殺蟲黃桿菌菌株和生物活性組合物、代謝物和用途
【專利摘要】本發(fā)明提供殺蟲黃桿菌(Flavobacterium)菌株和自其衍生的生物活性組合物和代謝物，以及其用于控制害蟲的使用方法。
NRRL B-50584
20111014
【專利說明】殺蟲黃桿菌菌株和生物活性組合物、代謝物和用途

【技術領域】
[0001] 本文中公開殺蟲黃桿菌菌株和自其衍生的生物活性組合物和代謝物，和其用于控 制害蟲和促進植物生長，尤其是根部健康的使用方法。

【背景技術】
[0002] 天然產物是借由微生物、植物和其它有機體產生的物質。微生物天然產物提供豐 富的化學多樣性來源，且存在出于醫(yī)藥目的利用天然產物的較長歷史。盡管著重于天然產 物用于人類治療法，其中超過50 %衍生自天然產物，但是僅11 %的殺蟲劑衍生自天然來 源。盡管如此，天然產物殺蟲劑具有在常規(guī)和有機農場兩者中在控制害蟲方面起到重要作 用的可能性。借由微生物（細菌、放線菌和真菌）產生的二級代謝物提供新穎化學化合物， 其可以單獨使用或與已知化合物組合使用以有效控制害蟲且降低耐藥性發(fā)展的風險。存在 若干成功作為農業(yè)殺昆蟲劑的微生物天然產物的眾所周知的實例（湯普森（Thompson)等 人，2000 ;阿里納（Arena)，1995 ;克里格（Krieg)等人，1983)。
[0003] 微生物殺蟲劑的發(fā)展自在純培養(yǎng)物中分離微生物開始。其隨后在溫室和在田野里 使用活體外、活體內或中試規(guī)模試驗繼續(xù)進行功效和波譜篩選。同時，借由微生物產生的活 性化合物經分離和識別。為了微生物殺蟲劑的商業(yè)化，微生物必須借由在工業(yè)規(guī)模下發(fā)酵 且與生物相容性和經批準的添加劑一起調配來經濟地生產，以增加功效且使方便應用最大 化。
[0004] 線蟲是無體節(jié)、兩側對稱、蠕蟲類無脊椎動物，其擁有體腔和完整的消化系統(tǒng)，但 不具有呼吸和循環(huán)系統(tǒng)。其體壁含有多層表皮、具有四條縱向帶的下皮層，和內部肌肉組織 (奇特伍德（Chitwood)，2003)。其身體內含物大部分被消化和生殖系統(tǒng)占據(jù)。線蟲可以歸 類為寄生的或獨立生存的。寄生線蟲可以借由其宿主（例如，植物寄生蟲）歸類。獨立生 存的線蟲可以根部據(jù)其攝食習慣歸類，且包括以下組：（1)雜食動物；（2)食細菌動物；（3) 食真菌動物；和（4)捕食動物。
[0005] 植物寄生線蟲大體上攝食植物的地下部分，諸如根部、球莖和塊莖，和植物的地 上部分，諸如葉子和莖。每年由植物寄生線蟲造成的農作物損失已經估計超過1000億 美元（肯寧（Koenning)等人，1999)。植物寄生線蟲的實例包括但不限于屬于以下屬的 線蟲：根結線蟲屬（Meloidogynespp.)(例如，根節(jié)線蟲）；短體線蟲屬（Pratylenchus spp.)(例如，根腐線蟲）；異皮線蟲屬（Heteroderaspp.)(例如，胞囊線蟲）；胞囊線蟲屬 (Globoderaspp.)(胞囊線蟲）；莖線蟲屬（Ditylenchusspp.)(例如，莖及球莖線蟲）； 墊刃線蟲屬（Tylenchulusspp.)(例如，柑桔線蟲）、劍線蟲屬（Xiphinemaspp.)(例如， 短劍線蟲）、內侵線蟲屬（Radopholusspp.)(穿孔線蟲）；腎形線蟲屬（Rotylenchulus spp.)(例如，腎形線蟲）；螺旋線蟲屬（Helicotylenchusspp.)和盾線蟲屬（Scutellonema spp.)(例如，螺旋線蟲）；刺線蟲屬（Belonolaimusspp.)(例如，刺線蟲）；傘滑刃線蟲屬 (Bursaphelenchusspp.)(例如，松木線蟲）；矛線蟲屬（Hoplolaimusspp.)(矛線蟲）、長 針線蟲屬（Longidorusspp.)(針線蟲）；珍珠線蟲屬（Nacobbusspp.)(假根結線蟲）；和 滑刃線蟲屬（Aphelenchoidesspp.)(葉面線蟲）。控制線蟲最有效的手段是通過殺線蟲 劑，其抑制卵孵化、幼體活動性和/或植物傳染性。對于植物寄生線蟲的化學控制的發(fā)展是 具挑戰(zhàn)性的，因為環(huán)境和生理原因兩者：（1)大部分植物寄生線蟲存活在靠近根部的土壤 中的受限制區(qū)域中，因此遞送化學殺線蟲劑是困難的，且（2)線蟲的外部表面是不良的生 物化學靶標，且對于多個有機分子是不可滲透的（奇特伍德，2003)。此外，借由經口路徑遞 送毒性化合物是幾乎不可能的，因為大部分植物寄生線蟲物種僅在其已經滲透且感染植物 根部之后攝入物質。因此，殺線蟲劑已經傾向于廣譜毒素，其具有高揮發(fā)性或具有促進其在 土壤中的活動性的其它化學和物理性質。
[0006] 在過去的十年間，鹵化烴（例如，二溴化乙烯、甲基溴）一直是全世界最大量使 用的殺線蟲劑。歸因于其高人類毒性和對于臭氧層的平流層臭氧層的有害影響，這些化 合物在蒙特利爾議定書（MontrealProtocol)中被禁止，但使用甲基溴用于控制線蟲和 植物病原體在美國得以延長，歸因于缺乏替代產物。連同有機磷酸酯一起，氨基甲酸酯是 最有效的非熏劑殺線蟲劑。不幸的是，諸如涕滅威（aldicarb)和草氨酰的大部分氨基甲 酸酯也是高毒性的。到2010年8月，涕滅威的制造商拜耳（Bayer)已經同意在美國取消 對于馬鈴薯和柑桔的所有產品注冊，且截至2018年8月末，涕滅威將被完全淘汰。最近， 阿維菌素（abamectin)--由土壤放線菌（soilactinomycete)、鏈霉菌（Streptomyces avermitilis)產生的兩個阿維菌素（avermectin)的混合物--已經注冊用于殺線蟲用途 (Faske和Starr，2006)。先正達（Syngenta)以商標名Avicta?將這一活性成份作為用于棉 花和蔬菜的種子處理劑出售。
[0007] 已經報道若干微生物植物/線蟲病原體對植物寄生線蟲呈活性（蓋瑞拉 (Guerena)，2006)。這些生物控制劑包括細菌蘇云金桿菌（Bacillusthuringiensis)、 洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderiacepacia)、穿刺巴斯德柄菌（Pasteuriapenetrans) 和巴氏桿菌（P.usgae)。巴斯德生物科學（PasteuriaBiosciences)已經在美國東 南部啟動用巴氏桿菌對抗草皮上的刺線蟲。殺線蟲真菌包括但不限于：哈茨木霉菌 (Trichodermaharzianum)、洛斯里被毛抱（Hirsutellarhossiliensis)、明尼蘇達被毛 抱（H.minnesotensis)、厚垣抱普可尼亞菌（Pochoniachlamydosporia)(同義詞：厚壁抱 子輪枝菌）、指狀節(jié)叢抱菌（Arthrobotrysdactyloides)和淡紫擬青霉（Paecilomyces lilanicus)(由Prophyta以BioAct1"和McloCor/出售）。另一真菌（殺死的真菌），琉孢 漆斑菌可在Valent生物科學的商業(yè)調配物DiTem?中獲得。
