具有改進(jìn)的糖化作用特性的基因修飾植物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于增加植物中之糖化作用潛力的方法，其包括在所述植物的至少一種細(xì)胞類(lèi)型中過(guò)表達(dá)編碼乙酰木聚糖酯酶多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生基因修飾植物的方法以及涉及通過(guò)這樣的方法產(chǎn)生的基因修飾植物，所述基因修飾植物過(guò)表達(dá)編碼乙酰木聚糖酯酶多肽的多核苷酸。
【專(zhuān)利說(shuō)明】具有改進(jìn)的糖化作用特性的基因修飾植物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于增加植物中之糖化作用（saccharification)潛力的方法， 其包括在所述植物的至少一種細(xì)胞類(lèi)型中過(guò)表達(dá)編碼乙酰木聚糖醋酶（acetyl xylan esterase)多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生基因修飾植物的方法以及涉及通過(guò)所 述方法產(chǎn)生的基因修飾植物，所述基因修飾植物過(guò)表達(dá)編碼乙酰木聚糖酯酶多肽的多核苷 酸。

【背景技術(shù)】
[0002] 木聚糖是木質(zhì)纖維素的主要成分之一并且構(gòu)成了人類(lèi)開(kāi)發(fā)可用的生物質(zhì)的大部 分。來(lái)自多個(gè)物種的硬木（hardwood)木聚糖和飼料作物的木聚糖通常是高度乙?；?。乙 酰基的存在影響木質(zhì)纖維素的很多特性，例如交聯(lián)和可提取性和反應(yīng)性。而且，木聚糖骨架 (backbone)上乙?；拇嬖趪?yán)重阻礙了木聚糖水解得到木糖，使得需要酶促或化學(xué)處理之 前的乙?；瞥瑢?dǎo)致了高成本和/或環(huán)境危害。
[0003] 木聚糖是地球上發(fā)現(xiàn)的第三豐富的生物聚合物，且其提供了可用于人開(kāi)發(fā)的大量 生物質(zhì)。木聚糖骨架由經(jīng)4-0-甲基-D-葡糖醛酸/葡糖醛酸取代的0-(1 - 4)連接的 D-吡喃木糖基殘基組成。所述吡喃木糖基殘基在C-2和/或C-3位置處是部分乙?；?。 木聚糖乙?；赡苡绊懩举|(zhì)纖維素生物質(zhì)到可發(fā)酵糖的轉(zhuǎn)化，這是生物燃料生產(chǎn)的關(guān)鍵步 驟，并且其可能影響微生物將糖類(lèi)發(fā)酵成乙醇。這還對(duì)木聚糖細(xì)胞壁物理化學(xué)特性可能也 是重要的。山楊木材的總乙酰基含量為約3%至5%并且其大部分都與木聚糖相關(guān)。麥秸、 甘蔗渣和柳枝稷中的乙?；繛榧s2%至3%。
[0004] 通過(guò)化學(xué)預(yù)處理降低乙?；扛纳屏颂钱a(chǎn)率。在歐洲山楊（P. tremula) 的一項(xiàng)研宄中，通過(guò)K0H處理使木材脫乙酰化使糖產(chǎn)率從12 %增加到42 %。在顫楊 (P. tremuloides)的一項(xiàng)類(lèi)似研宄中，乙?；坑善涑跏贾到档?5%，引起葡聚糖轉(zhuǎn)化 加倍并且比木聚糖轉(zhuǎn)化高出8倍。此外，當(dāng)木質(zhì)纖維素是脫乙?；臅r(shí)，更溫和的脫木質(zhì)素 (delignification)處理可用于進(jìn)行有效的糖化作用。在草和谷物稻桿的情況下得到了類(lèi) 似的觀察結(jié)果。木質(zhì)纖維素中乙?；拇嬖诓粌H在糖化作用期間而且在隨后的發(fā)酵期間都 不利于生物燃料生產(chǎn)。太高濃度的乙酸抑制微生物發(fā)酵。
[0005] 木材脫乙?；诨瘜W(xué)熱磨機(jī)械制衆(zhòng)（chemo-thermo-mechanical pulping)中起重 要作用。其有利地改變細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，從而增加纖維溶脹和纖維的有效毛細(xì)管作用。脫乙 ?；蠓冉档土税肜w維素的溶解度并增加了其到纖維素纖維上的吸附，這改善了纖維的 粘合能力并增加了其產(chǎn)率。
[0006] 因此，在這些應(yīng)用中需要從木質(zhì)纖維素中移除乙?；?。移除乙?；某Ｓ貌呗允?用堿預(yù)處理。已顯示l〇〇g木材需要約4g的K0H來(lái)完全脫乙酰化。雖然稀堿預(yù)處理特異性 地移除了乙酸鹽而不影響木聚糖或木質(zhì)素，但是這會(huì)增加總生產(chǎn)成本。例如，根據(jù)目前估 計(jì)，木質(zhì)纖維素乙?；?0%的差異會(huì)轉(zhuǎn)換為乙醇價(jià)格中10%的差異。
[0007] 通過(guò)使參與多糖乙?；腞WA基因突變獲得了木聚糖乙?；勘萕T低40 %的 擬南芥（Arabidosis)植物（Lee 等（2011)Plant and Cell Physiology 52:1289-1301)。 在沒(méi)有預(yù)處理的情況下，此降低不引起糖化作用中纖維素消化性的增加。
[0008] Pogorelko 等（2011)Plant Mol Biol 77 :433-445 構(gòu)建了由花椰菜花葉病毒 35S RNA啟動(dòng)子、擬南芥（Arabidosis thaliana)0-棒曲霉素蛋白信號(hào)肽（expansin signal peptide)和焚光標(biāo)記蛋白YFP構(gòu)成的表達(dá)盒。作者將三種構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans)水解酶（0 -木糖苷酶/a -阿拉伯糖苷酶、阿魏酸酯酶、乙酰木聚糖酯酶 (AnAXE))和水稻黃單胞桿菌（Xanthomonas oryzae)推定的a-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶引入 到哥倫比亞-O(Colombia-O)植物中。與Col-0植物相比，AnAXE植物中的乙酰基含量降低 了 23%。在酸預(yù)處理后糖化作用沒(méi)有增加。
