編碼fasciated ear3(fea3)的核苷酸序列及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于調節(jié)莖端分生組織尺寸的方法和組合物。提供了用于調節(jié)fea3序列在宿主植物或植物細胞中的表達以調節(jié)諸如改變的尺寸和器官(包括植物種子)數(shù)的農學特性的方法。
【專利說明】編碼FASCIATED EAR3(FEA3)的核苷酸序列及其使用方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求提交于2012年3月14日的美國臨時申請61/610645和提交于2013年I月11日的美國臨時申請61/751326的權益，每個申請全部內容以引用方式并入本文。

【技術領域】
[0003]本發(fā)明涉及植物基因操縱領域，尤其是植物中基因活性和發(fā)育的操縱。

【背景技術】
[0004]葉和產(chǎn)生分枝與花的腋生分生組織以規(guī)則型式起始于莖端分生組織(SAM)。莖端分生組織頂端的細胞用作干細胞，其分裂以連續(xù)置換子細胞至周圍區(qū)域，其中它們進入分化的葉或花原基。分生組織從而能夠在發(fā)育期間通過平衡細胞增殖與細胞進入新的原基來調節(jié)它們的大小。SAM提供植物體的所有地上部分。干細胞調節(jié)的中心概念通過CLAVATA/WUSCHEL(CLV/WUS)基因的信號途徑是已知的。在擬南芥(Arabidopsis)中的CLV1、CLV2、或CLV3活性損失引起未分化細胞在莖頂端的積聚，指示CLV基因一起促進干細胞及時轉移到分化途徑中，或抑制干細胞分裂，或以上兩者(Fletcher等人，(1999)，Science 283:1911-1914 ;Taguchi_Sh1bara 等人，(2001), Genes and Development 15:2755-5766;Trotochaud 等人，(1999), Plant Cell 11:393-405 ;Merton 等人，(1954), Am.J.Bot.41:726-32 ；Szymkowiak 等人，(1992), Plant Cell 4:1089-100 ；Yamamoto 等人，(2000)，B1chim.B1phys.Acta.1491:333-40)。CLVl 的玉米直系同源物是 TDl (Bommert 等人，(2005) Development 132:1235-1245)。CLV2 的玉米直系同源物是 FEA2 (Taguch1-Sh1bara等人，(2001) Genes Dev.65 15:2755-2766)。期望能夠控制苗和花分生組織的尺寸和外觀，從而提供提高的葉、花、和果實的產(chǎn)量。因此，本發(fā)明的目的是為了提供用于調節(jié)分生組織發(fā)育的新型方法和組合物。


【發(fā)明內容】

[0005]在一個實施例中，本發(fā)明提供產(chǎn)生具有下降的內源fea3表達的轉基因植物的方法，該方法包括以下步驟:(a)將重組構建體引入到可再生的植物細胞中，所述重組構建體包含可操作地連接至啟動子的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列的表達降低內源fea3的表達；(b)在步驟(a)之后，由可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中轉基因植物在其基因組中包含重組DNA構建體；以及(C)選擇(b)的轉基因植物，其中該轉基因植物包含重組DNA構建體且在與不包含該重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出下降的fea3表達。
[0006]在另一個實施例中，本發(fā)明提供產(chǎn)生具有下降的內源fea3表達的轉基因植物的方法，該方法包括以下步驟:(a)將重組DNA構建體引入到可再生的植物細胞中，所述重組DNA構建體包含以有義或反義取向可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的分離的多核苷酸，其中多核苷酸包含:(i) SEQ ID NO:1、2或4的核苷酸序列；(ii)基于Clustal W比對方法，在與SEQ ID NO:1、2或4進行比較時具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列；
(iii)SEQ ID NO: 1、2或4的至少100個連續(xù)的核苷酸的核苷酸序列；(iv)能夠在嚴格條件下與(i)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或(V)經(jīng)修飾的植物miRNA前體，其中該前體已經(jīng)經(jīng)修飾以用設計用于產(chǎn)生指向SEQ ID NO:1、2或4的miRNA的序列替換miRNA編碼區(qū)；(b)在步驟(a)之后，由所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；以及(c)選擇(b)的轉基因植物，其中該轉基因植物包含重組DNA構建體且在與不包含該重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出下降的fea3表達。
[0007]本發(fā)明的一個實施例是產(chǎn)生具有改變的農學特性的轉基因植物的方法，該方法包括以下步驟:(a)將重組DNA構建體引入到可再生的植物細胞中，所述重組DNA構建體包含可操作地連接至至少一個調控序列的分離的多核苷酸，其中多核苷酸編碼多肽的片段或變體，基于Clustal W比對方法，該多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO:3或5進行比較時具有至少80%的序列同一性，其中片段或變體賦予在可再生的植物細胞中的顯性負表型；(b)在步驟(a)之后，由所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；以及(c)選擇(b)的轉基因植物，其中轉基因植物包含重組DNA構建體且在與不包含重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出至少一種選自下列的農學特性的改變:穗分生組織尺寸、籽粒行數(shù)、葉數(shù)、花序數(shù)、在花序內的分枝、花數(shù)、果實數(shù)、種子數(shù)、根分枝、根生物量、根倒伏、生物量和產(chǎn)量。
[0008]本發(fā)明的另一個實施例是上述方法，其中部分(a)的多肽在具有fea3突變體基因型的植物品系中的表達能夠部分或全部恢復野生型表型。
[0009]本發(fā)明的一個實施例是鑒定fea3的較弱等位基因的方法，該方法包括以下步驟:(a)對突變體玉米植物的群體進行基因篩選；(b)鑒定表現(xiàn)出比fea3無效植物更弱的fea3表型的一個或多個突變體玉米植物；以及(c)從具有更弱的fea3表型的突變體玉米植物中鑒定弱fea3等位基因。
[0010]本發(fā)明的一個實施例是鑒定fea3的較弱等位基因的方法，該方法包括以下步驟:(a)使用SEQ ID NO:1、2或4進行基因改組；(b)將來自步驟(a)的經(jīng)改組的序列轉化到可再生的植物細胞的群體中；(c)由步驟(b)的經(jīng)轉化的可再生的植物細胞的群體再生出經(jīng)轉化的植物的群體；(d)針對弱fea3表型，篩選來自步驟(C)的經(jīng)轉化的植物的群體；以及(e)從表現(xiàn)出弱fea3表型的經(jīng)轉化的植物中鑒定弱fea3等位基因。
[0011]本發(fā)明的一個實施例是其中內源fea3基因表達相對于對照植物被抑制的植物。本發(fā)明的另一個實施例是制備所述植物的方法，該方法包括以下步驟:(a)向內源fea3基因中引入突變；以及(b)檢測該突變，其中該突變對于抑制內源fea3基因的表達是有效的。在一個實施例中，(a)和(b)的步驟是使用定向誘導基因組局部突變(TILLING)方法來完成的。在實施例中，該突變是位點特異性突變。
[0012]本發(fā)明的一個實施例是表現(xiàn)出相對于野生型植物更弱的fea3表型的植物。另一個實施例是制備所述植物的方法，其中該方法包括以下步驟:(a)將轉座子引入到包含內源fea3基因的種質中；(b)獲取步驟(a)的種質的子代；(c)以及鑒定步驟(b)的子代植物，其中轉座子已經(jīng)插入到內源FEA3基因，并且觀察到fea3表達的降低。步驟(a)還可包括通過轉化來將轉座子引入到種質的可再生的植物細胞以及由可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中轉基因植物在其基因組中包含轉座子。
[0013]在一個實施例中，提供了上述方法，其中所述方法還包括以下步驟:(a)將重組構建體引入到可再生的植物細胞中，所述重組構建體包含通過上述方法鑒定的弱fea3等位基因；(b)在步驟(a)之后，由可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中該轉基因植物在其基因組中包含重組DNA構建體；以及(C)選擇(b)的轉基因植物，其中該轉基因植物包含重組DNA構建體且在與不包含該重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出弱fea3表型。
[0014]另一個實施例是產(chǎn)生具有改變的農學特性的轉基因植物的方法，該方法包括(a)將重組DNA構建體引入到可再生的植物細胞中，所述重組DNA構建體包含以有義或反義取向可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的分離的多核苷酸，其中多核苷酸包含:(i)SEQ ID NO: 1、2或4的核苷酸序列；(ii)基于Clustal W比對方法，在與SEQ ID N0:l、2或4進行比較時具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列；(iii)SEQ ID N0:l、2或4的至少100個連續(xù)的核苷酸的核苷酸序列；(iv)能夠在嚴格條件下與(i)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或(V)經(jīng)修飾的植物miRNA前體，其中該前體已經(jīng)經(jīng)修飾以用設計用于產(chǎn)生指向SEQ ID NO:1、2或4的miRNA的序列替換miRNA編碼區(qū)；(b)在步驟(a)之后，由所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；以及(c)選擇(b)的轉基因植物，其中轉基因植物包含重組DNA構建體且在與不包含重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出至少一種選自下列的農學特性的改變:增大的穗分生組織、籽粒行數(shù)、種子數(shù)、根分枝、根生物量、根倒伏、生物量和產(chǎn)量。另一個實施例是通過這種方法產(chǎn)生的植物。
[0015]一個實施例是在植物中表達異源多核苷酸的方法，該方法包括(a)用重組DNA構建體轉化可再生的植物細胞，所述重組DNA構建體包含可操作地連接至第二多核苷酸的異源多核苷酸，其中第二多核苷酸是FEA3啟動子；(b)在步驟(a)之后，由可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中轉基因植物在其基因組中包含重組DNA構建體；以及(c)選擇(b)的轉基因植物，其中轉基因植物包含重組DNA構建體，并且進一步地，其中異源多核苷酸在轉基因植物中表達。另一個實施例是在其基因組中包含重組DNA構建體的植物，所述重組DNA構建體包含可操作地連接至第二多核苷酸的異源多核苷酸，其中第二多核苷酸是FEA3啟動子，并且其中異源多核苷酸在植物中表達。