[0008]其它商業(yè)的生物殺線蟲劑包括Deny?:和BlueCircle# (洋蔥伯克霍爾德菌）、 八ctivatc? (堅強芽孢桿菌）（Quarles，2005)和以色列產品BioNem? (堅強芽孢桿菌） (現(xiàn)在由拜耳以種子處理劑VOTiVC^'出售）（特雷夫（Terefe)等人，2009)。已經假設，微 生物分離物對于線蟲卵孵化、幼體活動性和傳染性的有害影響可以歸因于由這些有機體產 生的毒素（霍爾曼（Hallman)和西科拉（Sikora)，1996 ;瑪洛恩妮（Marrone)等人，1998 ; 西迪基（Siddiqui)和馬哈茂德（Mahmood)，1999;賽克森納（Saxena)等人，2000;邁爾 (Meyer)和羅伯茨（Roberts)，2002)、寄生或甚至捕獲線蟲的能力（西迪基和馬哈茂德， 1996;克里（Kerry)，2001 ;杰斐（Jaffee)和馬爾登（Muldoon)，1995)、全身性耐藥性的感 應（哈斯基-鞏特爾（Hasky-Gunther)等人，1998)、改變線蟲行為（西科拉和霍夫曼-赫 加特（Hoffman-Hergarter)，1993)或干擾植物識別（奧斯登多普（Oostendorp)和西科拉， 1990)〇
[0009] 諸如植物提取物和精油的植物殺線蟲劑可以用于控制線蟲（考克里斯-布雷爾 (Kokalis-Burrelle)和羅德里格-卡巴納（Rodriguez-Kabana)，2006)。奇特伍德已經 在其近期的回顧文章中概括使用植物衍生化合物進行線蟲控制的選擇方案（奇特伍德， 2002)。西迪基（Siddiqui)和阿拉姆（Alam) (2001)展示，經來自尼姆樹（neemtree)(印 楝（Azadirachtaindicd))和楝樹（Chinaberrytree)(苦楝（Meliaazadirah))的植物 部分改善的盆栽土可抑制蕃茄的根節(jié)線蟲發(fā)展。然而，在美國目前沒有經注冊用于對抗線 蟲用途的尼姆產品。一種來自智利(Ncma-Qu)的新植物產品最近已經通過美國環(huán)境保護 局（USEPA)注冊為有機殺線蟲劑且被有機物質檢查委員會（OrganicMaterialsReview Institute，0MRI)列舉可用于有機耕種，所述新植物產品基于阜皮樹（Quillajasaponaria tree)提取物，含有皂苷（經C-3下的三糖和經C-28中的寡糖取代的皂樹酸的雙鏈衍生 物）。其由Brandt出售。
[0010] 對非宿主農作物實行輪作本身常常足夠防止線蟲群體達到經濟損害水平（蓋瑞 拉2006)。變異化學物質是由植物產生的化合物，其在植物環(huán)境中影響有機體的行為。殺 線蟲的變異化學物質的實例包括聚噻吩、硫代葡萄糖苷、生物堿、脂質、萜類化合物、類固 醇、三萜系化合物和酚醛樹脂（考克里斯-布雷爾和羅德里格-卡巴納，2006 ;奇特伍德， 2002)。當作為覆蓋農作物生長時，來自異株克生植物的生物活性化合物在生長周期期間滲 出和/或在生物質分解期間釋放到土壤中。蕓苔農作物可以用于生物熏蒸一一一種基于在 土壤并入組織分解期間的殺菌揮發(fā)物的釋放的害蟲管理策略（柯克加德（Kirkegaard)和 薩瓦爾（Sarwar)，1998)。然而，羅伯特索瓦（Roubtsova)等人（2007)對于腐爛椰菜組織對 南方根結線蟲數(shù)量的影響的研宄表明，為了適當控制，必需將植物組織與全部線蟲感染土 壤體積徹底混合。
[0011] 在農業(yè)土壤中控制線蟲的未來依賴于兩個因素：線蟲抗性農作物的發(fā)展，和新的、 廣譜、毒性較低的殺線蟲劑的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展。研宄、發(fā)展和注冊新的化學殺線蟲劑的成本是極 高的（>2億美元），其限制了其發(fā)展。在1967年到1997年經注冊用作殺蟲劑的497種新 的活性成分中，僅有七個注冊為殺線蟲劑（阿斯博林（Aspelin)和格魯伯（Grube)，1999)。 除常規(guī)化學方法以外，已經提議將核糖核酸干擾（RNAinterference，RNAi)作為控制線蟲 的方法。通過RNAi使用基因沉默首次在秀麗隱桿線蟲上展示，且最近也用于諸如根結線蟲 屬的植物寄生線蟲。（巴赫提亞（Bakhetia)等人，2005)。搜索新的微生物菌株以用作生 物殺線蟲劑的來源是重要目標，以便于降低由植物寄生線蟲造成的大量經濟損害和降低目 前經注冊的用于線蟲控制的毒性化合物的使用。
[0012] 根部據(jù)薩瑟（Sasser)和弗萊克曼（Freckman) (1987)，在全世界由線蟲造成的農 作物損失對于主要農作物在8%到20%范圍內。植物寄生線蟲可以造成相當大的農作物損 害，在世界范圍內每年的損失估計有870億美元（董（Dong)和張（Zhang)，2006)。諸如甲 基溴的熏劑在控制土傳植物病和線蟲方面是非常有效的，但是歸因于較高哺乳動物毒性、 臭氧消耗效應和其它殘留效應，甲基溴的使用已經在不同國家中被禁止，且國際協(xié)定計劃 將其完全撤出市場（歐卡（Oka)等人，2000)。諸如碘代甲烷、1，3-二氯丙烯和三氯硝基甲 烷的化學替代方案也具有哺乳動物和環(huán)境安全方面的問題?；瘜W非熏劑殺線蟲劑正在被淘 汰和禁止。最近，美國環(huán)境保護局宣布正在淘汰涕滅威。
[0013] 黃桿菌屬和自其產生的產品的用途
[0014] 革蘭氏陰性菌（gramnegativebacterium)黃桿菌屬是黃桿菌科的成員（伯納黛 特（Bernardet)等人，2006a和2006b綜述）。已經發(fā)現(xiàn)黃桿菌屬的物種對魚類、藻類和土 壤有機體呈病原性。已經發(fā)現(xiàn)黃桿菌屬產生多種酶，其涉及瓊脂、藻酸鹽、甲殼素、果膠木聚 糖、角蛋白、昆布糖的降解。舉例而言，認為降解多糖的酶可以由黃桿菌屬產生。這些酶可 以降解例如不同病原體的細胞壁。黃桿菌屬也可以產生蛋白酶。最近，也已經發(fā)現(xiàn)黃桿菌 屬產生抗真菌化合物，其可以用來控制香蕉病原體。
[0015] 已經發(fā)現(xiàn)黃桿菌屬的物種產生多種化合物。在這一屬中的一些物種能夠氧化廣泛 范圍的芳香族烴（舉例而言，參見巴恩斯利（Barnsley)，E.，1988)。