[0009]與YFP融合允許快速并容易地篩選轉(zhuǎn)化體，檢測(cè)質(zhì)外體定位和蛋白質(zhì)尺寸確認(rèn)。 與野生型Col-0相比，所有的轉(zhuǎn)基因株系在質(zhì)外體中顯示出相應(yīng)水解活性的顯著增加以 及細(xì)胞壁組成的變化。檢查所述轉(zhuǎn)基因植物中的水解活性還首次顯示水稻黃單胞桿菌 (X. oryzae)基因的確編碼具有a-L 阿拉伯糖呋喃糖苷酶活性的酶。轉(zhuǎn)基因植物都沒(méi)有 顯示出可見(jiàn)的表型；然而，所誘導(dǎo)的組成變化增加了來(lái)自表達(dá)阿魏酸酯酶和木糖苷酶/ a _阿拉伯糖苷酶之植物的生物質(zhì)的降解性。我們的結(jié)果證明，創(chuàng)造一組具有經(jīng)修飾細(xì)胞壁 的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物（A.thaliana)來(lái)用作成套工具（toolset)用于研宄細(xì)胞壁組成如何 促進(jìn)頑拗現(xiàn)象并影響植物適應(yīng)性的可行性。
[0010] 有跡象表明太高的脫乙?；赡芡ㄟ^(guò)降低聚合物溶解性誘導(dǎo)頑拗現(xiàn)象（Poutanen 等（1990)Appl Microbiol Biotechnol 33:506-510)。
[0011] GenBank登錄號(hào)A22880. 1和NCBI參考序列XM_001395535. 2已經(jīng)公開(kāi)了來(lái)自黑 曲霉（Aspergillus niger)的乙酰木聚糖醋酶（axe A)基因（SEQ ID N0 :1)。對(duì)應(yīng)的多肽 如SEQ ID N0 :2所示。來(lái)自其他物種的乙酰木聚糖酯酶在本領(lǐng)域中是已知的。例如，來(lái)自 曲霉屬（Aspergillus)之物種無(wú)花果曲霉（Aspergillus ficuum)、白曲霉（Aspergillus kawachii)和泡盛曲霉（Aspergillus awamori)的乙酰木聚糖醋酶分別如SEQ ID NO :3、4 和5所示。
[0012] 為了改善可提取性、反應(yīng)性、酶促消化性、糖化作用和發(fā)酵行為，需要用于在植物 中進(jìn)行木聚糖脫乙?；母倪M(jìn)方法。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1.表達(dá)木聚糖酯酶（轉(zhuǎn)基因）的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。肌動(dòng)蛋白表達(dá) (AT3G18780. 2)示出WT(Col 0)和轉(zhuǎn)基因株系的均勻cDNA載荷（loading)。記錄所述轉(zhuǎn)基 因株系的正常生長(zhǎng)。使用來(lái)自?xún)煞N不同植物的種子對(duì)株系6c進(jìn)行分析，重復(fù)兩次。
[0014] 圖2.來(lái)自轉(zhuǎn)基因株系和WT的莖組織之蛋白質(zhì)提取物中的木聚糖乙酰酯酶活性。 每個(gè)重復(fù)匯集10個(gè)莖的兩個(gè)生物重復(fù)的全部可溶性（S)和壁結(jié)合（W)活性的平均值以及 SE。與WT相比，轉(zhuǎn)基因株系總活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加由星號(hào)表示：* = P彡10% ; * * = P < 5% (t 檢驗(yàn)）。Y-軸：比活性（specific activity)，以 nmol/分鐘/mg 為單位。
[0015] 圖3.轉(zhuǎn)基因植物的形態(tài)和生長(zhǎng)。
[0016] 圖A:各種植物部分的干重，以克為單位（Y-軸）。L+S:葉+莖；R+R:蓮座 (rosette) + 根。
[0017] 圖B:各種植物部分的水含量（％Y-軸）。L+S:葉+莖；R+R:蓮座+根。
[0018] 所述植物部分是（i)莖和葉以及（ii)根和蓮座。所述值是30株植物的平均值土 標(biāo)準(zhǔn)誤SE。與WT相比轉(zhuǎn)基因株系在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的變化由星號(hào)表示：* = P彡10%;** =P < 5% (t 檢驗(yàn)）。
[0019] 圖4?轉(zhuǎn)基因株系6c和WT對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)病原體營(yíng)養(yǎng)活體型卵菌（Hyaloperonospora arabidopsidis)的易感性。Y-軸代表每毫克鮮重的孢子數(shù)量。10次實(shí)驗(yàn)的平均值土SE。 P < 0. 0522的差異是顯著的（AN0VA)。
[0020] 圖5.在過(guò)表達(dá)真菌CE1的轉(zhuǎn)基因株系和WT中木材細(xì)胞大小和形狀的形態(tài)。在由 每個(gè)株系5株植物的下胚軸匯集在一起制成的浸漬物中確定細(xì)胞尺寸。N = 200個(gè)細(xì)胞，條 = SE。使用來(lái)自?xún)煞N不同植物的種子對(duì)株系6c進(jìn)行分析，重復(fù)兩次。與WT相比，轉(zhuǎn)基因株 系在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異由星號(hào)表示：* = P彡10%;** = P彡5% (學(xué)生t檢驗(yàn)）。分 別地，圖5A代表纖維長(zhǎng)度，圖5B代表纖維寬度，圖5C代表導(dǎo)管分子（vessel element)長(zhǎng) 度，且圖代表導(dǎo)管寬度。
[0021] 圖6.表達(dá)木聚糖酯酶的擬南芥株系和WT的FT-IR分析。
[0022] 圖A :0PLS-DA分析示出了轉(zhuǎn)基因株系與WT的分離。
[0023] 圖B:載荷圖示出了促進(jìn)分離的光譜。示出了與乙酸鹽/酯和吸附水有關(guān)的光譜。 分析表明WT中存在更多的乙酸鹽/酯和更少的吸附水。數(shù)據(jù)點(diǎn)是來(lái)自9株植物的莖磨粉 的光譜。
[0024] 圖7.細(xì)胞壁乙?；?。每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中使用3個(gè)生物重復(fù)并且WT中使用5 個(gè)生物重復(fù)對(duì)莖粉末進(jìn)行分析。條=SE。與WT相比轉(zhuǎn)基因株系中乙?；吭诮y(tǒng)計(jì)學(xué)上 顯著的降低由星號(hào)表示：* =P彡10%; * * =P彡5% (學(xué)生t檢驗(yàn)）。Y-軸代表乙酸含 量，以mg/g為單位。
[0025] 圖8.通過(guò)木聚糖酶消化轉(zhuǎn)基因株系和WT的細(xì)胞壁制備物而獲得的中性低聚木糖 (xylo-oligosacharide)的 MALDI-AP 分析。