[0016]另一個實施例是鑒定具有至少一種農學特性的改變的第一玉米植物或第一玉米種質的方法，該方法包括在第一玉米植物或第一玉米種質中檢測至少一種與所述表型相關聯(lián)的標記基因座的多態(tài)性，其中標記基因座編碼多肽，所述多肽包含選自下列的氨基酸序列:a)與SEQ ID NO:3或5具有至少90%且小于100%的序列同一性的氨基酸序列，其中在與對照植物進行比較時，所述多肽在植物或其植物部分中的表達引起至少一種選自下列的農學特性的改變:穗分生組織尺寸、籽粒行數(shù)、花序數(shù)、在花序內的分枝、花數(shù)、果實數(shù)、和種子數(shù)，其中對照植物包含SEQ ID N0:3或5。另一個實施例是上述方法，其中所述多肽包含如SEQ ID NO: 23、25或27所示的序列。
[0017]本發(fā)明包括包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的重組DNA構建體，該分離的多核苷酸以有義或反義取向可操作地連接至莖端分生組織特異性的或莖端分生組織優(yōu)選的啟動子。
[0018]本發(fā)明包括載體，細胞、植物或種子，其包含本發(fā)明所述的任何重組DNA構建體中。
[0019]本發(fā)明涵蓋通過本文所述方法產(chǎn)生的植物。
[0020]本發(fā)明也包括包含上文所描述的重組DNA構建體的再生的、成熟的和能繁殖的轉基因植物、從其產(chǎn)生的轉基因種子、Tl和后續(xù)的世代。所述轉基因的植物細胞、組織、植物和種子可以包含至少一種所關注的重組DNA構建體。
[0021]在一個實施例中，植物選自:擬南芥、番茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜猜、棉花、稻、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
[0022]在一個實施例中，包含本發(fā)明所描述的重組構建體的植物是單子葉植物。在另一個實施例中，包含本發(fā)明所描述的重組構建體的植物是玉米植物。
[0023]【專利附圖】

【附圖說明】和序列表
[0024]根據(jù)以下的詳細描述和附圖以及序列表，可以更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細描述和附圖以及序列表形成本申請的一部分。此序列表中以單個字母表示核苷酸，以三個字母表不氛基酸，如 Nucleic Acids Researchl3:3021-3030 (1985)和 B1chemicalJournal 219 (N0.2):345-373(1984)所描述的IUPAC-1UBMB標準中所規(guī)定，它們以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循37 C.F.R.§ 1.822所示的規(guī)定。
[0025]圖1示出用于分離fea3-參考等位基因的圖位克隆方法。
[0026]圖2A示出顯示fea2和fea3在不同組織中的表達分析的RT-PCR數(shù)據(jù)。分析的不同組織是RAM:根尖分生組織；RE:根伸長區(qū)；RAM(1):側根RAM ；SAM ;莖端分生組織(包括葉原基)；EM:穗花序分生組織。圖2B示出原位fea3表達。圖2C示出來自非轉基因WT和表達RFP標記的FEA3蛋白質的轉基因植物膜分級樣品用RFP標記的FEA3的抗RFP抗體進行的Western印跡結果?！癟”是“總未分級樣品”，“S，，是可溶性級份并且“M”是膜級分。
[0027]圖3B-3E示出穗發(fā)育中與野生型(wt)植物(圖3A)相比的fasciated fea3表型。
[0028]圖4A-4C示出fea3/fea2雙突變體的表型分析。圖4A示出與單突變體和wt植物相比，在雙突變體的雄穗之間的比較。圖4B示出在雙突變體、單突變體和wt植物之間的著粒密度比較。圖4C示出與單突變體和wt植物相比，在雙突變體穗表型之間的比較。
[0029]圖5A和圖5B示出在CLV3肽根分析中的wt植物、fea2和fea3植物之間的比較。圖5B示出定量分析。
[0030]圖6示出在CLV3樣肽根分析中，在wt植物、fea2和fea3植物之間的定量分析比較。
[0031]圖7A和圖7B示出在FCPl和亂序肽存在下培養(yǎng)的wt和fea3胚。圖7A示出wt和fea3胚的SAM生長，并且圖7B示出它們的定量分析。
[0032]圖8A-8C示出fea3/tdl雙突變體的表型分析。
[0033]序列描述(表I)以及所附序列表遵循如37 C.F.R.§ 1.821-1.825所列出的關于專利申請中核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)定。此序列表中以單個字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如 Nucleic Acids Res.13:3021-3030(1985)和 B1chemicalJ.219(2):345-373(1984)所描述的IUPAC-1UBMB標準中所規(guī)定，它們以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循如37 C.F.R.§ 1.822所示的規(guī)定。
[0034]SEQ ID NO:1是fea3wt基因的核苷酸序列。
[0035]SEQ ID NO:2 是 wtfea3 的編碼序列。
[0036]SEQ ID NO:3 是 wtfea3 的氨基酸序列。
[0037]SEQ ID NO:4是其它拼接的較短fea3的編碼序列。
[0038]SEQ ID NO: 5是其它拼接的較短fea3的氨基酸序列。
[0039]SEQ ID NO:6 是由對應于基因座 Atlg68780 (擬南芥菜(Arabidopsis thaliana))的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
[0040]SEQ ID NO:7是由對應于基因座Atlgl3230 (擬南芥菜)的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
[0041]SEQ ID NO:8是由對應于基因座At3g25670(擬南芥菜)的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
[0042]SEQ ID NO:9是對應于基因座L0C_0s05g43140.1的氨基酸序列，來自密歇根州立大學稻基因組注釋計劃(Michigan State University Rice Genome Annotat1n Project)Osal釋放版本6 (2009年I月)的稻(日本晴)預測蛋白質。
[0043]SEQ ID NO: 10 是對應于 Sb03g008380，一種二色高粱(Sorghum bicolor)預測蛋白質的氨基酸序列，該蛋白質來自US Department of energy Joint Genome Institute的高粱JGI基因序列版本1.4。
[0044]SEQ ID NO:11是對應于Sb03g008360，一種二色高粱預測蛋白質的氨基酸序列，該蛋白質來自 US Department of energy Joint Genome Institute 的高梁 JGI 基因序列版本 1.4。
[0045]SEQ ID NO:12是對應于Glyma20g32610的氨基酸序列，它是來自US Departmentof energy Joint Genome Institute的大豆JGI Glymal.01基因組序列的預測的編碼序列的黃豆(Glycine max)預測蛋白質。
[0046]SEQ ID NO:13是對應于Glymal0g34950的氨基酸序列，它是來自US Departmentof energy Joint Genome Institute的大豆JGI Glymal.01基因組序列的預測的編碼序列的黃豆預測蛋白質。
[0047]SEQ ID NO:14是對應于Glyma02gll350的氨基酸序列，它是來自US Departmentof energy Joint Genome Institute的大豆JGI Glymal.01基因組序列的預測的編碼序列的黃豆預測蛋白質。
[0048]SEQ ID NO:15是對應于Glyma01g22730的氨基酸序列，它是來自US Departmentof energy Joint Genome Institute的大豆JGI Glymal.01基因組序列的預測的編碼序列的黃豆預測蛋白質。
[0049]SEQ ID NO:16是對應于Glyma05g07800的氨基酸序列，它是來自US Departmentof energy Joint Genome Institute的大豆JGI Glymal.01基因組序列的預測的編碼序列的黃豆預測蛋白質。
[0050]SEQ ID NO:17是對應于Glymal7gl3210的氨基酸序列，它是來自US Departmentof energy Joint Genome Institute的大豆JGI Glymal.01基因組序列的預測的編碼序列的黃豆預測蛋白質。
[0051]SEQ ID NO:18是來自敘利亞馬利筋(Asclepias syriaca)的fea3同源物的核苷酸序列。
[0052]SEQ ID NO:19是由SEQ ID NO:18編碼的核苷酸序列的氨基酸序列。
[0053]SEQ ID NO:20是fea3_0參考等位基因的核苷酸序列。
[0054]SEQ ID NO:21是由SEQ ID NO:20編碼的fea3_0參考等位基因的蛋白質序列。
[0055]SEQ ID NO:22是EMS突變體fea3_l的核苷酸序列。
[0056]SEQ ID NO:23是由SEQ ID NO:22給定的核苷酸序列編碼的EMS突變體等位基因fea3-l的蛋白質序列。
[0057]SEQ ID NO:24是EMS突變體fea3_2的核苷酸序列。
[0058]SEQ ID NO:25是由SEQ ID NO:24給定的核苷酸序列編碼的EMS突變體等位基因fea3-2的蛋白質序列。
[0059]SEQ ID NO:26是EMS突變體fea3_3的核苷酸序列。
[0060]SEQ ID NO:27是由SEQ ID NO:26給定的核苷酸序列編碼的EMS突變體等位基因fea3-3的蛋白質序列。
[0061]SEQ ID NO:28是FEA3啟動子的核苷酸序列。
[0062]SEQ ID NO:29是編碼FEA3蛋白質的信號肽的核苷酸序列。
[0063]SEQ ID NO:30是編碼RFP-FEA3融合蛋白質的核苷酸序列。
[0064]SEQ ID NO:31 是 FEA3 3，-UTR 的核苷酸序列。
[0065]SEQ ID NO:32_38是用于如實例10所述的CLV3/CLV3樣肽分析的肽序列(分別是 ZCL3、FCP1、CLV3、CLE20、CLE40、ZCL21 和 ZCL23)。
[0066]序列描述以及所附序列表遵循如37 C.F.R.§ 1.821-1.825所列出的關于專利申請中核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)定。
[0067]此序列表中以單個字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如Nucleic AcidsRes.13:3021-3030(1985)和 B1chemical J.219(N0.2):345-373(1984)所描述的IUPAC-1UBMB標準中所規(guī)定，它們以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循如37 C.F.R.§ 1.822所示的規(guī)定。