[0016] 發(fā)現(xiàn)黃桿菌屬SC12154的發(fā)酵產生脫乙酰氧基頭孢菌素C和新穎7-經取代的頭 胞菌素的混合物（辛格（Singh)等人，1984)，其據(jù)報道展現(xiàn)弱抗菌活性。兩種具有抗脫 氧核糖核酸（DNA)聚合酶的抑制活性的磺酸脂F(xiàn)lavocristamideA和B自海洋細菌黃桿 菌屬分離（小林（Kobayashi)等人，1995)，所述海洋細菌黃桿菌屬自海洋雙殼貝褶紋冠蚌 (bivalveCristariaplicata)分離。報道了屬于（0-內酰胺抗菌素類的chitinovorins A、B和C自黃桿菌chitinovorum的培養(yǎng)物培養(yǎng)液的分離和識別（莊司（Shoji)等 人，1984)。稱為chitinovorinD的更強堿性的抗菌素隨后自黃桿菌屬PB-5246分離，連 同已知的chitinovorinA、B和C一起（莊司等人，1985)。新穎血管性血友病因子（von Willebrandfactor，vWF)受體詰抗劑SulfobacinA和B自金黃桿菌屬（Chyseobacterium sp.)的培養(yǎng)物培養(yǎng)液分離，隨后經報道為黃桿菌屬NR2993 (神山（Kamiyama)等人，1995) 〇 新極性胡蘿卜素硫酸鹽自海洋細菌，識別為黃桿菌屬的菌株PC-6分離，且經指定為 (2R，3S，2'R，3 ^R) -4-酮基念珠藻黃素-3'-硫酸鹽和（2R，3S，2'R，3 ^R)-念珠藻黃 素-3-硫酸鹽（橫山（Yokoyama)等人，1996)?；谫|譜法和化學修飾闡明自腦膜炎敗血性 黃桿菌IF012535 (加藤（Kato)等人，1998)的脂多糖組分的脂質A的化學結構。新穎-單 ?；视妥愿锾m氏陰性菌典型海水黃桿菌ATCC19260分離，連同其它糖脂和磷脂一起（八 木（Yagi)和丸山（Maruyama)，1999)。發(fā)現(xiàn)細胞菌屬-黃桿菌屬-擬桿菌的北極細菌產 生若干揮發(fā)性有機化合物（迪克查特Oickschat)等人，2005)，其受甲基酮支配。甲基酮 為脂肪族飽和或不飽和的，且含有12-18個碳原子，有時具有末端甲基分支。
[0017] 除了以上代謝物以外，其它來自黃桿菌屬的已知化合物是myxol(橫山 (Yokoyama)等人，1995)，是屬于類胡蘿卜素類的化合物，其已經先前經報道來自藍綠 藻泥污顫藻（弗朗西斯（Francis)等人，1970);來自黃桿菌屬脫氫酶（利奧恩-延森 (Liaaen-Jensen)等人，1968)的雙環(huán)C5(l胡蘿卜素二醛癸異戊二烯黃素，其隨后歸因于其 引起關注的結構經合成（弗雷佐（Ferezou)和朱麗亞（Julia)，1985)。
[0018] 此外，也已經發(fā)現(xiàn)，自干旱土壤樣品分離的產生生物表面活性劑的黃桿菌屬菌 株MTN11(登記號AY162137)產生黃脂，其為非常極性的且是良好的乳化劑（博杜爾 (Bodour)，2004)。實例包括關節(jié)菌素和氣桿菌素。已經提議這些黃脂可以在被污染的土壤 中使用以在有機生物降解期間減輕金屬毒性（卡普蘭（Kaplan)和基茨（Kitts)，2004)。確 切地說，卡普蘭和基茨（2004)發(fā)現(xiàn)歸于來自16SrRNA基因序列的黃桿菌屬和假單胞菌屬 的有機體存在于被石油烴污染的土壤中，尤其是在這些石油烴的降解階段期間。


【發(fā)明內容】

[0019] 本文中提供包含黃桿菌屬菌株的新穎用途和組合，且明確地說，組合物。
[0020] 在一具體實施例中，黃桿菌屬菌株可以具有以下特征：
[0021] (A)16SrRNA基因序列，其包括：正向序列，其對SEQIDNO:3中闡述的序列具有 至少99%的一致性；和反向序列，其對SEQIDN0:4中闡述的序列具有至少99%的一致性； 和共有序列，其對SEQIDNO:5中闡述的序列具有至少99%的一致性；
[0022] (B)殺蟲活性；
[0023] (C)生長調節(jié)，且尤其是生長促進活性；
[0024] (D)產生殺蟲化合物，其具有以下性質：（1)具有約150-195的分子量，其借由液相 色譜法 / 質譜法（LC/MS)確定；（2)具有S7. 60、7. 52、6. 83、6. 68、2. 74、L14 的1HNMR值， 且具有 203. 96、161. 90、145. 11、13L78、131. 78、127. 28、123. 83、117. 24、117. 24、34. 52、 8. 89 的13CNMR值；（3)在反相C-18HPLC(Phenomenex，Luna5yC18 (2) 100A，100X4. 60mm) 柱上具有約8-14分鐘的高壓液相色譜（HPLC)滯留時間，所述柱使用在0. 5mL/min流動速 率和210nm的UV檢測下的水：乙腈（CH3CN)梯度溶劑系統(tǒng)（0-20min;90-0%含水CH3CN， 20-24min;100%CH3CN，24-27min;0-90%含水CH3CN，27-30min;90%含水CH3CN);
[0025] (E)對于脊椎動物是非病原性的；
[0026](F)對四環(huán)素（tetracycline)、紅霉素（erythromycin)、鏈霉素（streptomycin)、 青霉素（penicillin)、氨節(jié)西林（ampicillin)、 土霉素（Oxytetracycline)、氯 霉素（Chloramphenicol)、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin)、慶大霉素（Gentamicin)、 哌拉西林（Piperacillin)、亞胺培南（Imipenem)和磺胺甲惡挫-甲氧節(jié)啶 (Sulphamethoxazole-Trimethoprim)敏感。
[0027] 明確地說，黃桿菌物種是黃桿菌菌株，其具有黃桿菌屬H492(NRRL寄存號第 B-50584號）的識別特征。因此，在一有關方面中，提供所述黃桿菌菌株。
[0028] 也提供實質上純的培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液，其包含所述菌株或衍生自所述黃桿菌 菌株的細胞碎片、濾液、上清液、提取物和/或化合物，或衍生自所述菌株、實質上純的培養(yǎng) 物、全細胞培養(yǎng)液、細胞碎片、濾液、上清液和/或提取物的化合物（例如，代謝物）。進一 步提供一組合物，其包含所述實質上純的培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)物或全細胞培 養(yǎng)液包含所述菌株或衍生自這一黃桿菌菌株的細胞碎片、濾液、上清液、化合物和/或提取 物，和載劑、稀釋劑、表面活性劑、載劑、表面活性劑或佐劑。
[0029] 因此，本文中提供在植物中調節(jié)害蟲侵擾的方法，其包含：向植物和/或其種子和 /或用于生長所述植物的基質施加一定量的實質上純的培養(yǎng)物、全細胞培養(yǎng)液，其包含黃桿 菌物種菌株、或衍生自所述黃桿菌物種菌株的細胞碎片、濾液、上清液、提取物和/或化合 物（包括但不限于一或多種代謝物），或衍生自所述實質上純的培養(yǎng)物、全細胞培養(yǎng)液、細 胞碎片、濾液、上清液和/或提取物的化合物（例如，代謝物），和任選地以有效調節(jié)所述害 蟲侵擾的量的另一殺線蟲物質。在一具體實施例中，所述害蟲是線蟲。在一更具體的實施 例中，害蟲是植物寄生線蟲。
