α -淀粉酶基因，例如水稻，而至今未發(fā)現(xiàn)有水稻的相關報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明的目的是提供一種影響雄性生育力的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，即新的來自水稻的α-淀粉酶基因，以獲得新的雄性不育株系，從而降低花粉介導的基因漂移的風險。
[0010]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種影響雄性生育力的蛋白質(zhì)，包括:
[0011](a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或
[0012](b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有影響雄性生育力的活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或
[0013](c)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
[0014]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種影響雄性生育力的基因，包括:
[0015](a)編碼所述影響雄性生育力的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或
[0016](b)在嚴格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有影響雄性生育力的活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或
[0017](C)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0018]所述嚴格條件可為在6 X SSC (檸檬酸鈉)、0.5%SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS和I X SSC,0.1%SDS各洗膜I次。
[0019]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種表達盒，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的所述影響雄性生育力的基因。
[0020]進一步地，所述調(diào)控序列為雄性配子優(yōu)先型啟動子。
[0021]優(yōu)選地，所述雄性配子優(yōu)先型啟動子為PG47或ZM13。
[0022]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述影響雄性生育力的基因或所述表達盒的DNA構建體。
[0023]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述DNA構建體的重組載體。
[0024]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種降解植物花粉中淀粉的方法，包括通過表達所述影響雄性生育力的基因或所述表達盒以降解植物花粉中的淀粉。
[0025]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種擾亂植物花粉發(fā)育的方法，包括利用所述降解植物花粉中淀粉的方法以擾亂花粉形成。
[0026]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種誘導植物雄性不育的方法，包括利用所述擾亂植物花粉發(fā)育的方法以產(chǎn)生部分雄性不育植物。
[0027]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種影響植物雄性生育力的方法，包括利用所述誘導植物雄性不育的方法以產(chǎn)生部分雄性不育植物。[0028]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種降低花粉中外源基因擴散的方法，包括將所述表達盒引入植物細胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株。
[0029]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于保持雄性不育植株的純合隱性狀態(tài)的方法，包含:
[0030](a)提供第一植株，所述第一植株包含雄性不育基因的純合隱性等位基因，且所述第一植株是雄性不育的；
[0031](b)向第二植株中引入所述DNA構建體，所述第二植株包含與所述第一植株包含的雄性不育基因的純合隱性等位基因相同的雄性不育基因的純合隱性等位基因；所述構建體為半合狀態(tài)；在所述構建體中還包括育性恢復基因，當所述育性恢復基因在所述第二植株中表達時將恢復其雄性生育力；
[0032](c)用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以產(chǎn)生保持所述第一植株純合隱性狀態(tài)的后代。
[0033]優(yōu)選地，所述育性恢復基因為Ms26基因、Ms45基因、DPW基因、Ms3基因或Ms22基因。 [0034]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于從具有雌性配子和雄性配子的植株產(chǎn)生種子的方法，包含:
[0035]Ca)向包含雄性不育基因的純合隱性等位基因的第三植株引入所述DNA構建體，所述第三植株是雄性不育的；在所述構建體中還包括育性恢復基因，當所述育性恢復基因在所述第三植株中表達時將恢復其雄性生育力；
[0036](b)使所述第三植株自體受精；
[0037](c)產(chǎn)生含有所述構建體的種子。
[0038]優(yōu)選地，所述育性恢復基因為Ms26基因、Ms45基因、DPW基因、Ms3基因或Ms22基因。
[0039]本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。
[0040]本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細胞中編碼蛋白質(zhì)或多肽。本領域技術人員很容易認識到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。