【具體實施方式】
[0068]本文中所列出的每篇參考文獻的公開內容均全文以引用方式并入本文。
[0069]如本文所用的并在所附的權利要求書中的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述”包括復數(shù)涵義，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“植物”的涵義包括多株此類植物，“細胞”的涵義包括一個或多個細胞及本領域的技術人員已知的它們的等同物等等。
[0070]如本文所用:
[0071 ] 術語“單子葉植物”和“單子葉的植物”本文互換使用。本發(fā)明的單子葉植物包括禾本科植物。
[0072]術語“雙子葉植物”和“雙子葉的植物”本文互換使用。本發(fā)明的雙子葉植物包括以下科:十字花科(Brassicaceae)植物、豆科(Leguminosae)植物、和爺科(Solanaceae)植物。
[0073]術語“全長互補序列”和“全長的互補序列”本文互換使用，指給定核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100%互補的。
[0074]“轉基因”指其基因組因異源核酸(諸如重組DNA構建體)的存在而發(fā)生改變的任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初的轉基因事件以及從最初的轉基因事件通過有性雜交或無性繁殖而產(chǎn)生的那些。如本文所用的術語“轉基因”不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法或通過諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變。
[0075]“基因組”在用于植物細胞時不僅涵蓋存在于細胞核中的染色體DNA，而且還包括存在于細胞的亞細胞組分(例如線粒體、質粒)中的細胞器DNA。
[0076]“植物”包括整個植物、植物器官、植物組織、種子和植物細胞以及同一植物的子代。植物細胞無限制地包括來自種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生區(qū)域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子的細胞。
[0077]“子代”包括植物的任何后續(xù)世代。
[0078]“轉基因植物”包括在其基因組內包含異源多核苷酸的植物。例如異源多核苷酸被穩(wěn)定地整合進基因組中，使得該多核苷酸傳遞至連續(xù)的世代。異源多核苷酸可單獨地或作為重組DNA構建體的部分整合進基因組中。
[0079]“性狀”指植物或特定植物材料或細胞的生理學、形態(tài)學、生物化學、或物理學特征。在某些情況下，這種特征是人眼可見的，例如種子或植物大小，或能夠通過生物化學技術測量，例如檢測種子或葉片的蛋白質、淀粉、或油含量，或通過觀察代謝或生理過程，如通過測量缺水耐受性或特定鹽或糖濃度的耐受性，或通過觀察一個或多個基因的表達水平，或通過農學觀察如滲透脅迫耐受性或產(chǎn)量。
[0080]“農學特性”是可測量的參數(shù)，包括但不限于低溫脅迫下的穗分生組織尺寸、雄穗尺寸、綠度、產(chǎn)量、生長速率、生物量、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植物含氮量、果實含氮量、種子含氮量、營養(yǎng)組織含氮量、總植物游離氨基酸含量、營養(yǎng)組織游離氨基酸含量、果實游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、總植物蛋白質含量、果實蛋白質含量、種子蛋白質含量、營養(yǎng)組織蛋白質含量、耐旱性、氮攝取、根分枝、根生物量、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植物高度、穗高、穗長耐鹽性、早期幼苗活力和出苗
[0081]針對序列而言的“異源”意指來自外來物種的序列，或如果來自相同物種，則指通過蓄意的人為干預而從其天然形式發(fā)生了組成和/或基因座的顯著改變的序列。
[0082]“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互換使用，并且指作為單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。核苷酸(通常以它們的5'-單磷酸形式存在)可以用它們的單字母名稱指代如下:“A”為腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別對應RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，“G”表示鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脫氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“ I ”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。
[0083]“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應的天然存在的氨基酸的人工化學類似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術語“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質”還可包括修飾，包括但不限于糖基化、脂質連接、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的Y羧化、羥化和ADP-核糖基化。
[0084]“信使RNA(mRNA) ”指無內含子并且可由細胞翻譯成蛋白質的RNA。
[0085]“cDNA”指與mRNA模板互補并且利用逆轉錄酶從mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是單鏈的或可以用DNA聚合成酶I的Klenow片段轉化成雙鏈形式。
[0086]“編碼區(qū)”是指當轉錄、加工、和/或翻譯時導致多肽序列產(chǎn)生的多核苷酸序列。
[0087]“表達序列標簽”(“EST”)是得自cDNA文庫的DNA序列，并且因此是已經(jīng)被轉錄的序列。EST通常通過cDNA插入序列單程測序獲取。將完整的cDNA插入序列稱為“全長插入序列”(“FIS”)。“重疊群”序列是由選自，但不限于EST、FIS和PCR序列的兩個或更多個序列裝配成的序列。將編碼完整或功能性蛋白質的序列稱為“完全基因序列”(“CGS”)，該序列能得自FIS或重疊群。
[0088]“成熟”蛋白質指經(jīng)翻譯后加工的多肽；即已經(jīng)去除了存在于初級翻譯產(chǎn)物中的任何前肽或原肽的多肽。
[0089]“前體”蛋白質指mRNA的翻譯初級產(chǎn)物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原肽可以是并且不限于細胞內定位信號。
[0090]“分離的”指物質，例如核酸和/或蛋白質，該物質基本上不含在天然存在的環(huán)境中通常伴隨該物質或與其反應的組分，或說是該物質被從所述組分移出。分離的多核苷酸可從它們天然存在于其中的宿主細胞純化。技術人員已知的常規(guī)核酸純化方法可用于獲得分離的多核苷酸。該術語也涵蓋重組多核苷酸和化學合成的多核苷酸。
[0091]“重組體”是指例如通過化學合成或通過用基因工程技術操縱分離的核酸片段來實現(xiàn)的兩個原本分離的序列片段的人工組合?！爸亟M體”也包括指已經(jīng)通過引入異源核酸而進行了修飾的細胞或載體，或源于經(jīng)這樣修飾的細胞的細胞，但不涵蓋由天然發(fā)生的事件(如自發(fā)突變、自然轉化/轉導/轉座)對細胞或載體的改變，例如沒有蓄意人為干擾而發(fā)生的那些。
[0092]“重組DNA構建體”指在自然界中通常不會一起存在的核酸片段的組合。因此，重組DNA構建體可包含源于不同來源的調控序列和編碼序列，或源于相同來源但以不同于通常天然存在的方式排列的調控序列和編碼序列。
[0093]術語“入門克隆”和“入門載體”本文可互換使用。
[0094]“調控序列”或“調控元件”可互換使用，并且指位于編碼序列的上游(5,非編碼序列)、中間或下游C非編碼序列)，并且影響相關編碼序列的轉錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯的核苷酸序列。調控序列可包括但不限于啟動子、翻譯前導序列、內含子和多腺苷酸化識別序列。術語“調控序列”和“調控元件”在本文中可互換使用。
[0095]“啟動子”指能夠控制另一核酸片段轉錄的核酸片段。
[0096]“在植物中有功能的啟動子”指能夠控制植物細胞中的轉錄的啟動子，無論其是否來源于植物細胞。
[0097]“組織特異性啟動子”和“組織優(yōu)選啟動子”可以互換使用，并且指主要但非必須專一地在一種組織或器官中表達,但是也可以在一種特定細胞中表達的啟動子。
[0098]“發(fā)育調控啟動子”指其活性由發(fā)育事件決定的啟動子。
[0099]術語“可操作地連接”指核酸片段連接成單一片段，使得其中一個核酸片段的功能受到另一個核酸片段的調控。例如，在啟動子能夠調控核酸片段的轉錄時，該啟動子與該核酸片段進行了可操作地連接。
[0100]“表達”指功能產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，核酸片段的表達可以指核酸片段的轉錄(如生成mRNA或功能RNA的轉錄)和/或RNA翻譯成前體或成熟蛋白質。
[0101]“過表達”是指基因產(chǎn)物在轉基因生物中超過在來自相同實驗的沉默分離(或非轉基因)生物中的水平的生產(chǎn)。
[0102]“表型”是指細胞或生物體的可檢測的特征。
[0103]有關將核酸片段(例如重組DNA構建體)插入細胞內的“引入”意指“轉染”或“轉化”或“轉導”，并且包括指將核酸片段整合進真核或原核細胞中，在該細胞中核酸片段可整合進細胞的基因組(如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)內，轉變成自主的復制子或瞬時表達(如轉染的mRNA)。
[0104]“轉化的細胞”是將核酸片段(如重組DNA構建體)引入其中的任何細胞。
[0105]在此所用的“轉化”指穩(wěn)定轉化和瞬時轉化兩者。
[0106]“穩(wěn)定轉化”指將核酸片段引入宿主生物體的基因組中，導致基因穩(wěn)定遺傳。一旦穩(wěn)定轉化，核酸片段穩(wěn)定地整合進宿主生物體和任何連續(xù)世代的基因組中。
[0107]“瞬時轉化”指將核酸片段引入宿主生物體的核中或包含DNA的細胞器中，引起基因表達而無基因穩(wěn)定遺傳。
[0108]術語“雜交的”或“雜交”指經(jīng)由授粉產(chǎn)生子代的配子融合(例如細胞、種子或植物)。該術語包括有性雜交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如當花粉和胚珠來自相同植物時)。術語“雜交”指經(jīng)由授粉產(chǎn)生子代的配子融合行為。
[0109]“有利等位基因”為位于特定基因座、賦予或有助于所期望的表型的等位基因，所述表型例如提高的細胞壁消化性，或作為另外一種選擇，為允許具有下降的細胞壁消化性的植物的鑒定的等位基因，其中所述植物可從育種計劃或種植中被篩除(“反選擇”)。標記的有利等位基因是與有利表型共分離的標記等位基因，或作為另外一種選擇，與不利植物表型共分離，從而提供鑒定植物的有益效果。