[0030] 本文中也提供對于至少一種害蟲的殺蟲組合協(xié)同，其包含如下活性組分：（a)實 質上純的培養(yǎng)物、全細胞培養(yǎng)液，其包含黃桿菌物種菌株或衍生自所述菌株或衍生自所述 實質上純的培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液的細胞碎片、濾液、上清液、提取物或化合物（例如，代 謝物），其包含所述黃桿菌物種菌株，和（b)另一殺蟲物質，其中（a)和（b)以協(xié)同量存在。 在一具體實施例中，所述害蟲可以是線蟲，但還可以包括，但不限于，害蟲、植物真菌、植物 病毒和植物細菌和野草。此外，所述組合可以是組合物。其它殺蟲物質可以是（a)衍生自 微有機體；(b)天然產品和/或（b)化學殺蟲劑，且明確地說，化學殺昆蟲劑或殺線蟲劑。
[0031] 在一有關方面中，本文中提供在植物中或對植物協(xié)同調節(jié)至少一種害蟲或害蟲物 種侵擾的方法，其包含：以有效調節(jié)所述害蟲或害蟲物種感染的所述組合的量向植物和/ 或其種子和/或用于生長所述植物的基質施加上文闡述的組合。本文中也提供可自黃桿菌 物種獲得或自其衍生的經分離的化合物，或作為替代方案，能夠產生可以用于控制不同害 蟲，和/或也尤其是殺線蟲害蟲的這些化合物的有機體。
[0032] 進一步提供在植物（例如，諸如水果（例如，草莓、香蕉、西瓜、漿果）的農作物）、 蔬菜（例如，番茄、黃瓜、南瓜、胡椒、茄子）、或行栽農作物（例如，大豆、小麥、水稻、玉米、 棉花、花生、馬鈴薯）、樹（例如，松樹）、花、觀賞植物、灌木（例如，玫瑰花）、球莖植物（例 如，洋蔥、大蒜）、草坪（例如，狗牙根部草、肯塔基州藍草、羊茅草）或藤本植物（例如，葡萄 藤）中調節(jié)生長的方法，其包含向植物和/或其種子和/或用于生長所述植物的基質施加 一定量的實質上純的培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液，其包含所述菌株或衍生自所述黃桿菌物種菌 株的細胞碎片、濾液、上清液、化合物（例如，代謝物）和/或提取物，和任選地調節(jié)，且明確 地說促進生長的另一生長促進物質，其借由（例如）調節(jié)，或明確地說促進所述植物中的根 部建立。
[0033] 在一有關方面中，本文中提供協(xié)同調節(jié)植物生長的方法，其包含：以有效調節(jié)所述 植物生長的所述組合的量向植物和/或其種子和/或用于生長所述植物的基質施加上文闡 述的組合。本文中也提供可自黃桿菌物種獲得或自其衍生的經分離的化合物，或作為替代 方案，能夠產生可以用于控制所述植物生長的這些化合物的有機體。
[0034] 包含所述黃桿菌物種菌株、或衍生自實質上純的培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液的所述菌 株或衍生自實質上純的培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液的細胞碎片、濾液、上清液、提取物和/或化 合物（例如，代謝物）（其包含衍生自所述實質上純的培養(yǎng)物、全細胞培養(yǎng)液、細胞碎片、濾 液、上清液和/或提取物的所述黃桿菌物種化合物）可以在移植到土壤中和所述植物的地 上部分之前施加到植物的根部。因此，提供在植物中調節(jié)根和嫩枝延伸的方法，其包括：(a) 在移植入土壤時，用可有效調節(jié)根和嫩枝延伸的量的衍生自黃桿菌屬菌株的所述培養(yǎng)物、 全細胞培養(yǎng)液、上清液、濾液和/或提取物的所述培養(yǎng)物、全細胞培養(yǎng)液、上清液、濾液和/ 或提取物和/或一或多種化合物（例如，代謝物），和任選地另一生長促進物質處理植物的 一或多個根和嫩枝；(b)將（a)的經處理的植物移植入土壤。
[0035] 在一有關方面中，也提供實質上純的培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液的用途，所述培養(yǎng)物 或全細胞培養(yǎng)液包含或衍生自黃桿菌物種菌株的細胞碎片、濾液、上清液和/或提取物，或 黃桿菌物種菌株的代謝物、衍生自所述黃桿菌屬菌株的實質上純的培養(yǎng)物、全細胞培養(yǎng)液、 細胞碎片、濾液、上清液和/或提取物的代謝物，和任選地用于在植物中調節(jié)生長，且尤其 用于調節(jié)根部延伸的另一生長促進物質或劑。
[0036] 并且，在一有關方面中，是包含衍生自黃桿菌物種菌株或所述培養(yǎng)物或全細胞培 養(yǎng)液或其化合物（例如，代謝物）的所述菌株或細胞碎片、濾液、上清液和/或提取物實質 上純凈的培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液、衍生自所述細胞碎片、濾液、上清液和/或提取物的化合 物（例如，代謝物）的用途的組合，其用于在植物中調節(jié)生長，其借由例如調節(jié)，且明確地 說，提高植物的生物質、植物的高度、根的數(shù)目、根的重量，其包含來自黃桿菌屬菌株的所述 上清液濾液和/或提取物的上清液、濾液和/或提取物和/或一或多種代謝物和用于在植 物中調節(jié)生長的任選地另一生長促進物質或劑。所述組合可以是協(xié)同組合。
[0037] 也提供包含黃桿菌物種菌株或衍生自黃桿菌物種菌株的細胞碎片、濾液、上清液 和/或提取物的實質上純凈的培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液，或其化合物（例如，代謝物），或衍 生自所述實質上純凈的培養(yǎng)物、全細胞培養(yǎng)液、細胞碎片、濾液、上清液和/或提取物的化 合物（例如，代謝物），和任選地另一在植物中調節(jié)種子發(fā)芽的生長促進物質的用途，其中 所述植物包括但不限于農作物，諸如水果（例如，草莓）、蔬菜（例如，番茄、黃瓜、南瓜、胡 椒、茄子），或行栽農作物（例如，大豆、小麥、水稻、玉米、棉花、花生、馬鈴薯）、樹（例如，松 樹）、花、觀賞植物、灌木（例如，玫瑰）、草皮（例如，狗牙根、肯塔基州藍草、羊茅草）、球莖 植物（例如，洋蔥、大蒜）或藤本植物（例如，葡萄藤）用于調節(jié)這些發(fā)芽。在一有關方面 中，提供用于在植物中調節(jié)發(fā)芽的方法，其借由用一定量的包含黃桿菌物種菌株、或衍生自 黃桿菌物種菌株的細胞碎片、濾液、上清液和/或提取物的實質上純凈的培養(yǎng)物或全細胞 培養(yǎng)液，或其化合物（例如，代謝物），衍生自所述實質上純凈的培養(yǎng)物、全細胞培養(yǎng)液、細 胞碎片、濾液、上清液和/或提取物的代謝物，和任選地另一在植物中有效調節(jié)種子發(fā)芽的 生長促進物質。在一具體實施例中，種子可以是轉基因種子種子。
[0038] 在一有關方面中，也提供用于在植物中調節(jié)種子發(fā)芽的組合，其包含包含黃桿菌 物種菌株或衍生自黃桿菌物種菌株的細胞碎片、濾液、上清液和/或提取物的實質上純凈 的培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液，或其化合物（例如，代謝物），或衍生自所述實質上純凈的培養(yǎng) 物或全細胞培養(yǎng)液、細胞碎片、濾液、上清液和/或提取物的化合物（例如，代謝物）（其在 植物中調節(jié)種子發(fā)芽），和任選地第二物質中的至少一者，其中所述第二物質是種子涂布 劑。組合可以是協(xié)同組合。