[0041]本領域技術人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補，反之亦然。由于DNA在植物中復制產(chǎn)生了 DNA的其它互補鏈。這樣，本發(fā)明包括對序列表中示例的多核苷酸及其互補鏈的使用。本領域常使用的“編碼鏈”指與反義鏈結合的鏈。為了在體內(nèi)表達蛋白質(zhì)，典型將DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄為一條mRNA的互補鏈，它作為模板翻譯出蛋白質(zhì)。mRNA實際上是從DNA的“反義”鏈轉(zhuǎn)錄的?！坝辛x”或“編碼”鏈有一系列密碼子(密碼子是三個核苷酸，一次讀三個可以產(chǎn)生特定氨基酸)，其可作為開放閱讀框(ORF)閱讀來形成目的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還包括與示例的DNA有相當功能的RNA和PNA (肽核酸)。
[0042]本發(fā)明中核酸分子或其片段在嚴格條件下與本發(fā)明影響雄性生育力的基因雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴增方法都可以用于鑒定本發(fā)明影響雄性生育力的基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進行特異性雜交。本發(fā)明中，如果兩個核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結構，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進行特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全的互補性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分子的“互補物”。本發(fā)明中，當一個核酸分子的每一個核苷酸都與另一個核酸分子的對應核苷酸互補時，則稱這兩個核酸分子顯示出“完全互補性”。如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在至少常規(guī)的“低度嚴格”條件下退火且彼此結合，則稱這兩個核酸分子為“最低程度互補”。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在常規(guī)的“高度嚴格”條件下退火且彼此結合，則稱這兩個核酸分子具有“互補性”。從完全互補性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個分子形成雙鏈結構。為了使一個核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結構。
[0043]本發(fā)明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補鏈發(fā)生特異性雜交。促進DNA雜交的適合的嚴格條件，例如，大約在45°C條件下用6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50°C條件下用2.0XSSC洗滌，這些條件對本領域技術人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴格條件的約2.0父55(:、501:到高度嚴格條件的約0.2\55(:、501:。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴格條件的室溫約22°C，升高到高度嚴格條件的約65°C。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個保持不變而另一個變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本發(fā)明所述嚴格條件可為在6XSSC、0.5%SDS溶液中，在65°C下與SEQ ID NO:1發(fā)生特異性雜交，然后用 2XSSC、0.1%SDS 和 I X SSC,0.1%SDS 各洗膜 I 次。
[0044]因此，具有影響植物雄性生育力活性并在嚴格條件下與本發(fā)明序列I雜交的序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40%-50%同源，大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多同源。即序列同一性的范圍分布在至少大約40%-50%、大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同源性。
[0045]本發(fā)明中所述的基因和蛋白質(zhì)不但包括特定的示例序列，還包括保存了所述特定示例的蛋白質(zhì)的影響雄性生育力的活性特征的部分和/片段(包括與全長蛋白質(zhì)相比在內(nèi)和/或末端缺失)、變體、突變體、取代物(有替代氨基酸的蛋白質(zhì))、嵌合體和融合蛋白。所述“變體”或“變異”是指編碼同一蛋白或編碼有影響雄性生育力的活性的等價蛋白的核苷酸序列。所述“等價蛋白”是指與權利要求的蛋白具有相同或基本相同的影響植物雄性生育力的生物活性的蛋白。
[0046]本發(fā)明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達的序列)，包括臨近片段和與全長分子相比內(nèi)部和/或末端的缺失，前述序列的長度可存在變化，但長度足以確保(編碼)蛋白質(zhì)為α-淀粉酶。在一些情況下(特別是植物中的表達)，使用編碼截短蛋白質(zhì)的截短基因可能是有利的。優(yōu)選的截短基因一般編碼全長蛋白質(zhì)的40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99%。
[0047]由于遺傳密碼子的豐余性，多種不同的DNA序列可以編碼相同的氨基酸序列。產(chǎn)生這些編碼相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本領域技術人員的技術水平內(nèi)。這些不同的DNA序列包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但實質(zhì)上不影響調(diào)控雄性生育力的活性的序列，亦包括保留影響雄性生育力的活性的片段。
[0048]本發(fā)明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領域的常規(guī)技術，優(yōu)選這種氨基酸變化為:小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常約1-30個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個殘基長。