[0110]術語“引入”指將核酸(例如表達構建體)或蛋白質提供至細胞中的手段。引入包括指將核酸整合到真核或原核細胞中，在該細胞中核酸可整合到細胞的基因組內，并且包括指將核酸或蛋白質暫時提供給細胞。引入包括指穩(wěn)定的或瞬時的轉化方法以及有性雜交。因此，將核酸片段(例如重組DNA構建體/表達構建體)插入細胞內的情況下的“引入”意指“轉染”或“轉化”或“轉導”，并且包括指將核酸片段整合進真核或原核細胞中，在該細胞中核酸片段可以整合進細胞的基因組(如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)內、轉變成自主的復制子或瞬時表達(例如轉染的mRNA)。
[0111]“抑制DNA構建體”是在轉化或穩(wěn)定整合進植物基因組時，導致該植物中的靶基因“沉默”的重組DNA構建體。對該植物來說，該靶基因可以是內源的或是轉基因的。如本文針對靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表達的mRNA或蛋白質/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白質功能性的水平上的抑制。本文中可交換使用的術語“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括減小、降低、減退、下降、抑制、消除或防止?！俺聊被颉盎虺聊辈淮_定機理并且包括但不限于反義、共抑制、病毒-抑制、發(fā)夾抑制、莖-環(huán)抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。沉默靶向編碼區(qū)或非編碼區(qū)，例如內含子、5’-UTR和3’-UTR、或以上二者。
[0112]抑制DNA構建體可以包含源自所關注的靶基因的區(qū)域并且可以包含所關注的靶基因的有義鏈(或反義鏈)的核酸序列的全部或部分。取決于所要利用的方法，該區(qū)域可與所關注基因的有義鏈(或反義鏈)的全部或部分100%相同或具有少于100%同一性的同一性(如具有至少 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,9192%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 的同一性)。
[0113]抑制DNA構建體是本領域所熟知的，一旦選定所關注的靶基因就很容易構建，并且包括但不限于共抑制構建體、反義構建體、病毒-抑制構建體、發(fā)夾抑制構建體、莖-環(huán)抑制構建體、產(chǎn)生雙鏈RNA的構建體，以及更通常的是，RNAi (RNA干擾)構建體和小RNA構建體，例如siRNA (短干擾RNA)構建體和miRNA (微RNA)構建體。
[0114]“反義抑制”指產(chǎn)生能夠抑制靶基因或基因產(chǎn)物表達的反義RNA轉錄物?！胺戳xRNA ”指與靶初級轉錄物或mRNA的全部或部分互補，并阻斷分離的靶核酸片段表達的RNA轉錄物(美國專利5，107,065)。反義RNA可與特定基因轉錄物的任何部分，即5'非編碼序列、3'非編碼序列、內含子或編碼序列互補。
[0115]“共抑制”指產(chǎn)生能夠抑制靶基因或基因產(chǎn)物表達的有義RNA轉錄物?！坝辛x”RNA指包括mRNA并且可在細胞內或體外翻譯成蛋白質的RNA轉錄物。此前，已通過著眼于以有義取向過表達與內源mRNA具有同源性的核酸序列(其導致與過表達的序列具有同源性的所有RNA降低)設計出了植物中的共抑制構建體(參見Vaucheret等人，Plant J.16:651-659(1998);以及Gura，Nature 404:804-808 (2000)) ?共抑制構建體可包含來自編碼區(qū)或非編碼區(qū)的序列，例如內含子、5’ -UTR和3’ -UTR、或以上二者。
[0116]另一種變型描述了將植物病毒序列用于引導對近端mRNA編碼序列的抑制(于1998年8月20日公開的PCT專利公開WO 98/36083)。
[0117]RNA干擾是指由短干擾性RNA(SiRNA)介導的動物中序列特異性轉錄后基因沉默的過程(Fire等人，Nature 391:806 (1998))。在植物中的對應過程通常稱為轉錄后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也稱為阻抑作用(quelling)。據(jù)信轉錄后基因沉默過程是用于防止外來基因表達的進化保守的細胞防御機制，并且通常由不同植物區(qū)系和門所共享(Fire 等人，Trends Genet.15:358(1999))。
[0118]小RNA在控制基因表達中起重要作用。很多發(fā)育過程(包括開花)的調節(jié)是由小RNA控制的。現(xiàn)在有可能通過使用在植物中產(chǎn)生小RNA的轉基因構建體來以工程手段改變植物基因的基因表達。
[0119]小RNA似乎是通過與互補RNA或DNA靶序列堿基配對來行使功能的。當與RNA結合時，小RNA或引發(fā)靶序列的RNA裂解或弓丨發(fā)翻譯抑制。當與DNA靶序列結合時，據(jù)信小RNA可介導靶序列的DNA甲基化。無論具體機制是什么，這些事件的后果是基因表達受到抑制。
[0120]微RNA(miRNA)是長度為約19至約24個核苷酸(nt)的已經(jīng)在動物和植物中鑒定出的非編碼 RNA (Lagos-Quintana 等人，Science 294:853-858 (2001), Lagos-Quintana等人，Curr.B1l.12:735-739(2002) ；Lau 等人，Science 294:858-862(2001) ；Lee 和Ambros, Science 294:862-864(2001) ；Llave 等人，Plant Cell 14:1605-1619(2002)；Mourelatos 等人，Genes.Dev.16:720-728 (2002) ；Park 等人，Curr.B1l.12:1484-1495(2002) ;Reinhart 等人，Genes.Dev.16:1616-1626 (2002))。它們是由大小為大約70至200nt的較長的前體轉錄物加工生成的，并且這些前體轉錄物能夠形成穩(wěn)定的發(fā)夾結構。
[0121]微RNA (miRNA)看起來通過與位于由這些基因產(chǎn)生的轉錄物中的互補序列結合來調節(jié)靶基因。看起來有可能miRNA可進入至少兩條靶基因調控途徑:(I)翻譯抑制；(2) RNA裂解。進入RNA裂解途徑的微RNA與在動物中RNA干擾(RNAi)期間以及在植物中轉錄后基因沉默(PTGS)期間產(chǎn)生的21-25nt短干擾RNA(siRNA)類似，并且可能整合進與在RNAi情況中觀察到的復合物類似或相同的RNA-誘導的沉默復合物(RISC)內。
[0122]術語“基因座”一般是指攜帶一個基因或可能兩個或更多個基因的基因限定的染色體區(qū)域，所述兩個或更多個基因的連接如此緊密，以至于它們遺傳上表現(xiàn)為引起某種表型的單個基因座。當本文用于Fea3時，“Fea3基因座”應是指攜帶Fea3基因(包括它的相關聯(lián)調控序列)的染色體的限定區(qū)域。
[0123]“基因”應是指基因座內的特定基因編碼區(qū)，包括它的相關聯(lián)調控序列。本領域的普通技術人員應當理解，相關聯(lián)的調控序列將在距Fea3編碼序列約4kb的距離內，具有啟動子定位的上游。
[0124]“種質”指個體(例如一個植物)、一組個體(例如一個植物品系、品種或家族)、或來源于一個品系、品種、物種、或培養(yǎng)物的克隆的或從其中得到的遺傳物質。種質可為生物或細胞的部分，或可從生物或細胞中分離得到。種質通常提供遺傳物質與特異性分子構成，該分子構成提供生物或細胞培養(yǎng)物的一些或全部遺傳性狀的物理基礎。如本文所用，種質包括可從中生長出新植物的細胞、種子或組織，或植物部分如葉、莖、花粉、或細胞，它們能夠被培養(yǎng)成整個植物。
[0125]序列比對和百分比同一性可用設計用于檢測同源序列的多種比較方法來測定，這些方法包括但不限于LASERGENE?生物信息計算包(DNASTAR?Inc.,Madison,WI)
的MegalignK程序。除非另外說明，本文提供的序列的多重比對用Clustal W比對方法。
[0126]Clustal W 比對方法(描述于 Higgins 和 Sharp, CABI OS.5:151-153(1989)；Higgins, D.G.等人，Comput.Appl.B1sc1.8:189-191(1992))可見于 LASERGENE?生物信息學計算軟件包(DNASTAR Inc., Madison, ffis.)的 MegAlign? v6.1 程序。用于多重比對的默認參數(shù)對應于GAP PENALTY = 10、GAP LENGTH PENALTY = 0.2、DelayDivergent Sequences = 30%、DNA Transit1n Weight = 0.5、Protein Weight Matrix=Gonnet系列、DNA Weight Matrix = IUB。用于成對比對的默認參數(shù)是Alignment =緩慢-準確(Slow-Accurate)、Gap Penalty = 10.0、Gap Length = 0.10、Protein WeightMatrix = Gonnet 250、以及 DNA Weight Matrix = IUB。
[0127]用Clustal W程序比對序列后，可以通過查看同一程序中的“序列距離”表來獲得“百分比同一性”和“趨異”值。除非另外說明，本文提供的和申明的百分比同一性和趨異度是以該方式計算的。
[0128]本發(fā)明包括如下分離的多核苷酸和多肽:
[0129]分離的多核苷酸，其包含:(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal W 比對方法在與 SEQ ID NO:3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、21、23、25 或 27 進行比較時具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,^； 100%的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全長互補序列、其中所述全長互補序列和(i)的核酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成，并且是100%互補的。任一上述分離的多核苷酸可用于本發(fā)明的任何重組DNA構建體(包括抑制DNA構建體)。所述多肽優(yōu)選地為FEA3多肽。所述多肽優(yōu)選地具有FEA3活性。
[0130]分離的多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal W比對方法在與SEQ ID NO:
3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、21、23、25或 27 進行比較時具有至少 50%,51 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%,96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性。所述多肽優(yōu)選地為FEA3多肽。所述多肽優(yōu)選地具有FEA3活性。
[0131]分離的多核苷酸，其包含:(i)基于Clustal W比對方法，在與SEQ ID NO:1、2、