[0039] 這些化合物可以借由（a)在培養(yǎng)基中于足以產生所述化合物的條件下培養(yǎng)黃桿 菌菌株以獲得黃桿菌培養(yǎng)物，和（b)自（a)的全細胞培養(yǎng)液分離在（a)中產生的所述化合 物。明確地說，分離步驟（b)中的化合物可以借由（i)將全細胞培養(yǎng)液施加到離子交換柱、 尺寸排阻柱或反相高壓液相色譜柱中的至少一個以獲得柱碎片；（ii)分析柱碎片以得到 殺蟲活性，和（iii)濃縮（ii)的柱碎片以獲得經分離的化合物。作為替代方案，這些化合 物可以借由化學合成獲得且可以用作純凈化合物或/和粗產物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1顯示使用6孔水瓊脂不活動性生物分析得到的對于H492全細胞培養(yǎng)液和標 簽級avid的劑量反應。
[0041] 圖2顯示在50mL管分析中使用的、且用不同濃度的H492全細胞培養(yǎng)液處理的黃 瓜植物的新鮮嫩枝重量（黑色條）和新鮮根部重量（具有垂直線的條）。
[0042] 圖3顯示在接種南方根結線蟲兩周之后，用不同劑量的H492全細胞培養(yǎng)液處理的 黃瓜根部的蟲癭指數(shù)。
[0043] 圖4顯示在接種南方根結線蟲兩周之后，用不同劑量的H492全細胞培養(yǎng)液處理的 每克黃瓜根部的蟲癭。
[0044] 圖5顯示在黃瓜測試中于采集時，在100mL土壤中黃桿菌屬H492(MBI-302)全細 胞培養(yǎng)液對于根節(jié)線蟲（南方根結線蟲）、矛線蟲屬Oorylaimusspp.)和其它非寄生線蟲 的影響。
[0045] 圖6顯示在采集時，在黃瓜根部（全部的根部）中黃桿菌屬H492 (MBI-302)全細 胞培養(yǎng)液對于根節(jié)線蟲（南方根結線蟲）和其它非寄生線蟲的影響。
[0046] 圖7顯示在采集時，在黃瓜根部（每1克）中黃桿菌屬H492 (MBI-302)全細胞培 養(yǎng)液對于根節(jié)線蟲（南方根結線蟲）和其它非寄生線蟲的影響。
[0047] 圖8顯示在采集時，在黃瓜根部上黃桿菌屬H492 (MBI-302)全細胞培養(yǎng)液對于根 節(jié)線蟲（南方根結線蟲）蟲癭指數(shù)和蟲癭數(shù)目的影響。
[0048] 圖9顯示在用黃瓜的根節(jié)線蟲（南方根結線蟲）測試中，在采集時，黃桿菌屬 H492 (MBI-302)全細胞培養(yǎng)液對于黃瓜植物生物質和活力的影響。
[0049] 圖10顯示在黃瓜測試中，在土壤中黃桿菌屬H492 (MBI-302)全細胞培養(yǎng)液對于腎 形線蟲（腎形腎狀線蟲（Rotylenchulusreniformis))、矛線蟲屬和其它非寄生線蟲的影 響。
[0050] 圖11顯示在采集時，在黃瓜根部（全部的根部）中黃桿菌屬H492 (MBI-302)全細 胞培養(yǎng)液對于腎形線蟲（腎形腎狀線蟲）和非寄生線蟲的影響。
[0051] 圖12顯示在采集時，在黃瓜根部（每1克根部）中黃桿菌屬H492 (MBI-302)全細 胞培養(yǎng)液對于腎形線蟲（腎形腎狀線蟲）和非寄生線蟲的影響。
[0052] 圖13顯示在用黃瓜的腎形線蟲（腎形腎狀線蟲）測試中，在采集時，黃桿菌屬 H492 (MBI-302)全細胞培養(yǎng)液對于黃瓜植物生物質和活力的影響。
[0053] 圖14顯示在玉米測試中，黃桿菌屬H492 (MBI-302)全細胞培養(yǎng)液對于根腐線蟲 (短體線蟲屬）、螺旋線蟲（螺旋線蟲屬）、殘根線蟲（stubbyrootnematode)(擬毛刺線蟲 屬（Paratrichodorusspp.))和其它非寄生線蟲的影響。
[0054] 圖15顯示在采集玉米時，在玉米根部中（全部的根部）黃桿菌屬H492 (MBI-302) 全細胞培養(yǎng)液對于根腐線蟲（短體線蟲屬）、螺旋線蟲（螺旋線蟲屬）和其它非寄生線蟲的 影響。
[0055] 圖16顯示在玉米測試中于采集時，在玉米根部中（每1克根部）黃桿菌屬 H492 (MBI-302)全細胞培養(yǎng)液對于根腐線蟲（短體線蟲屬）、螺旋線蟲（螺旋線蟲屬）和非 寄生線蟲的影響。
[0056] 圖17顯示在用玉米的根腐線蟲（短體線蟲屬）測試中，在采集時，黃桿菌屬 H492 (MBI-302)全細胞培養(yǎng)液對于玉米植物生物質和活力的影響。
[0057] 圖18顯示在大豆測試中，黃桿菌屬H492 (MBI-302)全細胞培養(yǎng)液對于大豆胞囊線 蟲（soybeancystnematode)(大豆異皮線蟲（Heteroderaglycine))的影響。
[0058] 圖19顯示在大豆測試中，黃桿菌屬H492 (MBI-302)全細胞培養(yǎng)液和水對于非寄生 線蟲的影響。
[0059] 圖20是用于自培養(yǎng)物培養(yǎng)液獲得本發(fā)明化合物的純化方案的示意性圖示。
[0060]圖21和22描繪不同H492 (MBI-302)碎片的生物分析的結果。
[0061] 圖23顯示H492 (MBI-302)的劑量反應對于不移動性％ (不活動性）的影響。
[0062] 圖24顯示聚酮1對于蟲癭/根部的數(shù)目的影響。
[0063] 圖25顯示聚酮1對于蟲癭指數(shù)的影響。
[0064] 圖26顯示聚酮1對于新鮮頂部重量的影響。

【具體實施方式】
[0065] 盡管迄今為止的組合物和方法易受不同修改及替代形式影響，但本文中將詳細描 述例示性實施例。然而，應理解，不意欲將本發(fā)明限制于所公開的具體形式，但是相反地，目 的是覆蓋屬于如所附權利要求書定義的本發(fā)明的精神和范疇的所有修改、等效物和替代方 案。
[0066] 當提供數(shù)值范圍時，應理解，除非上下文另外明確規(guī)定，否則在所述范圍上限和下 限之間的達到下限單位十分之一的每一中間值，和所述范圍內的任何其它所述或中間值都 包括其中。也包括更小的范圍。這些更小范圍的上限和下限也包括在其中，但不包括所述 范圍中的任何特定排除的界限。
[0067] 除非另外定義，否則本文中所使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域 的一般技術人員通常所理解的相同的含義。盡管在本發(fā)明的操作或測試中也可以使用與本 文中描述的方法和材料類似或等效的任何方法和材料，但是現(xiàn)在描述優(yōu)選方法和材料。
[0068] 必須指出，除非上下文另外明確規(guī)定，否則如本文中和所附權利要求書中所用的 單數(shù)形式"一（a/an) "和"所述"包括多個參考物。
[0069] 如本文中所定義，"衍生自"意謂自具體來源直接分離或獲得，或作為替代方案，具 有自具體來源分離或獲得的物質或有機體的識別特征。在所述來源是有機體的情況下，"衍 生自"意謂其可以自所述有機物本身或自用于培養(yǎng)或生長所述有機體的培養(yǎng)基分離或獲 得。