[0049]保守取代的實例是在下列氨基酸組內(nèi)發(fā)生的取代:堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些氨基酸取代在本領域內(nèi)是眾所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hi 11在1979年紐約學術出版社(Academic Press)出版的《Protein》中進行了描述。最常見的互換有Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 和 Asp/Gly,以及它們相反的互換。
[0050]對于本領域的技術人員而言顯而易見地，這種取代可以在對分子功能起重要作用的區(qū)域之外發(fā)生，而且仍產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的多肽，其活性必需的并因此選擇不被取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領域已知的方法，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變進行鑒定(如參見，Cunningham 和 Wells，1989，Science244:1081-1085)。后一技術是在分子中每一個帶正電荷的殘基處引入突變，檢測所得突變分子的影響雄性生育力活性，從而確定對該分子活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點也可以通過其三維結構的分析來測定，這種三維結構可由核 磁共振分析、結晶學或光親和標記等技術測定(參見，如de Vos 等，1992，Science255:306-312 ;Smith 等，1992，J.Mol.Biol224:899-904 ；fflodaver等，1992，F(xiàn)EBS Letters309:59-64)0
[0051]因此，與序列2所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列類似性/相同性典型的大于60%，優(yōu)選的大于75%，更優(yōu)選的大于80%，甚至更優(yōu)選的大于90%，并且可以大于95%。也可以根據(jù)更特定的相同性和/或類似性范圍定義本發(fā)明的優(yōu)選的多核苷酸和蛋白質(zhì)。例如與本發(fā)明示例的序列有49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的相同性和 / 或類似性。
[0052]本發(fā)明中，所述核苷酸序列在花粉發(fā)育期大部分表達于花藥中，這種核苷酸序列可被認定為“花藥特異性”。
[0053]本發(fā)明花藥組織是指植物中雄性生殖器官的組織，它完全發(fā)育或局部發(fā)育，包括構成花藥的所有結構，如表皮、藥室內(nèi)壁、胞間層和絨氈層。
[0054]在谷物種子最初的發(fā)芽期，糊粉層細胞將合成本發(fā)明所述α-淀粉酶(a -Amylase)，其參與水解淀粉形成葡萄糖和麥芽糖的過程，由此為后續(xù)的花粉萌發(fā)和花粉管的延伸儲備能量。在花粉發(fā)育后期，當花粉粒中的淀粉提前被α-淀粉酶降解能夠使花粉粒能量來源崩潰，從而花粉發(fā)育被遏制，導致植物雄性育性喪失。
[0055]本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動子、轉(zhuǎn)運肽、終止子，增強子，前導序列，內(nèi)含子以及其它可操作地連接到所述影響雄性生育力的基因的調(diào)節(jié)序列。
[0056]本發(fā)明的啟動子可以從其5’非翻譯區(qū)域(5’ UTR)的天然編碼區(qū)域的5’區(qū)來分離。類似地，終止子可以從側翼于其各終止密碼子的3’區(qū)來分離。
[0057]本領域技術人員可以很容易地鑒定出啟動子區(qū)域。鑒定出含有ATG基元的推定起始密碼子，該起始密碼子的上游就是推定的啟動子?！皢幼印笔且欢蜠NA調(diào)控區(qū)域，其通常包含能知道RNA聚合酶II在對于特定編碼序列的合適轉(zhuǎn)錄起始位點起始RNA合成的TATA盒。啟動子可以額外包含其它識別序列，這些序列通常位于TATA盒的上游或5’端，它們被稱為上游啟動子元件，影響轉(zhuǎn)錄起始速率，例如作用于編碼序列的組織表達和時間表達的那些元件、增強子等。以相同的方式，可以鑒定、分離出使得能在目標組織(例如雄性組織)中進行表達的啟動子元件，將其與其它核心啟動子一起使用，以驗證雄性組織優(yōu)先的表達。核心啟動子是指起始轉(zhuǎn)錄所需的最小限度的序列，例如被稱為TATA盒的序列，這是編碼蛋白質(zhì)的基因的啟動子通常都具有的。 [0058]核心啟動子可以使任何一種已知的核心啟動子，例如花椰菜花葉病毒35S或19S啟動子、泛素啟動子、IN2啟動子或玄參花葉病毒啟動子。
[0059]還可以對啟動子序列加以修飾，以提供異源核苷酸序列表達水平的范圍?？梢岳帽日麠l啟動子更少的區(qū)域，而驅(qū)動絨氈層優(yōu)先表達的能力仍能保留。但是，mRNA的表達水平可能隨著啟動子序列一部分的缺失而減少。因此，可將啟動子修飾為弱或強啟動子。通常，“弱啟動子”是指驅(qū)動編碼序列以低水平表達的啟動子?！暗退健笔侵复蠹s1/10000轉(zhuǎn)錄本至大約1/100000轉(zhuǎn)錄本至大約1/500000轉(zhuǎn)錄本的水平。相反，強啟動子驅(qū)動編碼序列以高水平(或者大約1/10轉(zhuǎn)錄本至大約1/100轉(zhuǎn)錄本至大約1/1000轉(zhuǎn)錄本)表達。通常，啟動子序列的至少大約30個核苷酸將被用于驅(qū)動核苷酸序列的表達。為增加轉(zhuǎn)錄水平，可以將增強子與啟動子區(qū)域組合使用。增強子是發(fā)揮增加啟動子區(qū)域表達作用的核苷酸序列，例如SV40增強子區(qū)域、35S增強子元件等。
[0060]本發(fā)明中，所述構建體中的啟動子可以使天然啟動子或被取代的啟動子。所述構建體中的啟動子可以是誘導型啟動子，使得可通過暴露給誘導劑來控制構建體中正義或反義分子的表達。任何植物相容性啟動子元件都可用于所述構建體，可以是植物基因啟動子，例如核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶小亞基的啟動子；或者根癌農(nóng)桿菌的腫瘤誘導質(zhì)粒的啟動子，例如胭脂堿合成酶和章魚堿合成酶啟動子；或者病毒啟動子，例如花椰菜花葉病毒(CaMV) 19S和35S啟動子或玄參花葉病毒35S啟動子；大麥脂轉(zhuǎn)移蛋白啟動子LTP2 ;泛素啟動子；END2啟動子和聚半乳糖醛酸酶PG47啟動子。