4、18、20、22、24或 26 進行比較時具有至少 50 % ,51 % ,52 % ,53% ,54% ,55 % ,56 % ,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,^； 100% 的序列同一性的核酸序列；或(ii) (i)的核酸序列的全長互補序列。任一上述分離的多核苷酸可用于本發(fā)明的任何重組DNA構建體(包括抑制DNA構建體)。所述多肽優(yōu)選地為FEA3多肽。所述多肽優(yōu)選地具有FEA3活性。
[0132]分離的多核苷酸包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID N0:l、2、4、18、20、22、24或26的全長互補序列的DNA分子雜交。所述多肽優(yōu)選地為FEA3多肽。所述多肽優(yōu)選地具有FEA3活性。
[0133]分離的多核苷酸包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通過至少一種選自下列的方法改變一個或多個核苷酸而來源于SEQ ID NO:1、2、4、18、20、22、24或26:缺失、替換、添加和插入。所述多肽優(yōu)選地為FEA3多肽。所述多肽優(yōu)選地具有FEA3活性。
[0134]分離的多核苷酸包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列對應于SEQ ID NO:1、2、4、
18、20、22、24或26的等位基因。
[0135]在一個實施例中，本發(fā)明包括重組DNA構建體(包括抑制DNA構建體)。重組DNA構建體(包括抑制DNA構建體)可包含本發(fā)明的多核苷酸，其以有義或反義取向可操作地連接至至少一個調控序列(例如在植物中有功能的啟動子)。多核苷酸可包含SEQ ID NO:
1、2、4、18、20、22、24 或 26 的 100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 個連續(xù)的核苷酸。多核苷酸可編碼本發(fā)明的多肽。
[0136]本文使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域所熟知的并且在如下文獻中有更全面的描述:Sambrook, J., Fritsch, E.F.和 Maniatis, T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,1989 (下文稱為 “Sambrook” )。
[0137]本領域內的技術人員應當很好地理解，不同的啟動子可在不同的組織或細胞類型中，或在不同的發(fā)育階段，或響應不同的環(huán)境條件而引導基因的表達。
[0138]可用于本發(fā)明的啟動子包括但不限于莖端分生組織特異性的啟動子和莖端分生組織優(yōu)選的啟動子。玉米knotted I啟動子和來自已知在玉米SAM中表達的基因的啟動子可用于表達本發(fā)明公開的多核苷酸。此類基因的例子包括但不限于Zm phabulosa、terminal earl、rough sheath2、rolled leafl> zybl4> narrow sheath(Ohtsu, K.等人，(2007)Plant Journal 52，391_404)。來自其它物種的這些基因的直系同源物的啟動子也可用于本發(fā)明。
[0139]來自SAM優(yōu)選表達的基因的擬南芥啟動子的例子包括但不限于clv3、aintegumenta—like (ail5、ail6、 和 ail7)和 terminal ear likel、clavatal、wus、shootmeristemless、terminal flowerl (Yadav 等人(2009) Proc Natl Acad Sci USA.March 24)。
[0140]PCT公開WO 2004/071467和美國專利7，129，089描述通過以獨特組合將單個啟動子、基因和轉錄終止子連接在一起來合成多個啟動子/基因/終止子盒組合。一般來講，側接合適啟動子的NotI位點用于克隆期望基因。可使用PCR擴增，用經(jīng)設計用于在基因5’和3’末端處引入NotI位點的寡核苷酸將NotI位點加到受關注的基因上。然后用NotI消化所得PCR產(chǎn)物，并將其克隆到合適的啟動子/NotI/終止子盒中。雖然將基因克隆進表達盒常利用NotI限制性酶完成，本領域技術人員可認識到能夠利用多種限制性酶獲得期望的盒。另外，本領域技術人員將會知道可利用其它克隆技術，包括但不限于基于PCR的或基于重組的技術生成合適的表達盒。
[0141]此外，WO 2004/071467和美國專利7，129，089描述了為了獲得所需表型表達，還將單個啟動子/基因/轉錄終止子盒與合適的選擇性標記盒以獨特組合和取向連接到一起。雖然這主要使用不同的限制性酶位點來完成，但本領域的技術人員可認識到可利用多種技術來獲得所需的啟動子/基因/轉錄終止子組合或取向。這樣做可獲得莖端分生組織特異性的啟動子/基因/轉錄終止子盒的任何組合和取向。本領域的技術人員還可認識到這些盒可位于單個DNA片段上或在多個片段上，該處基因共表達是多個DNA片段共轉化的結果。
[0142]術語“根構造”指構成根的不同部分的布置方式。術語“根構造”、“根組織結構”、“根系”或“根系結構”在本文中可互換使用。
[0143]如本文所述，“根倒伏”、“根分枝”和“根生物量”的改變是“根構造”改變的例子。
[0144]一般來講，植物由胚發(fā)育成的第一種根稱為初生根。在大多數(shù)雙子葉植物中，初生根被稱為主根。這種主根向下生長并產(chǎn)生分枝根(側根)。在單子葉植物中，植物的初生根發(fā)生分枝，生成須根系。
[0145]術語“改變的根構造”指與參照植物或對照植物比較，在其不同發(fā)育階段構成根系的不同部分的改變狀況。應該理解，改變的根構造涵蓋了一種或多種可測量參數(shù)(包括但不限于一個或多個根系部分的直徑、長度、數(shù)目、角度或表面)的改變，所述根系部分包括但不限于初生根、側根或分枝根、不定根和根毛，所有這些均在本發(fā)明的范圍內。這些改變可導致根所占的區(qū)域或空間的整體改變。
[0146]本領域的普通技術人員熟悉確定植物根構造改變的規(guī)程。例如,可檢測分析Wt和突變體玉米植物的根構造在幼苗期、花期或成熟期的改變。
[0147]根構造的改變可通過統(tǒng)計溫室培育的植物頂部第3或第4節(jié)的節(jié)根數(shù)目或根帶的寬度來確定。
[0148]“根帶”指成熟期植物在花盆底部的根叢寬度。植物根構造變化的其它量度包括但不限于側根的數(shù)量、節(jié)根的平均根直徑、側根的平均根直徑、根毛的數(shù)量和長度。
[0149]側根分枝的程度(如側根數(shù)量、側根長度)可通過這樣確定:從完整的根系進行二次取樣，將樣本用平面掃描器或數(shù)碼相機成像并用WinRHIZO?軟件(Regent InstrumentsInc.)分析。
[0150]根倒伏是不發(fā)生根倒伏的植物的量度；傾斜與垂直軸成大約30度角或更大角度的植物將被統(tǒng)計為發(fā)生根倒伏。
[0151 ] 也可通過在田間測試中，在相同條件下比較植物與對照或參照植物提高產(chǎn)量的能力，來評價植物根倒伏、根生物量和根分枝的改變。
[0152]對提取的有關根表型的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析(通常為t檢驗)，以將轉基因根與非轉基因姊妹株植物的根進行比較。在多個事件和/或構建體涉及該分析的情況下，還可以使用單因素方差分析。
[0153]也可通過在田間測試中比較植物在脅迫條件下(例如營養(yǎng)物質過剩或受限、水過?；蚴芟?、存在病害)保持基本產(chǎn)量(例如至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%、98%、99%或100%產(chǎn)量)的能力，與非脅迫條件下的對照或參照植物的產(chǎn)量，來評價根倒伏、根生物量和根分枝改變。野生型FEA3或“fasciated ear3”基因編碼預測的富含亮氨酸重復序列受體樣蛋白質(LRR-RLP)，其由506個氨基酸組成。術語“野生型FEA3基因”、“FEA3 wt基因”、“Fea3基因”和“FEA3基因”本文互換使用。擬南芥包含三種FEA3直系同源物 At3g25670、Atlg 13230、和 Atlg68780。
[0154]LRR-RLP 構成一大類包含 LRR 的蛋白質(Wang, G.等人(2010)Critical Reviewsin Plant Science, 29:285-299)。從結構上來說，可將LRR-RLP分成以下七個不同的域:信號肽、富含半胱氨酸的域、細胞外LRR(eLRR)域、可變域、酸性域、跨膜域、和短的細胞質區(qū)域(Jones 和 Jones (1997) Adv.Bot.Res.24:89-167)。包含 LRR 的 C 域由三個亞域組成，它們具有無LRR的島狀亞域(C2)，其插入eLRR亞域Cl和C3，但是不是所有的RLP含有C2島狀結構(Wang, G.等人(2008)Plant Phys1ll47:503-517)。
[0155]我們對于fea2/fea3雙突變體的分析表明fea2和fea3以獨立的途徑發(fā)揮作用。
[0156]我們對于tdl/fea3雙突變體的分析表明tdl和fea3以獨立的途徑發(fā)揮作用。
[0157]術語帶化來自拉丁文fascis,意指束(帶)，描述由增生引起的植物外形的變化。
[0158]具有fea3突變的植物，其中該突變導致FEA3功能的喪失或FEA3表達的消除，也稱為“fea3植物”或“fea3無效植物”?！癴ea3無效植物”表現(xiàn)出“fea3表型”或“fea3無效表型”。fea3植物在花序和花梗發(fā)育期間發(fā)育出較大的分生組織，并且穗花序分生組織顯示嚴重的帶化，表明fea3通常用于限制這些分生組織的生長。
[0159]具有弱fea3突變的植物，其中該突變導致fea3功能的部分喪失或fea3表達的部分消除，也稱為“具有弱fea3表型的fea3植物”?！叭鮢ea3植物”表現(xiàn)出“弱fea3表型”。具有弱fea3等位基因的fea3植物表現(xiàn)出與fea3無效植物相似、但是程度更低的表型。具有弱fea3等位基因的fea3植物也可表現(xiàn)出部分fea3無效表型，即，可能不表現(xiàn)出全部fea3無效特性。本文所述的“弱fea3等位基因”是fea3變體或SEQ ID NO:1、2或4的變體，它們賦予植物弱fea3表型。
[0160]具有fea3突變的植物表現(xiàn)出“無效fea3表型”或“弱fea3表型”，本文將該植物稱為具有“突變fea3表型”的植物。
[0161]如本文所用，術語“顯性負突變”是指具有改變的基因產(chǎn)物的突變，該基因產(chǎn)物的作用拮抗野生型等位基因。這些突變通常導致改變的分子功能(常常是失活的)并且特征在于“顯性負”表型。賦予“顯性負表型”的基因變體、突變基因或等位基因將賦予宿主細胞“無效”或“突變”表型，甚至在野生型等位基因的存在下依然如此。
[0162]如本文所用，具有“FEA3活性”的多肽(或多核苷酸)是指當在“fea3突變系”中表達時，表現(xiàn)出“fea3突變體表型”的多肽(或多核苷酸)，其能夠部分或完全拯救fea3突變體表型。
[0163]術語“基因改組”和“定向進化”本文互換使用?！盎蚋慕M”方法包括反復進行DNA改組，然后通過適當?shù)暮Y選和/或選擇以生成具有改變的生物活性的FEA3核酸變體或其部分(Castle 等人，(2004) Science 304(5674):1151-4 ;美國專利 5，811，238 和 6，395，547)。