[0026] 圖A :木聚糖酶消化產(chǎn)物中較低含量的木四糖（xyl4)或缺少木四糖表示轉(zhuǎn)基因株 系中木聚糖可及性（accessibility)的增加。Y-軸代表低聚木糖信號(hào)，強(qiáng)度分布以％為單 位。
[0027]圖B :鑒定了包含乙酰基的低聚糖。乙酰化指數(shù)計(jì)算為具有確定數(shù)量的每木糖之 乙?；囊阴；途厶堑膹?qiáng)度百分比乘以總信號(hào)中給定低聚糖的DA。這表明與WT相比，轉(zhuǎn) 基因株系中乙?；途勰咎堑南鄬?duì)含量較低。示出了 3個(gè)生物重復(fù)的平均值和SE。每個(gè)生 物重復(fù)由3株植物組成。
[0028] 圖9.通過(guò)木葡聚糖酶消化轉(zhuǎn)基因株系和WT的細(xì)胞壁制備物而釋放的低聚木糖 (xylogluco-oligosaccharide)的MALDI-T0F分析。值代表相對(duì)含量。與WT相比，株系6c 中包含半乳糖的乙?；途厶牵╫ligo)的含量降低（圖9A)，而非乙?；倪@種低聚糖的含 量增加（圖9B)。N = 6,條=SE。
[0029]圖10.未經(jīng)預(yù)處理（A)、經(jīng)堿預(yù)處理（B)和經(jīng)酸預(yù)處理（C)的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和 WT中的糖化作用率。以百分比示出的數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于顯著不同于WT(P彡5%，學(xué)生t-檢驗(yàn)） 的各個(gè)株系。在條上面示出了所有轉(zhuǎn)基因株系與WT對(duì)比的顯著性。每個(gè)株系由30株植物 代表。4個(gè)技術(shù)重復(fù)的平均值和SE。
[0030] 圖11.通過(guò)在表達(dá)木聚糖酯酶的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和WT中熱解-GC確定的相對(duì) 碳水化合物（A)和相對(duì)木質(zhì)素（B)含量。對(duì)于轉(zhuǎn)基因株系為三個(gè)生物重復(fù)的平均值+/-SE， 或者對(duì)于WT為六個(gè)生物重復(fù)的平均值+/-SE。每個(gè)生物重復(fù)由3株植物組成。S-木質(zhì)素 (S)、G-木質(zhì)素（G)和H-木質(zhì)素⑶。使用來(lái)自2種不同植物的種子對(duì)株系6c進(jìn)行分析， 重復(fù)兩次。通過(guò)ANOVA，株系之間的差異不是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的（P< 10%)。AIR2是脫淀粉 的醇不溶性殘余物。
[0031] 圖12.在表達(dá)木聚糖酯酶的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和WT中Updegraff纖維素（A)和 Klason木質(zhì)素（B)含量。A1R1-醇不溶性殘余物；A1R2-脫淀粉的醇不溶性殘余物。對(duì)于 轉(zhuǎn)基因株系為三個(gè)生物重復(fù)的平均值+/-SE，或者對(duì)于WT為六個(gè)生物重復(fù)的平均值+/-SE。 每個(gè)生物重復(fù)由10株植物組成。通過(guò)AN0VA，株系之間的差異不是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的（P < 10% )〇
[0032] 圖13.通過(guò)體外生長(zhǎng)莖組織的RT-PCR檢測(cè)攜帶35S::CE1構(gòu)建體的山楊株系和 WT中轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄物的存在。泛素轉(zhuǎn)錄物作為載荷的參考示出。
[0033]圖14.使用乙酸-p-萘酯作為底物測(cè)量的轉(zhuǎn)基因山楊株系和WT山楊的發(fā)育木材 中的酯酶活性。每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和WT的6株樹(shù)木之總活性（可溶性，S和壁結(jié)合，W)的平均 值，條=SE。與WT相比，轉(zhuǎn)基因株系活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加由星號(hào)表示：* = P彡10%; * * = P < 5% (學(xué)生t檢驗(yàn)）。Y-軸代表比活性，以nmol/分鐘/mg為單位。
[0034] 圖15?轉(zhuǎn)基因山楊株系和WT在溫室中的高度（圖A)和直徑（圖B)生長(zhǎng)。條= SE。每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系為10株植物的平均值，而每個(gè)WT為21株植物的平均值。株系5、8和 11顯著較高，而株系4顯著低于WT (學(xué)生t檢驗(yàn)，P彡5% )。沒(méi)有觀察到節(jié)間直徑的顯著 差異。
[0035] 圖16.轉(zhuǎn)基因株系和WT山楊之木材中的總細(xì)胞壁乙酰基含量。每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系 為6個(gè)生物重復(fù)的平均值，而每個(gè)WT為10個(gè)生物重復(fù)的平均值。所有株系都顯示出與WT 相比乙?；康娘@著降低（學(xué)生t檢驗(yàn)），在株系4中下降到WT水平的85%。
[0036] 圖17.通過(guò)木聚糖酶消化轉(zhuǎn)基因和WT山楊木材的細(xì)胞壁制備物而獲得的中性低 聚木糖的MALDI-AP分析。A.木聚糖酶消化產(chǎn)物中較低含量的木四糖和較高含量的木二糖 表明與WT相比轉(zhuǎn)基因株系中木聚糖可及性的增加。
[0037] B.鑒定了包含乙?；闹行缘途厶恰Ｒ阴；笖?shù)計(jì)算為具有確定數(shù)量的每木糖之 乙酰基的乙?；途厶堑膹?qiáng)度百分比乘以總信號(hào)中給定低聚糖的DA。這表明與WT相比，轉(zhuǎn) 基因株系中的乙酰化低聚木糖的相對(duì)含量較低。2個(gè)生物重復(fù)的平均值和SD。
[0038] 圖18.轉(zhuǎn)基因株系和WT山楊中木材的FTIR分析。載荷圖示出了區(qū)別轉(zhuǎn)基因株系 與WT的光譜。注意到，區(qū)別光譜包括1240cm- 1、1370cm-1和1740cm-1處來(lái)自乙?；男盘?hào)示 出轉(zhuǎn)基因株系相比于WT減小，且來(lái)自1659CHT 1處的信號(hào)示出轉(zhuǎn)基因株系相比于WT增加。