[0061]可獲得的植物相容性啟動子的范圍包括組織特異性啟動子和誘導型啟動子。誘導型調(diào)控元件是能應答于誘導劑直接或間接激活一條或多條DNA序列或基因的轉(zhuǎn)錄的元件。不存在誘導劑時，DNA序列或基因?qū)⒉荒鼙晦D(zhuǎn)錄。典型地，與誘導型調(diào)控元件特異結合以激活轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)因子以無活性形式存在，其再通過誘導劑直接或間接轉(zhuǎn)化為活性形式。誘導劑可以是化學試劑，例如蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物、生長調(diào)控因子、除草劑或酚類化合物或直接通過熱、冷、鹽或毒性元素施加或通過病原體肌動蛋白或疾病劑(例如病毒)間接施加的生理脅迫。含有誘導型調(diào)控元件的植物細胞可暴露于誘導劑，通過噴霧、澆水、加熱或類似方法將誘導劑應用到細胞或植物上。
[0062]任何誘導型啟動子均可用于本發(fā)明。示例性的誘導型啟動子包括蛻皮素受體啟動子；來自ACEl系統(tǒng)的應答于銅的啟動子；來自玉米的In2-1和In2-2基因，其應答于苯磺酰胺除草劑安全劑；玉米GST啟動子，其由用作為前緊急除草劑的疏水親電化合物激活；和煙草PR-1a啟動子，其由水楊酸激活。其它受化學調(diào)控的啟動子包括留醇應答型啟動子以及四環(huán)素誘導型和四環(huán)素遏制型啟動子。
[0063]組織優(yōu)先型啟動子可用于靶向特定的植物組織中增強的轉(zhuǎn)錄和/或表達。啟動子可在目標組織中表達也在其它植物組織中表達，可在目標組織中強烈表達以及比其它組織程度低得多的表達，或者可高度優(yōu)選在目標組織中表達。本發(fā)明中，啟動子是偏好于在植物的雄性或雌性組織中表達。本領域技術人員已知的很多此類啟動子都可以使用。例如MAC2啟動子，其偏好于指導其連接的基因在植物雄性組織中表達，特別是絨氈層。雄性配子優(yōu)先型啟動子還包括PG47啟動子以及ZM13啟動子；肌動蛋白解聚因子啟動子；玉米果膠甲基酯酶類似基因的啟動子ZmC5 ;鈣調(diào)素結合蛋白Mpcbp的啟動子。
[0064]本發(fā)明中所述“有效連接”表示核酸序列的聯(lián)結，所述聯(lián)結使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子控制和調(diào)控。當感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達時“有效連接”表示:啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實現(xiàn)編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實現(xiàn)編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結，并且連 接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關系是符合讀碼框的?？梢浴坝行нB接”的核酸序列包括但不限于:提供基因表達功能的序列(即基因表達元件，例如啟動子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點特異性重組酶識別位點、整合酶識別位點)、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標記物、生物合成基因)、提供可計分標記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點特異性重組序列)和提供復制功能的序列(即細菌的復制起點、自主復制序列、著絲粒序列)。
[0065]基于基因的目的用途，本發(fā)明中所述構建體還可以包括其它組分，例如選擇標記、靶向或調(diào)控序列、穩(wěn)定序列或引導序列、內(nèi)含子等。所述構建體還將在目標異源核苷酸序列的3’端包括在植物中具有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)域。終止區(qū)域可以從根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒獲得，例如胭脂堿合成酶和章魚堿合成酶的終止區(qū)域。
[0066]所述構建體可額外的含有5’前導序列，所述前導序列可發(fā)揮增強翻譯的作用，其包含但不限于，小RNA病毒前導序列，EMCV前導序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))；馬鈴薯Y病毒組前導序列，例如TEV (煙草蝕紋病毒)前導序列；MDMV (玉米矮縮花葉病毒)前導序列；人類免疫球蛋白質(zhì)重鏈結合蛋白質(zhì)(BiP);來自紫花苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白質(zhì)mRNA的不翻譯前導序列(AMV RNA4);煙草花葉病毒(TMV)前導序列；以及玉米褪綠斑駁病毒前導序列(MCMV)。所述構建體還可含有增強翻譯和/或mRNA穩(wěn)定性的序列，例如內(nèi)含子。[0067]在希望將異源核苷酸序列的表達產(chǎn)物引向特定細胞器，特別是質(zhì)體、造粉體，或者引向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或在細胞表面或細胞外分泌的情況下，所述構建體還可包含轉(zhuǎn)運肽(又稱分泌信號序列或?qū)蛐蛄?的編碼序列，對受體蛋白質(zhì)來說，所述轉(zhuǎn)運肽可以是異源的，其包含但不限于，?；\載蛋白的轉(zhuǎn)運肽、RUBISC0的小亞基、植物EPSP合酶、玉米Brittle-ι葉綠體轉(zhuǎn)運肽等。用于向特定細胞器表達產(chǎn)物有很多選擇，例如，大麥α淀粉酶序列通常被用于指導向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表達。
[0068]本發(fā)明提供了能表達所述構建體的載體。一般而言，所述載體應當在植物細胞中具有功能。有時，載體在大腸桿菌中具有功能是優(yōu)選的(例如，生產(chǎn)蛋白質(zhì)用于產(chǎn)生抗體、DNA序列分析、構建插入、獲得核酸的量時)。 [0069]本發(fā)明中所述構建體可另外含有對除草劑形成抑制或中和作用的基因，優(yōu)選為除草劑抗性基因，其包括但不限于，對磺酰脲類的抗性基因、對溴苯腈的抗性基因、對草甘膦的抗性基因、對草胺膦的抗性基因、對草丁膦的抗性基因、對咪唑啉酮類的抗性基因和對2，4-二氯苯氧乙酸酯(2，4-D)的抗性基因。
[0070]將本發(fā)明中所述構建體或所述重組載體導入植物，常規(guī)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導的DNA導入。
[0071]本發(fā)明中所述的將核苷酸序列“引入”植株時，其表示可通過直接轉(zhuǎn)化的方法發(fā)生，所述方法例如對植物組織的農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化、微粒發(fā)射轟擊、電穿孔等；或者可通過將具有異源核苷酸序列的植株與另一植株雜交來進行，使得后代具有并入它們基因組的核苷酸序列。此類育種技術是本領域技術人員公知的。