[0164]“TILLING”或“定向誘導基因組局部突變(Targeting Induced Local Les1ns INGenomics) ”是指一種誘變技術，其用于產(chǎn)生和/或鑒定、并且最終分離具有調控表達和/或活性的特定核酸的誘變變體(McCallum等人，(2000), Plant Phys1logyl23:439-442 ；McCallum 等人,(2000)Nature B1technology 18:455-457 ;以及 Colbert 等人，(2001)Plant Phys1logy 126:480-484)。
[0165]TILLING組合高密度點突變，快速靈敏地檢測突變。通常使用甲磺酸乙酯(EMS)誘變植物種子。EMS烷基化鳥嘌呤，這通常導致錯配。例如，將種子浸泡在約10-20mM的EMS溶液中約10至20小時；洗滌種子并隨后播種。將這一代植物稱為Ml。Ml植物隨后自體繁殖。存在于形成生殖組織的細胞中的突變被下一代繼承(M2)。通常篩選M2植物以獲得期望基因和/或特定表型的突變。
[0166]TILLING也允許選擇攜帶突變體的植物。這些突變體可表現(xiàn)出在強度或位置或時間上改變的表達(如果突變影響例如啟動子)。這些突變體甚至可表現(xiàn)出比天然形式的基因表現(xiàn)出的FEA3活性更低的活性。TILLING組合高密度誘變與高通量篩選方法。TILLING 中的步驟通常為:(a)EMS 誘變(Redei G P 和 Koncz C(1992)In Methods inArabidopsis Research, Koncz C, Chua N H, Schell J 編輯，Singapore, World ScientificPublishing Co,第 16-82 頁；Feldmann 等人，(1994) In Meyerowitz E M, Somerville C R編輯，Arabidopsis.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,第 137-172 頁；Lightner J 和 Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas 編輯，Methods on Molecular B1logy, Vol.82.Humana Press, Totowa, N.J.,第 91-104 頁)；(b)DNA制備和個體集合；(c)受關注區(qū)域的PCR擴增；(d)變性和退火以允許形成異源雙鏈核酸分子；(e)DHPLC，其中在集合中存在的異源雙鏈核酸分子在色譜中檢測為額外的峰；(f)鑒定單個突變體；以及(g)對突變PCR產(chǎn)物測序。TILLING方法是本領域為人們所熟知的(美國專利 US8, 071，840)。
[0167]也可使用其它突變方法以將突變引入FEA3基因。用于將基因突變引入植物基因并選擇具有期望性狀的植物的方法是熟知的。例如，種子或其它植物材料可根據(jù)標準技術用突變化學物質處理。此類化學物質包括但不限于如下方法:硫酸二乙酯、乙烯亞胺、和N-亞硝基-N-乙基脲。作為另外一種選擇，可利用電離輻射，其來自輻射源如X-射線或Y射線。
[0168]可使用用于檢測FEA3基因中的突變的其它檢測方法，例如毛細管電泳(例如恒定變性毛細管電泳和單鏈構象多態(tài)性)。又如，可利用錯配修復酶學檢測異源雙鏈核酸分子(例如來自芹菜的CELI內切核酸酶)。CELI識別錯配并精確地切開錯配的3'側。錯配的精確堿基位點可通過用錯配修復酶切割，隨后進行例如變性凝膠電泳來確定。參見例如 Oleykowski 等人，(1998) “Mutat1n detect1n using anovel plant endonuclease”Nucleic Acid Res。26:4597-4602 ；以及 Colbert 等人，(2001) “High-Throughput Screening for Induced Point Mutat1nsT3Iant Phys1logy126:480-484o
[0169]包含突變fea3基因的植物可與其它植物雜交以將突變引入另一個植物。這可使用標準育種技術完成。
[0170]同源重組允許將選擇的核酸在限定的選擇位點引入基因組。同源重組已經(jīng)在植物中展不。參見例如 Puchta 等人，(1994)，Experientia 50:277-284 ；Swoboda 等人，(1994)，EMBO J.13:484-489 ；Offringa 等人，(1993)，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:7346-7350 ；Kempin 等人，(1997) Nature 389:802-803 ；以及 Terada 等人，(2002) NatureB1technology,20 (10): 1030-1034)。
[0171]用于在植物中進行同源重組的方法已經(jīng)不僅對模型植物進行了描述(Offringa等人，(1990) EMBO J.0ctober ；9(10):3077-84)，而且對作物植物例如稻進行了描述(Terada R, Urawa H, Inagaki Y, Tsugane K, Iida S.Nat B1technol.2002 ；Iida 和Terada:Curr Opin B1technol.2004 年 4 月；15(2):1328)。靶向核酸(其可為如前文所定義的FEA3核酸或其變體)不需要分別靶向FEA3基因的基因座，但是可被引入例如高表達區(qū)。靶向核酸可為弱fea3等位基因或顯性負等位基因，它們用于替換內源基因或此外可被引入內源基因。
[0172]轉座元件可基于它們的轉座模式歸類為兩大類。這些稱為I類和II類；它們均具有作為誘變劑和遞送載體的用途。I類轉座元件通過RNA中間體轉座并利用反轉錄酶，即，它們是逆轉錄因子。存在至少三種類型的I類轉座元件，例如反轉錄轉座子、反座子、SINE樣元件。反轉錄轉座子通常含有LTR、和編碼病毒外殼蛋白質(gag)與逆轉錄酶的基因、RnaseH、整合酶和聚合酶(pol)基因。已經(jīng)描述了植物物種中的多個反轉錄轉座子。此類反轉錄轉座子經(jīng)由RNA中間體在由轉座子編碼的逆轉錄酶和RNA酶H催化的反應中移動和易位。例子分成Tyl-copia和Ty3_gypsy組以及分成SINE樣和LINE樣類別(Kumar和Bennetzen (1999) Annual Review of Genetics 33:479)。此外，DNA 轉座兀件如 Ac、Taml和En/Spm也存在于廣泛多種植物種類中，并且可在本發(fā)明中利用。轉座子(和IS元件)是用于將突變弓I入植物細胞的常見工具。
[0173]莖端分生組織(SAM)在發(fā)育期間通過平衡干細胞增殖和進入原基的子細胞來調節(jié)它的尺寸。已經(jīng)在玉米中鑒定了多個具有增大分生組織的“帶化”突變體，并且它們可用于研究分生組織尺寸調節(jié)的遺傳基礎。兩個玉米基因，thick tassel dwarf I (tdl ；Bommert等人，(2005) Development 132:1235-1245)和 fasciated ear2(fea2 ；Taguch1-Sh1bara等人，(2001) Genes Dev.6515:2755-2766)，分別與擬南芥富含亮氨酸重復序列(LRR)受體基因CLAVATA1 (CLVl)和CLAVATA2 (CLV2)同源。預測CLVl和CLV2形成受體復合物，其由CLV3配體激活并抑制干細胞促轉錄因子WUSCHEL。然而fea2/tdl雙突變體的分析表明基本的CLV1-CLV2共受體模式可能是較復雜的，因為fea2/tdl雙突變體顯示比任一單獨突變體更嚴重的表型。近來對擬南芥的分析揭示三種主要受體復合物(CLV1-BAM1 (BARELYANY MERISTEM1)、CLV2-CRN (CORYNE)、和 RPK2/TOAD2 (RECEPTOR-LIKE PROTEIN KINASE2/T0ADT00L2))的單獨作用是擬南芥中合適的分生組織尺寸控制所必需的。
[0174]此處我們給出了玉米突變體fea3的表型和分子表征，該突變體引起花序分生組織過度增殖，導致增大的或帶化的分生組織。我們利用圖位克隆方法和由部分反轉錄轉座子插入fea3基因座的外顯子產(chǎn)生的突變體克隆了 fea3基因。我們通過分離來源于靶向EMS誘變的三個附加fea3等位基因確認了這種同一性。FEA3基因編碼預測的富含亮氨酸重復序列受體樣蛋白質，其涉及fea2。原位雜交和紅色熒光蛋白質標記的轉基因植物示出FEA3在SAM組織中心表達并且還在根尖分生組織中表達。FEA3位于細胞質膜內。為了確定FEA3是否響應于CLV3相關(CLE)肽，我們測試它對不同肽的靈敏度。fea3突變體顯示降低的肽靈敏度，但是令人感興趣地是與FEA2相比它們響應于不同的CLE肽。fea2/fea3和tdl/fea3的雙突變體在穗和雄穗中具有增加的和協(xié)同的帶化表型，表明它們以會聚在相同下游目標以控制分生組織尺寸的獨立途徑作用。因此，F(xiàn)EA3作為受體蛋白質的功能處于不同于TDl和FEA2途徑的新途徑中。
[0175]實施例:
[0176]在一個實施例中，可用于本發(fā)明方法的fea3變體是一種或多種以下fea3核酸變體:(i)fea3核酸序列(SEQ ID NO:1、2或4)的部分；(ii)能夠與fea3核酸序列(SEQ IDN0:l、2或4)雜交的核酸序列；(iii)fea3核酸序列(SEQ ID N0:l、2或4)的拼接變體；
(iv)fea3核酸序列(SEQ ID N0:l、2或4)的天然存在的等位基因變體；(V)通過基因改組獲取的fea3核酸序列；(vi)通過定點誘變獲取的fea3核酸序列；(vii)通過TILLING方法獲取并鑒定的fea3變體。
[0177]在一個實施例中，內源FEA3的表達水平可在植物細胞中通過反義構建體、有義構建體、RNA沉默構建體、RNA干涉作用、人工小RNA和基因組缺失而下降?；蚪M缺失的例子包括但不限于轉座子、tilling、同源重組誘導的缺失。
[0178]在一個實施例中，可使用經(jīng)修飾的植物miRNA前體，其中該前體已經(jīng)經(jīng)修飾以用設計用于產(chǎn)生指向FEA3的miRNA的序列替換miRNA編碼區(qū)；前體也在主鏈序列中進行修飾以響應miRNA編碼區(qū)中的改變。
[0179]在一個實施例中，在本發(fā)明方法中使用的FEA3核酸變體是通過基因改組獲取的核酸變體。
[0180]在一個實施例中，也可利用TILLING(定向誘導基因組局部突變)技術將基因修飾引入玉米FEA3基因的基因座。
[0181]在一個實施例中，可利用定點誘變生成fea3核酸的變體。可利用多種方法實現(xiàn)定點誘變；最常用的方法是基于PCR的方法(美國專利7956240)。
[0182]在一個實施例中，也可利用同源重組失活或降低內源FEA3基因在植物中的表達。
[0183]同源重組可通過特定靶向體內的FEA3基因用于誘導定向基因修飾。體外制備在FEA3基因序列(例如本文提供的那些)的選擇部分(包括5'上游、3'下游、和基因間區(qū))中的突變并且利用標準技術將它們引入期望的植物。在引入的突變fea3基因和目標內源FEA3基因之間的同源重組將導致轉基因植物中野生型基因的定向取代，導致FEA3表達或活性的抑制。
[0184]在一個實施例中，催化RNA分子或核糖酶也可用于抑制FEA3基因的表達。設計特定地與事實上的任何目標RNA配對并在特定位置裂解磷酸雙酯骨架，從而功能上失活目標RNA的核糖酶是可能的。在進行這種裂解時，核糖酶不發(fā)生自體改變，并且因此能夠循環(huán)利用并裂解其它分子。在反義RNA中包括核糖酶序列賦予它們RNA裂解活性，從而提高構建體的活性。已經(jīng)鑒定了多類核糖酶。例如，一類核糖酶來源于多個小的環(huán)形RNA，它們能夠自體裂解并在植物中復制。該RNA能夠單獨復制(類病毒RNA)或用輔助病毒(衛(wèi)星RNA)復制。RNA的例子包括來自鱷梨日斑病類病毒的RNA和來自煙草環(huán)斑病毒、紫花苜蓿暫時性線條病毒、絨毛煙斑駁病毒、茛菪斑駁病毒和地三葉草斑駁病毒的衛(wèi)星RNA。已經(jīng)描述了目標RNA特異性核糖酶的設計和使用。參見例如Haseloff等人，(1988) Nature, 334:585_591。