[0039] 圖19.通過(guò)在表達(dá)木聚糖酯酶的轉(zhuǎn)基因山楊株系和WT中熱解-GC確定的相對(duì)碳 水化合物（A)和相對(duì)木質(zhì)素（B)含量。對(duì)于轉(zhuǎn)基因株系為八個(gè)生物重復(fù)的平均值SE，或者 對(duì)于WT為21個(gè)生物重復(fù)的平均值SE。關(guān)于碳水化合物含量，通過(guò)AN0VA，株系之間的差異 不是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的（P < 10% )。與WT相比，株系4中S和G木質(zhì)素含量分別減少和增 加，P彡5% (學(xué)生t檢驗(yàn)），而在其他株系中不變。H = H-木質(zhì)素。
[0040] 圖20.在酸預(yù)處理之后，通過(guò)使用離子色譜確定的轉(zhuǎn)基因35S::CE1山楊株系和 WT山楊的糖產(chǎn)率。糖產(chǎn)率：72h水解后每克木材中各種單糖的克數(shù)。誤差條示出標(biāo)準(zhǔn)差。 株系4、5、8、11、17:5個(gè)匯集樣品的平均。WT:5個(gè)樣品的平均。以百分比示出的數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng) 于顯著不同于WT的各個(gè)株系，PS5% (學(xué)生t-檢驗(yàn)）。條上面示出了相對(duì)于WT組合的 所有轉(zhuǎn)基因株系的P值。
[0041]圖20A代表預(yù)處理流體中的糖產(chǎn)率。阿拉伯糖和半乳糖的產(chǎn)率為<0.01g/g。平 均起來(lái)，轉(zhuǎn)基因株系的葡萄糖產(chǎn)率比WT的葡萄糖產(chǎn)率高75%。株系11、17和WT之水解產(chǎn) 物中的甘露糖產(chǎn)率為< 0. 〇lg/g。株系4、5和8的甘露糖產(chǎn)率顯著高于（P < 0. 05)WT的甘 露糖產(chǎn)率。
[0042] 圖20B代表水解產(chǎn)物中的糖產(chǎn)率。阿拉伯糖、半乳糖和木糖的產(chǎn)率為< 0. 01g/g。 平均起來(lái)，轉(zhuǎn)基因株系的葡萄糖產(chǎn)率比WT的葡萄糖產(chǎn)率高10%。
[0043]圖21.酸預(yù)處理后轉(zhuǎn)基因35S : :CE1山楊株系和WT山楊的總糖產(chǎn)率（預(yù)處理和 酶促水解后）。糖產(chǎn)率：72h水解后每克木材中各種單糖的克數(shù)。誤差條顯示標(biāo)準(zhǔn)差。株系 4、5、8、11、17:5個(gè)匯集樣品的平均。訂：5個(gè)樣品的平均。以百分比示出的數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于顯著 不同于WT(P<5%，學(xué)生t檢驗(yàn)）的各個(gè)株系。在條上面示出相對(duì)于WT之組合的所有轉(zhuǎn)基 因株系的P值。圖A代表各種單糖的總產(chǎn)率。阿拉伯糖和半乳糖的產(chǎn)率為<0.01g/g。平 均起來(lái)，轉(zhuǎn)基因株系的葡萄糖產(chǎn)率比WT的葡萄糖產(chǎn)率高13%。株系11、17和WT之水解產(chǎn) 物中的甘露糖產(chǎn)率為< 0. 〇lg/g。株系4、5和8的甘露糖產(chǎn)率顯著高于（P < 0. 05)WT的甘 露糖產(chǎn)率。圖B代表己糖和戊糖形式的總糖產(chǎn)率。己糖的值表明半乳糖、葡萄糖和甘露糖 的總產(chǎn)率。戊糖的值表明阿拉伯糖和木糖的總產(chǎn)率。平均起來(lái)，轉(zhuǎn)基因株系的己糖產(chǎn)率比 WT的己糖產(chǎn)率高14%，而轉(zhuǎn)基因株系的戊糖產(chǎn)率幾乎等于WT的戊糖產(chǎn)率。
[0044] 圖22.來(lái)自于轉(zhuǎn)基因35S : :CE1山楊株系和WT山楊的乙酸產(chǎn)率（g/g)。乙酸的 產(chǎn)率：水解72h后每克木材中乙酸的克數(shù)。誤差條顯示標(biāo)準(zhǔn)差。株系4、5、8、11、17:5個(gè)匯 集樣品的平均。WT:5個(gè)樣品的平均。以百分比示出的數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于顯著不同于WT(P彡5%， 學(xué)生t檢驗(yàn)）的各個(gè)株系。在條上面示出了相對(duì)于WT組合的所有轉(zhuǎn)基因株系的P值。圖 A示出了酸預(yù)處理后預(yù)處理流體中的乙酸產(chǎn)率。平均起來(lái)，株系中的乙酸產(chǎn)率比WT的乙酸 產(chǎn)率低4%。株系4的產(chǎn)率比WT的產(chǎn)率低13%。圖B示出了未經(jīng)預(yù)處理之水解產(chǎn)物中的 乙酸產(chǎn)率。平均起來(lái)，來(lái)自轉(zhuǎn)基因株系的乙酸產(chǎn)率比WT的乙酸產(chǎn)率低4%。株系4的產(chǎn)率 比WT的產(chǎn)率低11%。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0045] 本發(fā)明人已使用真菌（黑曲霉）木聚糖酯酶基因在植物細(xì)胞壁中來(lái)表達(dá)木聚糖酯 酶活性。出乎意料地示出，轉(zhuǎn)基因植物中乙酰木聚糖酯酶的過(guò)表達(dá)降低了木質(zhì)纖維素乙酰 化，而不危及其生長(zhǎng)和纖維素含量，并且與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植物不僅在未經(jīng)預(yù)處理的糖 化作用中，而且在當(dāng)應(yīng)用堿和酸預(yù)處理時(shí)可獲得更高的糖化作用產(chǎn)率。因此所述轉(zhuǎn)基因植 物可用作生物能作物或者用于開(kāi)發(fā)生物能作物。此外，預(yù)期更好的纖維制漿。
[0046]出乎意料地，本發(fā)明顯示，在草本植物（擬南芥）的情況下，根據(jù)相同類(lèi)型的未修 飾植物，使脫乙?；档图s12% (0%至34% )將改善不經(jīng)過(guò)化學(xué)預(yù)處理的糖化作用以及經(jīng) 堿預(yù)處理的糖化作用，并且植物沒(méi)有頑拗現(xiàn)象。其示于圖7和圖10并且歸納在表1中。而 且，本發(fā)明還示出，在木本植物（山楊）的情況下，與未修飾的木本植物相比乙?；档图s 13% (11%至16%)改善了不經(jīng)預(yù)處理和經(jīng)酸預(yù)處理的糖化作用。其在圖16、20和22中 被證明并且歸納在表2中。