[0072]本發(fā)明提供了一種影響雄性生育力的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，具有以下優(yōu)
占-
^ \\\.[0073]1、首次分離。本發(fā)明影響雄性生育力的蛋白質(zhì)OsAmylase為首次分離自水稻品種日本晴的α-淀粉酶。
[0074]2、杜絕基因漂移。本發(fā)明影響雄性生育力的基因OsAmylase來源于水稻，在花粉發(fā)育后期，當花粉粒中的淀粉提前被α -淀粉酶降解能夠使花粉粒能量來源崩潰，從而花粉發(fā)育被遏制，導致轉(zhuǎn)基因花粉不育，有效阻止轉(zhuǎn)基因作物通過花粉將轉(zhuǎn)基因元件傳播給其他野生作物品種。
[0075]3、效益好，準確性高。利用本發(fā)明影響雄性生育力的基因OsAmylase干擾了花粉形成和/或功能，準確性高，可用于保持雄性不育植株的純合隱性狀態(tài)；而且省去了雜交制種過程中去雄的步驟，減小了勞動力的投入和對產(chǎn)量的影響，具有較大的成本效益。
[0076]下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步的詳細描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0077]圖1為本發(fā)明影響雄性生育力的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有OsAmylase核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T構建流程圖；
[0078]圖2為本發(fā)明影響雄性生育力的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有OsAmylase核苷酸序列的重組表達載體DBN100259構建流程圖；
[0079]圖3為本發(fā)明影響雄性生育力的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的轉(zhuǎn)基因水稻植株TO代的花粉發(fā)育圖；
[0080]圖4為本發(fā)明影響雄性生育力的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的轉(zhuǎn)基因水稻植株Tl代的花粉發(fā)育圖。
【具體實施方式】
[0081]下面通過具體實施例進一步說明本發(fā)明影響雄性生育力的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的技術方案。
[0082]第一實施例、獲得OsAmylase序列
[0083]用玉米α -淀粉酶(a -Amylase)的已知序列(如序列表中SEQ ID NO: 3所示)，獲得水稻品種日本晴的α -淀粉酶(OsAmylase)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID Ν0:1所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示。所述OsAmylase核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0084]第二實施例、重組表達載體的構建及重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0085]1、構建含有OsAmylase核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T[0086]將合成的OsAmylase核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T (Promega, Madison, USA,CAT:A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM_T載體說明書進行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；fl表示噬菌體fl的復制起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；T7為T7RNA聚合酶啟動子；0sAmylase為OsAmylase核苷酸序列(SEQ ID NO:1) ；MCS為多克隆位點)。
[0087]然后將重組克隆載體DBNOl-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501 )，其熱激條件為:50 μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細胞、10 μ I質(zhì)粒DNA(重組克隆載體DBN01-T)，42°C水浴30秒；37°C振蕩培養(yǎng)I小時(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，在表面涂有IPTG(異丙基硫代-β -D-半乳糖苷)和X-gal(5_溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒:將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心Imin,去上清液,沉淀菌體用100 μ I冰預冷的溶液I (25mM Tris-HCl, IOmM EDTA(乙二胺四乙酸)，50禮葡萄糖，？!18.0)懸??；加入20(^1新配制的溶液11 (0.2M NaOH,1%SDS(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 μ I冰冷的溶液
III(3Μ醋酸鉀，5Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min ;于溫度4V、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70%的乙醇洗滌后晾干；加入 30μ I 含 RNase (20μ g/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，PH8.0)溶解沉淀；于溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;于溫度_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0088]提取的質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后，對陽性克隆進行測序驗證，結果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的所述OsAmylase核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，即OsAmylase核苷酸序列正確插入。