[0185]用于失活FEA3基因的另一種方法是通過抑制表達的有義抑制。引入其中相對于啟動子以有義取向配置的核酸的表達盒已經(jīng)顯示為一種用于阻止期望靶基因轉錄的有效方法。(Napoli 等人(1990)，The Plant Cell 2:279_289，和美國專利 5，034，323、5，231，020、和 5，283，184)。
[0186]在一個實施例中，F(xiàn)EA3基因也可通過例如基于轉座子的基因失活而被失活。
[0187]在一個實施例中，失活步驟包括在FEA3基因序列中制造一個或多個突變，其中在FEA3基因序列中的一個或多個突變包括一個或多個轉座子插入，從而與相應的對照植物相比失活FEA3基因。例如，該突變可包括在FEA3基因中的純合缺失，或一個或多個突變包括在FEA3基因中的雜合缺失。
[0188]將這些可移動的遺傳因子例如通過有性雜交遞送至細胞，選擇轉座并且篩選所得插入突變體，例如用于獲得所關注的表型。包含缺失fea3基因的植物可與wt植物雜交。取決于將進行雜交的物種，可使用多種標準育種技術中的任何一種。在分離或重組植物的基因組中的TN(轉座子)位置可通過已知方法來確定，例如如本文所述的側接區(qū)域測序。例如，植物的PCR反應可用于擴增序列，其隨后可進行診斷測序以確認它的起源。任選地，篩選插入突變體以獲得期望的表型，例如抑制fea3的表達或活性，或改變農學特性。
[0189]實M
[0190]本發(fā)明將在下面的實例中進一步說明，其中份數(shù)和百分比是以重量計并且度數(shù)是攝氏度，除非另外說明。應該理解，盡管這些實例說明了本發(fā)明的實施例，但僅是以例證的方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實例，本領域的技術人員能夠確定本發(fā)明的基本特征，并且在不脫離其實質和范圍的情況下，能夠對本發(fā)明做出各種變化和修改以使其適用于各種用法和條件。此外，除了那些本文所示和描述的那些之外，根據(jù)前文所述，本發(fā)明的各種修改形式對本領域的技術人員來說將是顯而易見的。這些修改形式也旨在涵蓋于所附權利要求書的范圍內。
[0191]實例I
[0192]克降玉米fea3某閔
[0193]使用圖位克隆方法分離fea3-0參考等位基因(SEQ ID NO:20)，它對于染色體3進行初始作圖(圖1)。通過精細定位鑒定在編碼富含亮氨酸重復序列受體樣蛋白質的基因內的部分反轉錄轉座子插入。為了確認這一插入是效應性突變，進行定向EMS篩選，其允許我們鑒定fea3的三個附加等位基因，稱為fea3-l、_2和_3(分別是SEQ ID NO:22、24、和26)。
[0194]fea3使用混合分群作圖進行初始定位。947個個體的作圖群體用于將基因座置于BACs C0267M03和c0566I18之間，?6 BACs的區(qū)域包含?25個預測基因。測序和表達分析揭示了一個候選的LRR受體樣蛋白質，其在fea3-0等位基因中具有小的插入。利用定向EMS篩選從?10，000個Ml植物中鑒定三個附加的等位基因。每個等位基因的測序揭示相對于初代的氨基酸變化，證實分離了正確的基因。
[0195]實例2
[0196]FEA2和FEA3某閔的表汰分析
[0197]在不同組織中對FEA2和FEA3完成RT-PCR。圖2A示出FEA22和FEA3在不同組織中的表達。FEA2和FEA3顯示在莖端分生組織中的最強表達。圖2B示出FEA3的原位表達，顯示在分生組織中心的表達檢測。這個區(qū)域與WUS表達區(qū)域重疊。這個圖案與其它已知的帶化穗突變體差異很大(花序轉變階段)。
[0198]實例3
[0199]玉米突奪體fea3表型
[0200]在營養(yǎng)生長期間，fea3突變體植物看起來正常。然而，在轉入開花期后，在花序發(fā)育早期，fea3突變體穗(圖3B)示出與野生型相比變平和增大的花序分生組織(頂)(圖3A)。在發(fā)育后期，IM的增大引起突變體中的帶化(圖3C)。在成熟期，野生型穗顯示規(guī)則間距的和有組織的穗行(圖3D)，而fea3突變體穗顯示逐漸增大的穗頂端、附加的穗行和總體上不規(guī)則排列的行(圖3E)。
[0201]實例4
[0202]fea3/fea2雙突變體分析
[0203]玉米fea3/fea2雙突變體的雄穗比單個突變體更粗和更短(圖4A)。通過計算沿主花序軸每cm的著粒來分析著粒密度。雙突變體顯示著粒密度的顯著提高，指示在fea3和fea3之間的附加效應(圖4B)。相似地，雙突變體穗表型示出增加的帶化(圖4C)。這些結果表明FEA2和FEA3以不同的途徑作用。
[0204]實例5
[0205]Clavata3 妝根分析
[0206]在擬南芥中，CLAVATA2活性可通過根生長對CLAVATA3 (CLV3)肽的響應進行檢測。為了分析是否FEA3和FEA2響應CLV3，并且確定它們是否以常見的途徑作用，進行CLV3肽分析。B73和純合fea2以及fea3突變苗萌發(fā)并在包含CLV3肽的瓊脂板上生長。作為對照，苗也在包含突變變型肽和無任何肽的板上生長。在7天后測量初生根的長度。B73野生型植物顯示強的根生長抑制，這是響應CLV3肽的結果，但是fea2突變體不響應CLV3肽。令人感興趣地是，fea3突變體響應CLV3肽，即使FEA3在根中表達依然如此(圖5)。
[0207]實例6
[0208]從FEA3啟動子表達紅色熒光蛋白質
[0209]制備重組DNA構建體以允許體內定位FEA3，其已經(jīng)用紅色熒光蛋白質(RFP)進行了標記。構建體以5’至3’的取向包含以下元件:1)FEA3啟動子；2)FEA3信號肽編碼區(qū)；3)RFP-FEA3融合蛋白質編碼區(qū)；和4)FEA3 3’ UTR0產(chǎn)生包含這種重組DNA構建體的轉基因玉米植物。轉基因植物分析揭示RFP-FEA3融合蛋白質在穗和雄穗的花序分生組織中心區(qū)表達。
[0210]為了研究是否FEA3位于膜或可溶性級份中，在膜分級后進行western印跡。使用的組織是幼雄穗(約0.5?3cm的雄穗)，其來自如上所述表達RFP標記的FEA3蛋白質的轉基因植物。圖2C示出RFP標記的FEA3位于細胞質膜中，箭頭指示約83kD的條帶尺寸，其預期是RFP標記的FEA3的融合尺寸。
[0211]實例7
[0212]Clavata3樣妝根分析
[0213]為了分析是否FEA3響應CLV3樣肽，并且確定它們是否以常見的途徑作用，進行CLV3 肽分析。使用的肽是 ZCL3 (玉蜀黍 CLE 樣 3 ;SEQ ID NO:32)、FCPl (SEQ ID NO:33)、CLV3 (SEQ ID NO:34)、CLE20 (SEQ ID NO:35)、CLE40 (SEQ ID NO:36)、ZCL21 (玉蜀黍 CLE樣 3 ;SEQ ID NO:37)、和 ZCL23 (玉蜀黍 CLE 樣 23 ；SEQ ID NO:38)。
[0214]通過使用CLV3、CLE、和稻相關肽的同源性搜索發(fā)現(xiàn)ZCL肽存在于NCBI數(shù)據(jù)庫中的玉米序列中(Fiers 等人 Plant Cell (2005)，17:2542-2553 ；Suzaki 等人(2008)，PlantCell,20:2049-2058)。
[0215]B73和fea3突變苗萌發(fā)并在各包含5 μ M或10 μ M肽的瓊脂板上生長。作為對照，苗也在包含亂序肽的板上生長。在7天后測量初生根的長度。Β73野生型植物顯示強的根生長抑制，這是響應 ZCL3(SEQ ID NO:32)、FCPl (SEQ ID NO:33)和 CLV3 (SEQ ID NO:34)肽的結果。令人感興趣地是，fea3突變體顯示對FCPl肽較低的敏感性(圖6)。
[0216]實例8
[0217]在FCPl肽的存在下的胚培養(yǎng)物分析
[0218]Wt和fea3胚在20 μ M FCPl肽(SEQ ID NO: 33)或20 μ M亂序肽的存在下進行培養(yǎng)。為了測量胚SAM生長，在授粉后約10天，給胚滅菌(整株玉米進行滅菌，不是單個幼苗)并把胚切碎，并且把胚向下放到培養(yǎng)基上，在種植后兩周完成SAM尺寸測量(胚培養(yǎng))。發(fā)現(xiàn)WT胚SAM生長受到FCPl的強抑制，但是fea3胚顯示抗性(圖7A示出比較wt和fea3胚SAM生長的圖像，并且圖7B示出它們的定量分析)。柱狀圖在圖7B中示出，P < 0.0001
[0219]實例9
[0220]fea3/tdl雙突變體分析
[0221]玉米fea3/tdl雙突變體的雄穗比單個突變體更粗和更短(圖4A)。通過計算沿主花序軸每cm的著粒來分析著粒密度。雙突變體顯示著粒密度的顯著提高，指示在fea2和fea3之間的附加效應(圖4B)。相似地，雙突變體穗表型示出增加的帶化(圖4C)。這些結果表明FEA2和FEA3以不同的途徑作用。
[0222]實例 10
[0223]在其它植物物種中的fea3肓系同源物分析
[0224]也可通過進行如實例1-9對玉米FEA3所做的實驗分析擬南芥、稻、高粱和大豆的直系同源物FEA3。
【權利要求】
1.一種產(chǎn)生具有下降的內源fea3表達的轉基因植物的方法，所述方法包括: a.將重組構建體引入到可再生的植物細胞中，所述重組構建體包含可操作地連接至啟動子的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列的表達降低內源fea3的表達； b.在步驟(a)之后，由所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；以及 c.選擇(b)的轉基因植物，其中所述轉基因植物包含所述重組構建體且在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出下降的fea3表達。
2.—種產(chǎn)生具有下降的內源fea3表達的轉基因植物的方法，所述方法包括: a.將重組DNA構建體引入到可再生的植物細胞中，所述重組DNA構建體包含以有義或反義取向可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含: 1.SEQ ID NO:1、2或4的核苷酸序列； ii基于Clustal W比對方法，在與SEQ ID NO: 1、2或4進行比較時具有至少90%的序列同一'I"生的核苷酸序列； ii1.SEQ ID NO:1、2或4的至少100個連續(xù)的核苷酸的核苷酸序列； iv.能夠在嚴格條件下與(i)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或 V.經(jīng)修飾的植物miRNA前體，其中所述前體已經(jīng)經(jīng)修飾以用設計用于產(chǎn)生指向SEQ IDNO:1、2或4的miRNA的序列替換所述miRNA編碼區(qū)； b.在步驟(a)之后，使轉基因植物細胞再生，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；以及 c.選擇(b)的轉基因植物，其中所述轉基因植物包含所述重組DNA構建體且在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出下降的FEA3表達。