[0047] 因此，在第一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了增加植物中糖化作用潛力的方法，所述方法 包括在所述的植物的至少一種細(xì)胞類(lèi)型中過(guò)表達(dá)編碼乙酰木聚糖酯酶多肽的多核苷酸。
[0048] 術(shù)語(yǔ)"糖化作用"意指通過(guò)水解使復(fù)雜碳水化合物或多糖轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單的單糖組分 (例如葡萄糖）的過(guò)程。術(shù)語(yǔ)"糖化作用潛力"意指可從多糖中釋放出來(lái)的單糖的量。特別 地，本發(fā)明的方法可用于改善植物中的葡萄糖產(chǎn)率。
[0049] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生基因修飾植物的方法，所述方法包括在 所述植物的至少一種細(xì)胞類(lèi)型中過(guò)表達(dá)編碼乙酰木聚糖酯酶多肽的多核苷酸。根據(jù)本發(fā) 明，與對(duì)應(yīng)的非基因修飾野生型植物相比，所述植物具有增加的糖化作用。
[0050] 優(yōu)選地，所述方法包括用包含在植物細(xì)胞具有功能之啟動(dòng)子的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化所述細(xì) 胞類(lèi)型，所述啟動(dòng)子與編碼乙酰木聚糖酯酶多肽的多核苷酸有效地連接，并且所述啟動(dòng)子 調(diào)節(jié)過(guò)表達(dá)。
[0051]所述啟動(dòng)子優(yōu)選是CaMV 35S啟動(dòng)子、異位表達(dá)啟動(dòng)子（如泛素啟動(dòng)子），或者在具 有次生細(xì)胞壁的細(xì)胞中表達(dá)的任意類(lèi)型的啟動(dòng)子（如4CL1)。
[0052] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選形式中，所述多核苷酸具有與序列表的SEQIDNO:1同一的 核苷酸序列。然而，所述多核苷酸并不嚴(yán)格限于如SEQIDNO:1所示的序列。相反地，本發(fā) 明涵蓋攜帶修飾（如替換、小缺失、插入或倒位）的多核苷酸，然而其編碼基本上具有根據(jù) 本發(fā)明之乙酰木聚糖酯酶多肽的生物化學(xué)活性的蛋白質(zhì)。例如，所述多核苷酸可與如序列 表中SEQIDN0:1所示的核苷酸序列具有至少60%、70%、80%、90%或95%的同源性。
[0053] 因此，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，所述多核苷酸優(yōu)選地選自：
[0054] (a)包含SEQIDNO:1之核苷酸序列的多核苷酸；
[0055] (b)多核苷酸，其包含在嚴(yán)格雜交條件下能夠與如（a)所限定之多核苷酸的多肽 編碼區(qū)互補(bǔ)之核苷酸序列雜交的核苷酸序列，并且其編碼生物活性的乙酰木聚糖酯酶多肽 或其功能等價(jià)的修飾形式；以及
[0056] (c)多核苷酸，其包含因遺傳密碼子簡(jiǎn)并為如（a)或（b)所限定之核苷酸序列的核 酸序列，并且其編碼生物活性的乙酰木聚糖酯酶多肽或其功能等價(jià)的修飾形式。
[0057] 術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格雜交條件"是在本領(lǐng)域中由標(biāo)準(zhǔn)方案已知的并且可理解為例如在+65°C 下于0. 5M NaHP04、7%十二烷基硫酸鈉（SDS)、lmMEDTA中與濾膜結(jié)合的DNA雜交，并且在 +68°C 下用 0? lxSSC/0. 1% SDS 洗滌。
[0058] 短語(yǔ)"因遺傳密碼簡(jiǎn)并"在本領(lǐng)域是公知的。順序分組的三個(gè)核苷酸（密碼子）編 碼一個(gè)氨基酸。因?yàn)榇嬖?4種可能的密碼子，但是只有20種天然氨基酸，所以大多數(shù)氨基 酸由多于一種的密碼子編碼。該現(xiàn)象稱(chēng)為遺傳密碼的天然"簡(jiǎn)并性"或"豐余性"。因此應(yīng) 理解，序列表中示出的核苷酸序列只是一個(gè)大而確定的序列組的一個(gè)實(shí)例，其將編碼乙酰 木聚糖酯酶多肽。
[0059] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶多肽選自：
[0060] (a)包含如SEQ ID NO :2、3、4或5所示之氨基酸序列的多肽；
[0061] (b)基本上由如SEQIDNO :2、3、4或5所示之氨基酸序列組成的多肽；以及
[0062] (c)由如SEQIDNO :2所示之氨基酸序列組成的多肽。
[0063] 然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，來(lái)自除曲霉屬之外的其他物種的乙酰木聚糖酯酶 也可用于根據(jù)本發(fā)明的方法。例如，本發(fā)明涵蓋使用攜帶修飾（如替換、小缺失、插入或倒 位）的多肽，所述多肽仍然基本上具有乙酰木聚糖酯酶的生物活性。因此，本發(fā)明包括使用 這樣的多肽，其氨基酸序列與如序列表中SEQ ID NO :2、3、4或5所示之氨基酸序列具有至 少 60%、70%、80%、85%、90%或95%的同源性。
[0064] 轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選地選自被子植物和在細(xì)胞壁中具有乙?；揪厶堑钠渌参?，如 楊樹(shù)、桉樹(shù)、柳樹(shù)和禾本科植物（grasses)。
[0065]還包括刺槐（acacia)、角樹(shù)（hornbeam)、山毛棒（beech)、桃花心木（mahogany)、 胡桃（walnut)、橡樹(shù)（oak)、柊樹(shù)（ash)、山胡桃（hichory)、樺（birch)、栗（chestnut)、 豐豈木（alder)、槭樹(shù)（maple)、懸鈴木（sycamore)、銀杏（ginkgo)、棕櫚樹(shù)（palm tree)、香 楓（sweet gum)、柏（cypress)、花旗松（Douglas fir)、冷杉（fir)、紅杉（sequoia)、鐵杉 (hemlock)、雪松（cedar)、刺柏（juniper)、落葉松（larch)、松樹(shù)（pine)、紅杉（redwood)、 云杉（spruce)、紫杉（yew)、竹子、柳枝稷、草蘆（red canary grass)、芒草（Miscantus)物 種和橡膠植物。