[0089]2、構建含有OsAmylase核苷酸序列的重組表達載體DBN100259[0090]分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和表達載體DBNBC-Ol (載體骨架:pCAMBIA2301(CAMBIA機構可以提供))，將切下的OsAmylase核苷酸序列片段插到表達載體DBNBC-Ol中，利用常規(guī)的酶切方法構建載體是本領域技術人員所熟知的，構建成重組表達載體DBN100259，其示意圖如圖2所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；gDPW:水稻雄性生育力基因組序列(SEQ ID N0:4) ;PG47:玉米花粉特異性啟動子(SEQ ID N0:5);btl:玉米Brittle-1葉綠體轉(zhuǎn)運肽(SEQ ID N0:6) ;OsAmylase:水稻α -淀粉酶的核苷酸序列(SEQID N0:l);In2:玉米 In2-1 基因的終止子(SEQ ID NO: 7);Ub1:玉米 Ubiquitin (泛素)基因的啟動子(SEQ ID N0:8) ;PAT:鏈霉菌的草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(SEQ ID N0:9)；Nos:胭脂堿合成酶的終止子(SEQ ID N0:10)；PM1:磷酸甘露糖異構酶基因(SEQ ID NO: 11);LB:左邊界)。
[0091]將重組表達載體DBN100259用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細胞，其熱激條件為:50μ I大腸桿菌Tl感 受態(tài)細胞、10 μ I質(zhì)粒DNA (重組表達載體DBN100259)，42 °C水浴30秒；37°C振蕩培養(yǎng)I小時(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaC110g/L,瓊脂15g/L,用NaOH調(diào)pH至7.5)上于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SphI和SpeI酶切后鑒定，并將陽性克隆進行測序鑒定，結果表明重組表達載體DBN100259包含序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即OsAmylase核苷酸序列。
[0092]3、重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0093]對己經(jīng)構建正確的重組表達載體DBN100259用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404(Invitrgen, Chicago, USA, CAT:18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為:100 μ L 農(nóng)桿菌 LBA4404、3 μ L質(zhì)粒DNA (重組表達載體);置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，酶切驗證結果表明重組表達載體DBN100259結構完全正確。
[0094]第三實施例、轉(zhuǎn)入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株的獲得及驗證
[0095]1、獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株
[0096]按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無菌培養(yǎng)的具有純合隱性等位基因dpw的粳稻9522品種突變體(上海交通大學合作項目獲得)的愈傷組織與第二實施例中3所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以將第二實施例中2構建的重組表達載體DBN100259中的T-DNA (包括gdpw片段、PG47:OsAmylase:1n2片段、Ub1:PAT:Nos片段、Ub1:PM1:Nos片段)轉(zhuǎn)入到水稻染色體組中，獲得了轉(zhuǎn)入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株。
[0097]對于農(nóng)桿菌介導的水稻轉(zhuǎn)化，簡要地，把水稻種子接種在誘導培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、麥芽糖30g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) 2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，從水稻成熟胚誘導出愈傷組織(步驟1:愈傷誘導步驟)，之后，優(yōu)選愈傷組織，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸愈傷組織，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)⑺鯫sAmylase核苷酸序列傳遞至愈傷組織上的至少一個細胞(步驟2:侵染步驟)。在此步驟中，愈傷組織優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(OD66tl=0.3，侵染培養(yǎng)基(N6鹽3.lg/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖 10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)2mg/L、ρΗ5.4))中以啟動接種。愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時期(3天)(步驟3:共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(N6鹽3.lg/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS) 40mg/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 2mg/L、植物凝膠 3g/L,pH5.8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，有一個“恢復”步驟。在“恢復”步驟中，恢復培養(yǎng)基(N6鹽