3.—種產(chǎn)生具有改變的農學特性的轉基因植物的方法，所述方法包括: a.將重組DNA構建體引入到可再生的植物細胞中，所述重組DNA構建體包含可操作地連接至至少一個調控序列的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽的片段或變體，基于Clustal W比對方法，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO:3或5進行比較時具有至少80%的序列同一性，其中所述片段或所述變體賦予在所述可再生的植物細胞中的顯性負表型； b.在步驟(a)之后，由所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；以及 c.選擇(b)的轉基因植物，其中所述轉基因植物包含所述重組DNA構建體且在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出至少一種選自下列的農學特性的改變:穗分生組織尺寸、籽粒行數(shù)、葉數(shù)、花序數(shù)、在所述花序內的分枝、花數(shù)、果實數(shù)、種子數(shù)、根分枝、根生物量、根倒伏、生物量和產(chǎn)量。
4.一種鑒定fea3的弱等位基因的方法，所述方法包括以下步驟: a.對突變體玉米植物的群體進行基因篩選； b.鑒定表現(xiàn)出比fea3無效植物更弱的fea3表型的一個或多個突變體玉米植物；以及 c.從所述具有更弱的fea3表型的突變體玉米植物中鑒定所述弱fea3等位基因。
5.一種鑒定fea3的弱等位基因的方法，所述方法包括以下步驟: a.使用編碼SEQID NO:3或5、或與SEQ ID NO:3或5至少70%相同的蛋白質、或其片段的一種或多種核苷酸序列進行基因改組； b.將來自步驟(a)的經(jīng)改組的序列轉化到可再生的植物細胞的群體中； c.由步驟(b)的經(jīng)轉化的可再生的植物細胞的群體再生出經(jīng)轉化的植物的群體； d.針對弱fea3表型，篩選來自步驟(C)的經(jīng)轉化的植物的群體；以及 e.從所述表現(xiàn)出弱fea3表型的經(jīng)轉化的植物中鑒定所述弱fea3等位基因。
6.一種植物，其中所述內源FEA3基因的表達相對于對照植物是降低的。
7.一種植物,所述植物相對于野生型植物表現(xiàn)出弱fea3表型。
8.一種制備權利要求6所述的植物的方法，所述方法包括以下步驟: a.向所述內源FEA3基因中引入突變；以及 b.檢測所述突變。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中使用步驟(a)和(b)是使用定向誘導基因組局部突變(TILLING)方法來完成的，并且其中所述突變對于降低所述內源FEA3基因的表達或其活性是有效的。
10.根據(jù)權利要求8或9所述的方法，其中所述突變是位點特異性突變。
11.一種制備權利要求6所述的植物的方法，其中所述方法包括以下步驟: a.將轉座子引入到包含內源fea3基因的種質中； b.獲取步驟(a)的種質的子代；以及 c.鑒定步驟(b)的子代植物，其中所述轉座子已經(jīng)插入到所述內源FEA3基因，并且觀察到fea3表達的降低。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中步驟(a)還包括通過轉化來將所述轉座子引入到所述種質的可再生的植物細胞中以及由所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述轉座子。
13.根據(jù)權利要求4或5所述的方法，其中所述方法還包括以下步驟: 1.將重組構建體引入到可再生的植物細胞中，所述重組構建體包含通過權利要求4或5所述的方法鑒定的弱fea3等位基因； ii在步驟(i)之后，由所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；以及 ii1.選擇(ii)的轉基因植物，其中所述轉基因植物包含所述重組DNA構建體且在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出弱fea3表型。
14.根據(jù)權利要求2或3所述的方法，其中部分(a)的多肽在具有所述fea3突變體基因型的植物品系中的表達能夠部分或全部恢復所述野生型表型。
15.一種產(chǎn)生具有改變的農學特性的轉基因植物的方法，所述方法包括以下步驟: a.將重組DNA構建體引入到可再生的植物細胞中，所述重組DNA構建體包含以有義或反義取向可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含: 1.SEQ ID NO:1、2或4的核苷酸序列； ii基于Clustal W比對方法，在與SEQ ID NO: 1、2或4進行比較時具有至少90%的序列同一'I"生的核苷酸序列； ii1.SEQ ID NO:1、2或4的至少100個連續(xù)的核苷酸的核苷酸序列； iv.能夠在嚴格條件下與(i)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或 V.經(jīng)修飾的植物miRNA前體，其中所述前體已經(jīng)經(jīng)修飾以用設計用于產(chǎn)生指向SEQ IDNO:1、2或4的miRNA的序列替換所述miRNA編碼區(qū)； b.在步驟(a)之后，由所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；以及 c.選擇(b)的轉基因植物，其中所述轉基因植物包含所述重組DNA構建體且在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出至少一種選自下列的農學特性的改變:增大的穗分生組織、籽粒行數(shù)、種子數(shù)、根分枝、根生物量、根倒伏、生物量和產(chǎn)量。
16.根據(jù)權利要求1-5或8-15中任一項所述的方法，其中所述植物選自:擬南芥、番爺、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜猜、棉花、稻、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
17.一種植物，所述植物在其基因組中包含重組DNA構建體，所述重組DNA構建體包含以有義或反義取向或以上兩種取向可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含: a.SEQ ID NO:1、2或4的核苷酸序列； b.基于ClustalW比對方法，在與SEQ ID NO: 1、2或4進行比較時具有至少90%的序列同一'I"生的核苷酸序列； c.能夠在嚴格條件下與(a)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或 d.經(jīng)修飾的植物miRNA前體，其中所述前體已經(jīng)經(jīng)修飾以用設計用于產(chǎn)生指向SEQIDNO:1、2或4的miRNA的序列替換所述miRNA編碼區(qū)；并且 其中所述植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出至少一種選自下列的農學特性的改變:增大的穗分生組織、籽粒行數(shù)、種子數(shù)、根分枝、根生物量、根倒伏、生物量和產(chǎn)量。
18.根據(jù)權利要求17所述的植物，其中所述植物選自:擬南芥、番茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜猜、棉花、稻、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
19.權利要求17或權利要求18所述的植物的種子，其中所述種子在其基因組中包含重組DNA構建體，所述重組DNA構建體包含以有義或反義取向可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含: a.SEQ ID NO:1、2或4的核苷酸序列； b.基于ClustalW比對方法，在與SEQ ID NO: 1、2或4進行比較時具有至少90%的序列同一'I"生的核苷酸序列； c.SEQ ID NO:1、2或4的至少100個連續(xù)的核苷酸的核苷酸序列；或 d.經(jīng)修飾的植物miRNA前體，其中所述前體已經(jīng)經(jīng)修飾以用設計用于產(chǎn)生指向SEQIDNO:1、2或4的miRNA的序列替換所述miRNA編碼區(qū)；并且 其中由所述種子產(chǎn)生的植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出至少一種選自下列的農學特性的改變:增大的穗分生組織、籽粒行數(shù)、種子數(shù)、根分枝、根生物量、根倒伏、生物量和產(chǎn)量。
20.—種在植物中表達異源多核苷酸的方法,所述方法包括: a.用重組DNA構建體轉化可再生的植物細胞，所述重組DNA構建體包含可操作地連接至第二多核苷酸的異源多核苷酸，其中所述第二多核苷酸是FEA3啟動子； b.在步驟(a)之后，由所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；以及 c.選擇(b)的轉基因植物，其中所述轉基因植物包含所述重組DNA構建體，并且進一步地，其中所述異源多核苷酸在所述轉基因植物中表達。
21.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中所述植物選自:擬南芥、番茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜猜、棉花、稻、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
22.—種植物，所述植物在其基因組中包含重組DNA構建體，所述重組DNA構建體包含可操作地連接至第二多核苷酸的異源多核苷酸，其中所述第二多核苷酸是FEA3啟動子，并且其中所述異源多核苷酸在所述植物中表達。
23.根據(jù)權利要求22所述的植物，其中所述植物選自:擬南芥、番茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜猜、棉花、稻、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
24.權利要求22或權利要求23所述的植物的種子，其中所述種子在其基因組中包含重組DNA構建體，所述重組DNA構建體包含可操作地連接至第二多核苷酸的異源多核苷酸，其中所述第二多核苷酸是FEA3啟動子序列，并且其中所述異源多核苷酸在由所述種子產(chǎn)生的植物中表達。
25.一種鑒定具有至少一種農學特性的改變的第一玉米植物或第一玉米種質的方法，所述方法包括在所述第一玉米植物或所述第一玉米種質中檢測至少一種與所述表型相關聯(lián)的標記基因座的多態(tài)性，其中所述標記基因座編碼多肽，所述多肽包含選自下列的氨基酸序列:a)與SEQ ID NO:3或5具有至少90%且小于100%的序列同一性的氨基酸序列，其中在與對照植物進行比較時，所述多肽在植物或其植物部分中的表達引起至少一種選自下列的農學特性的改變:穗分生組織尺寸、籽粒行數(shù)、花序數(shù)、在所述花序內的分枝、花數(shù)、果實數(shù)和種子數(shù)，其中所述對照植物包含SEQ ID NO:3或5。
26.根據(jù)權利要求25所述的方法，其中所述多肽包含如SEQID NO:23、25或27所示的序列。
【文檔編號】A01H5/10GK104168760SQ201380013957
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年3月13日 優(yōu)先權日:2012年3月14日
【發(fā)明者】S.M.艾倫, D.P.賈克森, B.I.杰, M.科馬特蘇, Y.K.李, H.薩凱 申請人:納幕爾杜邦公司, 冷泉港實驗室