[0066] 更優(yōu)選地，所述植物來(lái)自楊柳科，例如來(lái)自柳屬（Salix)和楊屬（Populus)。這些 屬成員已知的常見(jiàn)名稱(chēng)為：柳樹(shù)、楊樹(shù)和山楊。
[0067] 本發(fā)明包括這樣的方法，其中在酶促水解之前用適當(dāng)?shù)脑噭ㄈ缢峄驂A）預(yù)處理 所述植物或所述植物的一部分。
[0068] 本發(fā)明還包括通過(guò)上述方法產(chǎn)生的基因修飾（轉(zhuǎn)基因）植物。特別地，所述基因 修飾植物在所述植物的至少一種細(xì)胞類(lèi)型中過(guò)表達(dá)編碼乙酰木聚糖酯酶多肽的多核苷酸。 根據(jù)本發(fā)明，與對(duì)應(yīng)的非基因修飾野生型植物相比，這樣的植物具有增加的糖化作用潛力。 實(shí)施例
[0069] 實(shí)施例1 :用乙酰木聚糖酯酶基因轉(zhuǎn)化植物
[0070] 使用以下引物擴(kuò)增編碼黑曲霉乙酰木聚糖酯酶的cDNA(SEQ ID NO :1):
[0071] 5'Fc2fuf (caccATGCTATCAACCCACCTCCTCTCGC)(SEQ ID NO:6);以及
[0072] 3' Fc2rls(TCAAGCAAACCCAAACCACTCCATATCCTTATC) (SEQ ID NO :7)。
[0073]使用 TOPO' 克隆系統(tǒng)（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA K2400-20)將獲得 的 PCR 產(chǎn)物克隆到 pENTRTM/D-T()P()K 質(zhì)粒中，然后使用Gateway i克隆系統(tǒng) (Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)轉(zhuǎn)移到 pK2GF7 中（Karimi，M?等.（2〇〇2) Trends Plant Sci. 7(5) :193_195)。通過(guò)電穿孔將所得載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium)菌株 GV3101(pMP90RK)中，并且在具有以下抗生素的LB板上選擇包含質(zhì)粒的菌落：利福平 (10 y g/ml^1)、慶大霉素（30 y g/ml/1)、卡那霉素（30 y g/ml/1)和大觀霉素（50 y g/ml/1)。如 Clough和Bent (1998) Plant J 16:735-743所述地進(jìn)行擬南芥的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。在具有 1%蔗糖和卡那霉素（SOyg/mr1)的1/2MS培養(yǎng)基上選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物。如本領(lǐng)域已知的， 使用莖和葉柄部分通過(guò)相同的農(nóng)桿菌屬菌株轉(zhuǎn)化山楊植物。
[0074] 實(shí)施例2. CE1表達(dá)在擬南芥中的作用
[0075] 在擬南芥中，分析了四個(gè)獨(dú)立的，單獨(dú)插入的純合株系。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)（RT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。株系6c具有最高的轉(zhuǎn)錄物水平（圖1)。
[0076] 轉(zhuǎn)基因株系正常地生長(zhǎng)直到成熟（圖1)。平板上早期的幼苗生長(zhǎng)（MS+蔗糖）沒(méi) 有受到顯著影響。
[0077] 使用pNP底物確定了轉(zhuǎn)基因株系中的木聚糖乙酸酯酶活性。與WT相比，轉(zhuǎn)基因株 系的可溶性蛋白質(zhì)和細(xì)胞壁結(jié)合蛋白質(zhì)部分均具有較高的酯酶活性（圖2)。
[0078] 轉(zhuǎn)基因植物的形態(tài)和生長(zhǎng)與WT植物沒(méi)有可見(jiàn)的不同。我們測(cè)量了最高度表達(dá)的 株系6c的生物質(zhì)。雖然生物質(zhì)沒(méi)有不同，但是從莖到蓮座葉和根存在小的顯著偏移。莖的 水含量略微增加（圖3)。
[0079] 為了檢查引入的轉(zhuǎn)基因是否導(dǎo)致對(duì)生物應(yīng)激的易感性增加，測(cè)試了最高度表達(dá)的 株系6c對(duì)擬南芥的活體營(yíng)養(yǎng)病原體活體營(yíng)養(yǎng)型卵菌（Hyaloperonospora arabidopsidis) 的易感性。將植物暴露于接種體，并記錄由病原體在植物葉片上產(chǎn)生的孢子數(shù)量。轉(zhuǎn)基因 植物表現(xiàn)出比WT植物數(shù)量更少的孢子（圖4)，表明其對(duì)病原體的抗性增加。
[0080] 由于幾種木聚糖缺陷型突變體具有不規(guī)則的木質(zhì)部表型，所以我們使用木質(zhì)部細(xì) 胞浸漬物分析了轉(zhuǎn)基因株系和WT中的木質(zhì)部細(xì)胞形態(tài)（圖5)。沒(méi)有觀察到對(duì)纖維或?qū)Ч?分子大小和形狀的顯著影響。
[0081] 如通過(guò)FT-IR分析所證明的，轉(zhuǎn)基因株系具有改變的莖化學(xué)（圖6)。促進(jìn)WT與轉(zhuǎn) 基因株系分離的光譜包括對(duì)應(yīng)于乙酸酯的三個(gè)波數(shù)：對(duì)應(yīng)于C-0和/或C-0-C的1240CHT 1、 對(duì)應(yīng)于CH3/CH彎曲的1370CHT1以及對(duì)應(yīng)于C = 0的1730CHT1。這些波數(shù)下的信號(hào)表明與 野生型（WT)植物相比，轉(zhuǎn)基因株系中存在較少的乙酸鹽/酯。
[0082] 使用NaOH進(jìn)行皂化后，通過(guò)分析乙酸的釋放確定了莖中的總細(xì)胞壁乙酰基含量。 與WT相比，高度表達(dá)的株系6c顯示出乙酸釋放減少30% (圖7)。
[0083] 為了檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因?qū)δ揪厶且阴；淖饔?，?duì)木聚糖酶水解后得自于轉(zhuǎn)基因株系和 WT之細(xì)胞壁的低聚木糖進(jìn)行了 MAIDI-AP分析。圖8示出了由木聚糖酶放出的不同中性低 聚糖。當(dāng)乙?；鶄?cè)鏈存在時(shí)，一些木聚糖不能被消化為木二糖和木三糖，而是如圖8A所示 放出木四糖。因此，乙?；礁撸舅奶窍啾扔谀径呛湍救蔷驮蕉?。根據(jù)該分析，WT莖 材料具有比最弱的轉(zhuǎn)基因株系（la)多至少兩倍的木四糖。最強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因株系6c沒(méi)有任何 木四糖。