3.lg/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D)2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素(頭孢霉素)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟4:恢復步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細胞提供恢復期。接著,接種的愈傷組織在含選擇劑(甘露糖)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟5:選擇步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(N6鹽3.lg/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上培養(yǎng)，導致轉(zhuǎn)化的細胞選擇性生長。然后，愈傷組織再生成植物(步驟6:再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基(N6分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。
[0098]篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述N6分化培養(yǎng)基(N6鹽3.lg/L、N6維他命、干酪素300mg/L、鹿糖20g/L、甘露糖5g/L、6_節(jié)氨基腺嘌呤2mg/L、奈乙酸lmg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，25°C下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基(MS鹽
2.15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖15g/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，25°C下培養(yǎng)至約IOcm高，移至溫室培養(yǎng)至結實。在溫室中，每天于28°C下培養(yǎng)。
[0099]2、用TaqMan驗證轉(zhuǎn)入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株
[0100]取轉(zhuǎn)入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株的葉片約IOOmg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組DNA，通過Taqman探針熒光定量PCR方法檢測DPW-PG47基因和PMI基因的拷貝數(shù)。同時以野生型水稻植株作為對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設3次重復，取平均值。
[0101]檢測DPW-PG47基因和PMI基因拷貝數(shù)的具體方法如下:
[0102]步驟11、分別取轉(zhuǎn)入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株和野生型水稻植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重復；
[0103]步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA,具體方法參考其產(chǎn)品說明書；
[0104]步驟13、用NanoDrop2000 (Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；
[0105]步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80_100ng/μ I ；
[0106]步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標準品，以野生型水稻植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是:
[0107]以下引物和探針用來檢測DPW-PG47基因序列:[0108]引物I (DF):TCCTCCGTGTCACGTCAGG 如序列表中 SEQ ID NO: 12 所示；
[0109]引物2 (DR):ATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGG 如序列表中 SEQ ID NO: 13 所示；
[0110]探針I(yè) (DP):TCACCTCTCCTAGGAGCTGGTTCGAACTG 如序列表中 SEQ ID NO: 14 所示；
[0111]以下引物和探針用來檢測PMI基因序列:
[0112]引物3 (PF):GTATGGAAAATCCGTCCAGCC 如序列表中 SEQ ID NO: 15 所示；
[0113]引物4 (PR):TGAACTGCTTTTCGGATGTGC 如序列表中 SEQ ID NO: 16 所示；
[0114]探針2 (PP):CGATGGCCGAGCTGTGGATGG 如序列表中 SEQ ID NO: 17 所示；
[0115]PCR反應體系為:
[0116]
JumpStart? Tacj ReadyMix? (Sigma)10μ1 50x引物/探針混合物I μ?
基因組DNA3μ1 水(ddH20)6μ1
[0117]所述50 X引物/探針混合物包含ImM濃度的每種引物各45 μ 1，100 μ M濃度的探針50μ I和860 μ IlXTE緩沖液，并且在4°C，貯藏在琥珀試管中。
[0118]PCR反應條件為:
[0119]
步驟溫度時間
21950C5 分鐘
[0120]
2295 0C30 秒
2360 0CI 分鐘
24回到步驟22，重復40次
[0121]利用SDS2.3 軟件(Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)。
[0122]實驗結果表明，gDPff片段、PG47:OsAmylase:1n2 片段、Ub1:PAT:Nos 片段、Ub1:PM1:Nos片段均己整合到所檢測的水稻植株的染色體組中，而且轉(zhuǎn)入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株獲得了具有單拷貝的轉(zhuǎn)入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株。
[0123]第四實施例、分析轉(zhuǎn)基因水稻植株