[0070] 如本文中所定義，"全培養(yǎng)液培養(yǎng)物"或"全細胞培養(yǎng)液"是指含有細胞和培養(yǎng)基兩 者的液體培養(yǎng)物。如果細菌在培養(yǎng)板上生長，那么可以在水或其它液體（全部培養(yǎng)物）中 采集細胞。術語"全培養(yǎng)液培養(yǎng)物"和"全細胞培養(yǎng)液"互換地使用。
[0071] 如本文中所定義，"上清液"是指當生長在培養(yǎng)液中的細胞在另一液體中自瓊脂培 養(yǎng)盤采集和借由離心、過濾、沉降或此項技術中熟知的其它手段經移除時剩余的液體。
[0072] 如本文中所定義，"濾液"是指來自已經穿過膜的全培養(yǎng)液培養(yǎng)物的液體。
[0073] 如本文中所定義，"提取物"是指借由溶劑（水、清潔劑、緩沖劑、有機溶劑）自細胞 移除且借由離心、過濾或其它方法自細胞分隔的液體物質。
[0074] 如本文中所定義，"代謝物"是指自具有殺蟲，且尤其是殺線蟲活性的微有機體獲 得的微有機體、或上清液、濾液或提取物的發(fā)酵的化合物、物質或副產品。
[0075] 如本文中所定義，"經分離的化合物"基本上不含其它化合物或物質，例如，至少為 約20 %純凈、優(yōu)選地至少約40 %純凈、更優(yōu)選地約60 %純凈、甚至更優(yōu)選地約80 %純凈、最 優(yōu)選地約90%純凈、且甚至更優(yōu)選地約95%純凈，如借由分析方法所確定，所述分析方法 包括但不限于色譜法和電泳法。"衍生自"黃桿菌物種的化合物也涵蓋代謝物。
[0076] 如本文中所定義，"載劑"是惰性、有機或無機材料，其活性成份經混合或調配以促 進其應用到植物或其它待處理的目標，或其存儲、運輸和/或處置。
[0077] 如本文中所定義，"調節(jié)"用于意謂更改害蟲侵擾、植物生長、根部延伸、種子發(fā)芽 的量，或害蟲侵擾擴散的速率、植物生長的速率、根部延伸的速率、種子發(fā)芽的速率。
[0078] 如本文中所定義，"害蟲侵擾"是以造成有害影響的量存在的害蟲，所述有害影響 包括在宿主群體中的疾病或感染或在生長系統(tǒng)中出現(xiàn)不當?shù)囊安荨?br> [0079] 如本文中所定義，"殺蟲劑"是衍生自增加植物害蟲死亡率或抑制其增長率的生物 產品或化學物質的物質，且包括但不限于殺線蟲劑、除藻劑、除草劑、殺昆蟲劑、植物殺真菌 劑、植物殺菌劑和植物殺病毒劑。
[0080] 如本文中所定義，"植物寄生線蟲"是攝食植物且在植物的任何部分上造成損傷的 線蟲。
[0081] 如本文中所定義，"非寄生線蟲"是獨立地存在于土壤中且不對植物的任何部分造 成損害或損傷的線蟲。
[0082] 如本文中所定義，術語"烷基"是指具有一到約12個碳原子的單價直鏈或支鏈烴 基，其包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正己基等。
[0083] 如本文中所定義，"經取代的烷基"是指進一步帶有一或多個選自以下基團的取代 基的烷基：羥基、烷氧基、氫硫基、環(huán)烷基、經取代的環(huán)烷基、雜環(huán)、經取代的雜環(huán)、芳香基、經 取代的芳香基、雜芳基、經取代的雜芳基、芳氧基、經取代的芳氧基、鹵素、氰基、硝基、氨基、 酰胺基、-c(0)H、?；?、酰氧基、羧基、磺?；⒒酋０?、硫?；取?br> [0084] 如本文中所定義，"烯基"是指具有一或多個碳碳雙鍵且具有在約2個到至多12個 范圍內的碳原子的直鏈或支鏈羥基，且"經取代的烯基"是指進一步帶有一或多個如上文所 闡述的取代基的烯基。
[0085] 如本文中所定義，"炔基"是指具有至少一個碳碳三鍵，且具有在約2個到至多12 個范圍內的碳原子的直鏈或支鏈羥基，且"經取代的炔基"是指進一步帶有一或多個如上文 所闡述的取代基的炔基。
[0086] 如本文中所定義，"芳香基"是指具有在6個到至多14個范圍內的碳原子的芳香族 基團，且"經取代的芳香基"是指進一步帶有一或多個如上文所闡述的取代基的芳香基。
[0087] 如本文中所定義，"雜芳基"是指含有作為環(huán)結構的一部分的一或多個雜原子（例 如N、0、S等），且其具有在3個到至多14個范圍內的碳原子的芳環(huán)，且"經取代的雜芳基" 是指進一步帶有一或多個如上文所闡述的取代基的雜芳基。
[0088] 如本文中所定義，"烷氧基"是指-0-烷基-部分，其中烷基如上文所定義，且"經 取代的烷氧基"是指進一步帶有一或多個如上文所闡述的取代基的烷氧基。
[0089] 如本文中所定義，"烷硫基"是指-S-烷基-部分，其中烷基如上文所定義，且"經 取代的烷硫基"是指進一步帶有一或多個上文所闡述的取代基的烷硫基。
[0090] 如本文中所定義，"環(huán)烷基"是指含有在約3個到至多8個范圍內的碳原子的含環(huán) 烷基，且"經取代的環(huán)烷基"是指進一步帶有一或多個如上文所闡述的取代基的環(huán)烷基。
[0091] 如本文中所定義，"雜環(huán)"是指含有作為環(huán)結構的一部分的一或多個雜原子（例如 N、0、S等），且其具有在3個到至多14個范圍內的碳原子的環(huán)狀（亦即含環(huán)）基團，且"經 取代的雜環(huán)"是指進一步帶有一或多個如上文所闡述的取代基的雜環(huán)基團。
[0092] 物質
[0093] 在上文所闡述的組合物和方法中使用的物質可以衍生自黃桿菌物種或菌株。如本 文中所定義，"衍生自"或"可獲自"意謂化合物可以分離自或借由細胞培養(yǎng)物、全細胞培養(yǎng) 液、濾液、上清液、碎片或提取物產生。因此，衍生自黃桿菌物種或菌株的化合物也包括由所 述物種或菌株分離或產生的化合物。由細胞培養(yǎng)物、全細胞培養(yǎng)液、濾液、上清液、細胞碎片 或提取物"產生"的化合物也可以被稱作"代謝物"。"衍生自"黃桿菌菌株的提取物不僅可 以衍生自細胞培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液，且亦衍生自衍生自所述全細胞培養(yǎng)液或細胞培養(yǎng)物 的濾液、上清液、提取物或細胞碎片。
[0094] 在一具體實施例中，黃桿菌屬菌株可以具有以下特征：
[0095] (A)16SrRNA基因序列，其包括：正向序列，其對SEQIDNO:3中闡述的序列具有 至少99%的一致性；和反向序列，其對SEQIDN0:4中闡述的序列具有至少99%的一致性； 和共有序列，其對SEQIDNO:5中闡述的序列具有至少99%的一致性；
[0096] (B)殺蟲活性；
[0097] (C)生長調節(jié)且尤其是生長促進活性；