[0084] 檢測(cè)了不同乙酰化的低聚木糖，并且計(jì)算了其相對(duì)于低聚物總含量的總相對(duì)含量 作為乙酰化指數(shù)（圖8B)。這顯示轉(zhuǎn)基因株系中的木聚糖乙酰化程度降低，并且最受影響的 株系是株系6c。
[0085] 為了驗(yàn)證除木聚糖以外，過(guò)表達(dá)CE1酶的植物中乙?；慕档褪欠襁€涉及其他聚 合物，我們通過(guò)MALDI-T0F分析了用木葡聚糖特異性葡聚糖酶消化的細(xì)胞壁材料的低聚糖 組成（圖9)。在木葡聚糖中，在一些側(cè)鏈中存在的吡喃半乳糖殘基上發(fā)現(xiàn)乙?；セ鶊F(tuán)。所 述分析顯示W(wǎng)T包含比株系6c多的含有半乳糖的乙酰化低聚木糖葡萄糖。所述結(jié)果表明除 了木聚糖，過(guò)表達(dá)CE1酶的轉(zhuǎn)基因株系的細(xì)胞壁中乙?；康臏p少還涉及木葡聚糖。這 個(gè)結(jié)果表明了用于轉(zhuǎn)基因株系的CE1酶的寬特異性。
[0086] 使用三種不同類(lèi)型的預(yù)處理方案進(jìn)行擬南芥莖木質(zhì)纖維素的糖化作用：用0. 5M NaOH進(jìn)行化學(xué)預(yù)處理（堿預(yù)處理），用1 % 1^04進(jìn)行化學(xué)預(yù)處理（酸預(yù)處理），以及無(wú)化學(xué) 預(yù)處理一一在糖化作用之前僅使用熱水（水預(yù)處理）（圖10)。在堿和水預(yù)處理的情況下， 轉(zhuǎn)基因株系比WT釋放更多的糖。
[0087] 通過(guò)真菌云芝（Trametes versicolor)進(jìn)行的乙醇生產(chǎn)由株系6c植物或WT植物 制備的木質(zhì)纖維素提供。在糖化-發(fā)酵周期中，使真菌在流體培養(yǎng)基中消化和發(fā)酵木質(zhì)纖 維素?cái)?shù)天的時(shí)間。從兩種類(lèi)型的木質(zhì)纖維素產(chǎn)生乙醇并且培養(yǎng)5天后在培養(yǎng)基中檢測(cè)到乙 醇。與由WT材料產(chǎn)生相比，當(dāng)使用來(lái)自株系6c的木質(zhì)纖維素時(shí)乙醇的產(chǎn)率增加了 30%至 50%。同時(shí)，所述培養(yǎng)基包含水平降低的乙酸一一已知的發(fā)酵和微生物生長(zhǎng)的抑制劑。
[0088] 通過(guò)熱解-GC分析莖化學(xué)組成。該分析顯示出轉(zhuǎn)基因株系與WT之間的碳水化合物 或木質(zhì)素含量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異（圖11)。在兩個(gè)選擇的株系（株系4a和6c)中， 通過(guò)UpdegrafT纖維素分析和Klason木質(zhì)素分析進(jìn)一步確定了這些數(shù)據(jù)（圖12)。這些數(shù) 據(jù)共同表明，轉(zhuǎn)基因株系中較高的糖化作用值是由于較高的糖轉(zhuǎn)化，即，具有類(lèi)似碳水化合 物和木質(zhì)素含量之材料的更有效的糖化作用過(guò)程。
[0089] 總之，來(lái)自擬南芥CE1家族的真菌乙酰木聚糖酯酶的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致植物具有降低的 木聚糖乙酰化。擬南芥的至少兩個(gè)基體聚合物：木聚糖和XG中的乙酰基降低了，表明過(guò)表 達(dá)酶的廣譜作用。因此，在沒(méi)有化學(xué)預(yù)處理以及在堿預(yù)處理的情況下都觀察到更高的糖化 作用。因此，轉(zhuǎn)基因植物結(jié)合了更高的乙醇生產(chǎn)潛力，但是具有正常的生長(zhǎng)和正常的纖維素 和木質(zhì)素含量，以及對(duì)所測(cè)試活體營(yíng)養(yǎng)病原體抵抗性的增加。
[0090] 實(shí)施例3 :CE1表達(dá)在雜交山楊中的作用
[0091] 在雜交山楊（歐洲山楊X顫楊，Populus tremula x tremuloides)克隆T89中用 相同真菌構(gòu)建體進(jìn)行了類(lèi)似實(shí)驗(yàn)。獲得了存在木聚糖酯酶轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)基因株系（圖13)，將 其在溫室中繁殖和栽培。當(dāng)我們使用底物乙酸-P-萘酯作為底物測(cè)試轉(zhuǎn)基因株系中的酯酶 活性時(shí)，所有的株系都顯示出與WT相比增加的酶活性，并且在壁結(jié)合部分中活性增加（圖 14)。在一些株系中植物的生長(zhǎng)受到輕微影響（圖15)。高度生長(zhǎng)在株系5、8和11中增加， 在株系4中減小，與酶活性沒(méi)有任何關(guān)系。直徑生長(zhǎng)沒(méi)有受到顯著影響。
[0092] 與WT相比，所有轉(zhuǎn)基因株系中木材的總細(xì)胞壁乙?；慷冀档土?，在株系4中 降到WT水平的85% (圖16)。
[0093] 通過(guò)MALDI-AP分析木聚糖乙?；?。分析顯示出在所有轉(zhuǎn)基因株系中木聚糖的乙 酰化水平都降低了（圖17)。
[0094] 通過(guò)FT-IR進(jìn)一步分析木材的化學(xué)。圖18示出了載荷圖，所述圖示出了分離WT 與轉(zhuǎn)基因株系的光譜。在半纖維素與纖維素中可以看到在899CHT 1帶-C-H彎曲強(qiáng)度的主要 差異，其在WT中更豐富，以及對(duì)應(yīng)于吸附水的1650HT1處的強(qiáng)度，其在WT中更少。對(duì)應(yīng)于乙 ?；墓庾V（1240U370和1740CHT 1)在WT中更強(qiáng)烈，表明其與轉(zhuǎn)基因株系相比具有更高的 乙?；?。
[0095]山楊木材的熱解-MS分析在轉(zhuǎn)基因株系的碳水化合物光譜中沒(méi)有展現(xiàn)任何變化 (圖19A)。除了株系4外，S、G和H木質(zhì)素的光譜都沒(méi)有變化，株系4顯示出與WT相比G 木質(zhì)素輕微增加并且S木質(zhì)素減少（圖19B)。