[0124]針對植株整體形態(tài)對第三實施例中的具有單拷貝的所述轉(zhuǎn)入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株(TJ28株加以評估，針對花藥和花粉進行分析。除了雄性生育力的程度之外，在所述轉(zhuǎn)入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株和野生型水稻對照植株之間沒有觀察到其它形態(tài)不同。結果表明:具有單拷貝的所述轉(zhuǎn)入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株(Ttl)均為部分雄性不育(50%)，所有植株(100%)的花粉均有一半(50%)不能被染成藍黑色(圖3，50%正常的花粉染色)。而野生型玉米對照植株則是完全雄性可育的(圖3，正?；ǚ廴旧?。由部分雄性不育(50%)的所述轉(zhuǎn)入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株獲得T1代種子,播種后長成T1代植株，所有部分雄性不育(50%)的所述轉(zhuǎn)入OsAmylase核苷酸序列的T1代水稻植株的花粉仍有一半花粉沒有育性(圖4)。
[0125]由此證明OsAmylase基因能夠降解花粉粒中的淀粉，造成水稻轉(zhuǎn)基因花粉不育，有效阻止轉(zhuǎn)基因作物通過花粉將轉(zhuǎn)基因元件傳播給其他野生作物品種。
[0126]綜上所述，本發(fā)明影響雄性生育力的蛋白質(zhì)OsAmylase為首次分離自中國水稻品種日本晴的α -淀粉酶，并且能夠降解花粉粒中的淀粉，造成水稻轉(zhuǎn)基因花粉不育，準確性高，有效阻止轉(zhuǎn)基因作物通過花粉將轉(zhuǎn)基因元件傳播給其他野生作物品種；可用于保持雄性不育植株的純合隱性狀態(tài)；同時省去了雜交制種過程中去雄的步驟，減小了勞動力的投入和對產(chǎn)量的影響，具有較大的成本效益。 [0127]最后所應說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍。
【權利要求】
1.一種影響雄性生育力的蛋白質(zhì)，其特征在于，包括: (a)具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或 (b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有影響雄性生育力的活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或 (c)如SEQID N0:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
2.一種影響雄性生育力的基因，其特征在于，包括: Ca)編碼權利要求1所述影響雄性生育力的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或 (b)在嚴格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有影響雄性生育力的活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或 (c)如SEQID NO:1所示的核苷酸序列。
3.—種表達盒，其特征在于，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的權利要求2所述影響雄性生育力的基因。
4.根據(jù)權利要求3所述表達盒，其特征在于，所述調(diào)控序列為雄性配子優(yōu)先型啟動子。
5.根據(jù)權利要求4所述表達盒，其特征在于，所述雄性配子優(yōu)先型啟動子為PG47或ZMl 3。
6.一種包含權利要求2所述影響雄性生育力的基因或權利要求3-5任一項所述表達盒的DNA構建體。`
7.一種包含權利要求6所述DNA構建體的重組載體。
8.一種降解植物花粉中淀粉的方法，其特征在于，包括通過表達權利要求2所述影響雄性生育力的基因或權利要求3-5任一項所述表達盒以降解植物花粉中的淀粉。
9.一種擾亂植物花粉發(fā)育的方法，其特征在于，包括利用權利要求7所述降解植物花粉中淀粉的方法以擾亂花粉形成。
10.一種誘導植物雄性不育的方法，其特征在于，包括利用權利要求9所述擾亂植物花粉發(fā)育的方法以產(chǎn)生部分雄性不育植物。
11.一種影響植物雄性生育力的方法，其特征在于，包括利用權利要求10所述誘導植物雄性不育的方法以產(chǎn)生部分雄性不育植物。
12.—種降低花粉中外源基因擴散的方法,其特征在于,包括將權利要求3-5任一項所述表達盒引入植物細胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株。
13.一種用于保持雄性不育植株的純合隱性狀態(tài)的方法，其特征在于，包含: (a)提供第一植株，所述第一植株包含雄性不育基因的純合隱性等位基因，且所述第一植株是雄性不育的； (b)向第二植株中引入權利要求6所述DNA構建體,所述第二植株包含與所述第一植株包含的雄性不育基因的純合隱性等位基因相同的雄性不育基因的純合隱性等位基因；所述構建體為半合狀態(tài)；在所述構建體中還包括育性恢復基因，當所述育性恢復基因在所述第二植株中表達時將恢復其雄性生育力； (c)用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以產(chǎn)生保持所述第一植株純合隱性狀態(tài)的后代。
14.根據(jù)權利要求13所述用于保持雄性不育植株的純合隱性狀態(tài)的方法，其特征在于，所述育性恢復基因為Ms26基因、Ms45基因、DPW基因、Ms3基因或Ms22基因。
15.一種用于從具有雌性配子和雄性配子的植株產(chǎn)生種子的方法，其特征在于，包含: Ca)向包含雄性不育基因的純合隱性等位基因的第三植株引入權利要求6所述DNA構建體，所述第三植株是雄性不育的；在所述構建體中還包括育性恢復基因，當所述育性恢復基因在所述第三植株中表達時將恢復其雄性生育力； (b)使所述第三植株自體受精； (c)產(chǎn)生含有所述構建體的種子。
16.根據(jù)權利要求15用于從具有雌性配子和雄性配子的植株產(chǎn)生種子的方法，其特征在于，所述育性恢復基因為Ms26基因、`Ms45基因、DPW基因、Ms3基因或Ms22基因。
【文檔編號】A01H1/02GK103667211SQ201310750466
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權日:2013年12月31日
【發(fā)明者】于彩虹, 李建勇, 陶青, 張穎, 陳淑陽 申請人:北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司生物技術中心