[0098] (D)產生殺蟲化合物，其具有以下性質：⑴具有約150-195的分子量，其借由 液相色譜法 / 質譜法（LiquidChromatography/MassSpectroscopy，LC/MS)確定；（2) 具有S7.60、7.52、6.83、6.68、2.74、l. 14 的1HNMR值，且具有 203.96、161.90、145. 11、 131. 78、131. 78、127. 28、123. 83、117. 24、117. 24、34. 52、8. 89 的13CNMR值；（3)在反相 C-18HPLC(Phenomenex，Luna5yC18 (2) 100A，100X4. 60mm)柱上具有約 8-14 分鐘的高壓液 相色譜（HPLC)滯留時間，所述柱使用在0. 5mL/min流動速率和210nm的UV檢測下的水：乙 腈（CH3CN)梯度溶劑系統(tǒng)（0-20min;90-0%含水CH3CN，20-24min;100%CH3CN，24-27min; 0-90%含水〇13^27-30111111;90%含水〇1不的 ；
[0099] (E)對于脊椎動物是非病原性的；
[0100](F)對四環(huán)素、紅霉素、鏈霉素、青霉素、氨芐西林、土霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星、慶大 霉素、哌拉西林、亞胺培南和磺胺甲惡唑-甲氧芐啶敏感。
[0101] 明確地說，黃桿菌物種是具有黃桿菌屬H492 (NRRL寄存號第B-50584號）的識別 特征的黃桿菌菌株，或由所述菌株產生的突變菌株，其在一具體實施例中具有所述菌株的 識別特征。因此，在一有關方面中，提供所述黃桿菌菌株。
[0102] 也提供實質上純的培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液，其包含或衍生自這一黃桿菌菌株的細 胞碎片、濾液、上清液、化合物（例如，代謝物）和/或提取物。進一步提供一組合物，其包 含所述實質上純的培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液包含或衍生自這一 黃桿菌菌株的細胞碎片、濾液、上清液、化合物（例如，代謝物）和/或提取物，和載劑、稀釋 劑、表面活性劑、載劑、表面活性劑或佐劑。
[0103] 在方法和組合物和組合中使用的化合物可以是化合物，其（a)具有殺蟲活性；(b) 具有約150-195的分子量，其由液相色譜法/質譜法（LC/MS)確定，且（c)具有約8-14分 鐘的高壓液相色譜（HPLC)滯留時間，在反相C-18高壓液相色譜柱上，在0. 5mL/min流動速 率和210nm的UV檢波下使用水：乙腈（CH3CN)梯度溶劑系統(tǒng)（0-20min;90-0%含水CH3CN， 20-24min;100%CH3CN，24-27min;0-90%含水CH3CN，27-30min;90%含水CH3CN);且（d)任 選地可從黃桿菌物種獲得。在一個實施例中，所述化合物可以是聚酮。
[0104] 在一具體實施例中，化合物可以衍生自黃桿菌且具有羥基化芳香族聚酮結構，其 包含：至少一個酮部分、至少一個6元芳環(huán)、至少一個a, |3不飽和部分、至少一個輕基、至 少一個亞甲基和至少一個甲基；150到約195的核心結構中的分子量；至少9個碳和至少2 個氧。
[0105] 在一個特定實施例中，化合物（a)可自黃桿菌物種獲得；(b)對害蟲呈毒性；(c) 具有約150-195,且更具體地說，176的分子量，其由液相色譜法/質譜法（LC/MS)確定；（d) 具有S7.60、7.52、6.83、6.68、2.74、l. 14 的1HNMR值，且具有 203.96、161.90、145. 11、 131. 78、131. 78、127. 28、123. 83、117. 24、117. 24、34. 52、8. 89 的13CNMR值；（e)在反相 C-18HPLC(Phenomenex，Luna5yC18 (2) 100A，100X4. 60mm)柱上具有約 8-14 分鐘的高壓液 相色譜（HPLC)滯留時間，所述柱使用在0. 5mL/min流動速率和210nm的UV檢測下的水：乙 腈（CH3CN)梯度溶劑系統(tǒng)（0-20min;90-0%含水CH3CN，20-24min;100%CH3CN，24-27min; 0-90%含水〇13^27-30111111;90%含水〇1不的。
[0106] 在一更特定的實施例中，提供化合物，其包括但不限于：
[0107] (A)具有結構##STR001##的化合物

【權利要求】
1. 一種黃桿菌屬（Flavobacteriumsp.)的經分離菌株，其具有以下特征： (A) 16SrRNA基因序列，其包含：正向序列，其與SEQIDNO:3中闡述的序列具有至少 99%的一致性；和反向序列，其與SEQIDNO:4中闡述的序列具有至少99%的一致性；和共 有序列，其與SEQIDNO:5中闡述的序列具有至少99%的一致性； (B) 殺蟲活性； (C) 生長調節(jié)活性； (D) 產生殺蟲化合物，所述化合物具有以下性質：（1)具有約150-195的分子量，如 通過液相色譜法/質譜法LC/MS所測定；（2)具有S7.60、7.52、6.83、6.68、2.74、l. 14 的1HNMR值，且具有 203. 96、161. 90、145. 11、131. 78、131. 78、127. 28、123. 83、117. 24、 117. 24、34. 52、8. 89 的13CNMR值；（3)在反相C-18HPLC(菲羅門公司（Phenomenex)， Luna5yC18 (2) 100A，100X4. 60mm)柱上具有約8-14分鐘的高壓液相色譜HPLC滯留時間， 所述柱使用水：乙腈（CH3CN)梯度溶劑系統(tǒng)（0-20min;90-0%含水CH3CN, 20-24min;100% CH3CN，24-27min;0-90%含水CH3CN，27-30min;90%含水CH3CN)在 0? 5mL/min流動速率和 2IOnm的UV檢測下； (E) 對于脊椎動物是非病原性的； (F) 對四環(huán)素（tetracycline)、紅霉素（erythromycin)、鏈霉素（streptomycin)、 青霉素（penicillin)、氨節(jié)西林（ampicillin)、 土霉素（oxytetracycline)、氯 霉素（chloramphenicol)、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin)、慶大霉素（gentamicin)、 哌拉西林（piperacillin)、亞胺培南（imipenem)和磺胺甲惡挫-甲氧節(jié)啶 (sulphamethoxazole-trimethoprim)敏感，或自所述經分離菌株衍生的實質上純的濾液、 上清液或提取物。
2. 根據(jù)權利要求1所述的菌株，其中所述黃桿菌物種是具有黃桿菌屬H492 (NRRL寄存 號B-50584)的鑒定特征的黃桿菌菌株。
3. -種實質上純的培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液，其包含根據(jù)權利要求1所述的菌株，或自 其衍生的細胞碎片、濾液、上清液或提取物。