[0096] 通過(guò)使用以下兩種不同的方法研宄了山楊木材的糖化作用：（1)不經(jīng)預(yù)處理的酶 促水解（圖20A)，以及（2)酸預(yù)處理后進(jìn)行酶促水解（圖20B)。使用離子色譜測(cè)定單糖產(chǎn) 率（阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖）。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因山楊株系顯示出改 善的葡萄糖生產(chǎn)速率和改善的葡萄糖產(chǎn)率（圖20)。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因株系4、5和8還 顯示出顯著增加的甘露糖產(chǎn)率（圖21A)。
[0097] 用經(jīng)酸預(yù)處理的山楊進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致了葡萄糖的高產(chǎn)率，并且在這些條件下轉(zhuǎn)基 因株系具有更高的糖化作用潛力（圖20和21)。假設(shè)葡聚糖含量為約55%，則理論的最大 葡萄糖產(chǎn)率將為0. 61g葡萄糖/g木材（干重），并且這個(gè)水平下的產(chǎn)率是可能達(dá)到的（圖 21)。平均地，轉(zhuǎn)基因株系的葡萄糖總產(chǎn)率比WT的葡萄糖總產(chǎn)率高13% (圖21)。從工業(yè) 觀點(diǎn)來(lái)看，達(dá)到高總糖產(chǎn)率是至關(guān)重要的，因此值得注意的是轉(zhuǎn)基因植物在那種類(lèi)型的實(shí) 驗(yàn)中表現(xiàn)得很好。
[0098] 研宄了轉(zhuǎn)基因株系和野生型山楊不經(jīng)預(yù)處理和經(jīng)酸處理的乙酸產(chǎn)率（圖22)。株 系4顯示出顯著低于野生型的乙酸產(chǎn)率。
[0099] 表1.表示為WT值之％的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的值（WT值=100% )。
[0100]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于增加植物中之糖化作用潛力的方法，所述方法包括在所述植物的至少一種 細(xì)胞類(lèi)型中過(guò)表達(dá)編碼乙酰木聚糖酯酶多肽的多核苷酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其用于改善所述植物的葡萄糖產(chǎn)率。
3. -種用于產(chǎn)生基因修飾植物的方法，其包括在所述植物的至少一種細(xì)胞類(lèi)型中過(guò)表 達(dá)編碼乙酰木聚糖酯酶多肽的多核苷酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中與對(duì)應(yīng)的非基因修飾野生型植物相比，所述植物 具有增加的糖化作用潛力。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法包括用包含在植物細(xì)胞中具有 功能之啟動(dòng)子的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞類(lèi)型，所述啟動(dòng)子與編碼乙酰木聚糖酯酶多肽的多核 苷酸有效地連接，并且所述啟動(dòng)子調(diào)節(jié)過(guò)表達(dá)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述啟動(dòng)子是CaMV 35S啟動(dòng)子。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多核苷酸選自： (a) 包含SEQ ID NO :1之核苷酸序列的多核苷酸； (b) 多核苷酸，其包含能夠在嚴(yán)格雜交條件下和與如（a)所限定的多核苷酸之多肽編 碼區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，并且所述核苷酸序列編碼生物活性的乙酰木聚 糖酯酶多肽或其功能等價(jià)的修飾形式；以及 (c) 多核苷酸，其包含因遺傳密碼簡(jiǎn)并為如（a)或（b)所限定之核苷酸序列的核酸序 列，并且所述核酸序列編碼生物活性的乙酰木聚糖酯酶多肽或其功能等價(jià)的修飾形式。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶多肽選自： (a) 包含如SEQ ID NO :2、3、4或5所示之氨基酸序列的多肽； (b) 基本上由如SEQ ID NO :2、3、4或5所示之氨基酸序列組成的多肽；以及 (c) 由如SEQ ID NO :2、3、4或5所示之氨基酸序列組成的多肽。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物選自被子植物和在其細(xì)胞 壁中具有乙酰化木聚糖的其他植物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述植物是楊柳科（Salicaceae)植物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中在酶促水解之前用適當(dāng)?shù)脑噭┤?酸或堿預(yù)處理所述植物或所述植物的一部分。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其用于增加所述植物對(duì)病原體的抗性。
13. 基因修飾的植物，其根據(jù)權(quán)利要求3至12中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生。
14. 基因修飾的植物，其在所述植物的至少一種細(xì)胞類(lèi)型中過(guò)表達(dá)編碼乙酰木聚糖酯 酶多肽的多核苷酸。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的基因修飾的植物，其中與對(duì)應(yīng)的非基因修飾野生型植物相 比，所述植物具有增加的糖化作用潛力。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述的基因修飾的植物，其中與對(duì)應(yīng)的非基因修飾 野生型植物相比，所述植物具有增加的葡萄糖產(chǎn)率。
【文檔編號(hào)】A01H1/00GK104520430SQ201380014014
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月14日
【發(fā)明者】普拉尚·莫漢·帕瓦爾, 瑪爾塔·德?tīng)柊?馬切盧奇, 埃瓦·J·梅萊羅維奇, 馬達(dá)維·萊瑟·岡拉, 利夫·瓊森 申請(qǐng)人:瑞典樹(shù)木科技公司