4. 一種組合，其包含（a)第一物質，其中所述第一物質是（1)包含根據(jù)權利要求1所述 的菌株的實質上純的培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液，或（2)衍生自根據(jù)權利要求1所述的菌株的 細胞碎片、濾液、上清液、化合物和/或提取物，和（b)至少一或多種第二物質，其中所述第 二物質是化學或生物殺蟲劑或生長促進劑。
5. 根據(jù)權利要求4所述的組合，其中所述第二物質是選自由殺線蟲劑、殺真菌劑和殺 昆蟲劑組成的群組的殺蟲劑。
6. 根據(jù)權利要求4所述的組合，其中所述組合是組合物。
7. -種組合物，其包含（a)第一物質，其選自由以下各項組成的群組：衍生自根據(jù)權利 要求1所述的菌株的實質上純的培養(yǎng)物、全細胞培養(yǎng)液、細胞碎片、濾液、上清液和/或提取 物，和（b)載劑、稀釋劑、表面活性劑、載劑、表面活性劑或佐劑。
8. -種調節(jié)植物中的害蟲侵擾和/或調節(jié)植物生長的方法，其包含向所述植物和/或 其種子和/或用于生長所述植物的基質施加一定量的以下至少一者： (A)實質上純的培養(yǎng)物或全細胞培養(yǎng)液，其包含或衍生自根據(jù)權利要求1所述的菌株 的細胞碎片、濾液、上清液、化合物和/或提取物； (B) 根據(jù)權利要求4所述的組合； (C) 具有以下性質的化合物：（1)具有約150-195的分子量，如通過液相色譜法/質 譜法LC/MS所測定；（2)具有S7. 60、7. 52、6. 83、6. 68、2. 74、1. 14 的1HNMR值，且具有 203. 96、161. 90、145. 11、131. 78、131. 78、127. 28、123. 83、117. 24、117. 24、34. 52、8. 89 的 13CNMR值；（3)在反相C-18HPLC(菲羅門公司，Luna5yC18(2) 100A，100X4. 60mm)柱上 具有約8-14分鐘的高壓液相色譜HPLC滯留時間，所述柱使用水：乙腈（CH3CN)梯度溶劑 系統(tǒng)（0-20min;90-0 % 含水CH3CN, 20-24min; 100 %CH3CN, 24-27min;0-90 % 含水CH3CN, 27-30min;90%含水CH3CN)在0. 5mL/min流動速率和210nm的UV檢測下；（4)可自黃桿菌 物種獲得，且（5)是有效調節(jié)所述害蟲侵擾和/或植物生長的聚酮。
9. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述害蟲是線蟲類害蟲。
10. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述植物選自由以下各項組成的群組：草莓、南 瓜、黃瓜、番茄、玫瑰、胡椒、黃瓜、茄子、葡萄藤、棉花、洋蔥、大蒜、小麥、大豆、玉米和水稻。
11. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述化合物選自由以下各項組成的群組： (A) 具有結構##STR001##的化合物
或其在殺蟲上可接受的鹽或立體異構體，其中Y是OH、SH、NR、OR、SR、R，其中-R是含 有1、2、3、4、5、6、7、8或9個烷基部分的低碳鏈烷基、芳基或芳基烷基部分、經取代的低碳 數(shù)烷基、雜芳基、經取代的雜芳基、雜環(huán)、經取代的雜環(huán)、環(huán)烷基、經取代的環(huán)烷基、烷氧基、 經取代的烷氧基、硫代烷基、經取代的硫代烷基、羥基、齒素、氨基、酰胺基、羧基、-C(O)H、酰 基、氧基?；被姿狨セ?、磺酰基、磺酰胺或硫?；?；X是0、NH、NR或S成、R2、R3、R4、R5、 R6、R7、R8、R9各自獨立地為H、烷基、經取代的烷基、烯基、經取代的烯基、炔基、經取代的炔 基、芳基、經取代的芳基、雜芳基、經取代的雜芳基、雜環(huán)、經取代的雜環(huán)、環(huán)烷基、經取代的 環(huán)烷基、烷氧基、經取代的烷氧基、硫代烷基、經取代的硫代烷基、羥基、齒素、氨基、酰胺基、 羧基、-C(0)H、?；?、氧基?；被姿狨セ?、磺酰基、磺酰胺或硫?；?； (B) 具有結構##STR001a##的化合物
或其在殺蟲上可接受的鹽或立體異構體，其中Y是0H、SH、NR、0R、SR、R，其中-R是含有 1、2、3、4、5、6、7、8或9個烷基部分的低碳鏈烷基、芳基或芳基烷基部分、經取代的低碳數(shù)烷 基、雜芳基、經取代的雜芳基、雜環(huán)、經取代的雜環(huán)、環(huán)烷基、經取代的環(huán)烷基、烷氧基、經取 代的烷氧基、硫代烷基、經取代的硫代烷基、羥基、齒素、氨基、酰胺基、羧基、-C(0)H、酰基、 氧基酰基、氨基甲酸酯基、磺酰基、磺酰胺或硫?；?；X是0、NH、NR或S;n是0、1、2、3、4、5、 6、 7、8或9成、1?2、1?3、1?4、1?5、1? 6、1?7、1?8、1?9各自獨立地為11、烷基、經取代的烷基、烯基、經取代 的烯基、炔基、經取代的炔基、芳基、經取代的芳基、雜芳基、經取代的雜芳基、雜環(huán)、經取代 的雜環(huán)、環(huán)烷基、經取代的環(huán)烷基、烷氧基、經取代的烷氧基、硫代烷基、經取代的硫代烷基、 羥基、齒素、氨基、酰胺基、羧基、-C(O)H、?；?、氧基?；?、氨基甲酸酯基、磺?；?、磺酰胺或 硫酰基； (C) 具有結構##STR001b##的化合物
或其在殺蟲上可接受的鹽或立體異構體，其中Y是0H、SH、NR、0R、SR、R，其中-R是含有 1、2、3、4、5、6、7、8或9個烷基部分的低碳鏈烷基、芳基或芳基烷基部分、經取代的低碳數(shù)烷 基、雜芳基、經取代的雜芳基、雜環(huán)、經取代的雜環(huán)、環(huán)烷基、經取代的環(huán)烷基、烷氧基、經取 代的烷氧基、硫代烷基、經取代的硫代烷基、羥基、齒素、氨基、酰胺基、羧基、-C(0)H、?；?氧基?；被姿狨セ?、磺酰基、磺酰胺或硫?；?；X是0、NH、NR或S;n是0、1、2、3、4、5、6、 7、 8或9 ;R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7各自獨立地為H、烷基、經取代的烷基、烯基、經取代的烯基、 炔基、經取代的炔基、芳基、經取代的芳基、雜芳基、經取代的雜芳基、雜環(huán)、經取代的雜環(huán)、 環(huán)烷基、經取代的環(huán)烷基、烷氧基、經取代的烷氧基、硫代烷基、經取代的硫代烷基、羥基、鹵 素、氨基、酰胺基、羧基、-C(0)H、?；?、氧基酰基、氨基甲酸酯基、磺?；?、磺酰胺或硫?；? (D) 具有結構##STR001c##的化合物
或其在殺蟲上可接受的鹽或立體異構體，其中Y是0H、SH、NR、OR、SR、R，其中R是含有 1、2、3、4、5、6、7、8或9個烷基部分的低碳鏈烷基、芳基或芳基烷基部分、經取代的低碳數(shù)烷 基、雜芳基、經取代的雜芳基、雜環(huán)、經取代的雜環(huán)、環(huán)烷基、經取代的環(huán)烷基、烷氧基、經取 代的烷氧基、硫代烷基、經取代的硫代烷基、羥基、齒素、氨基、酰胺基、羧基、-C(0)H、酰基、 氧基酰基、氨基甲酸酯基、磺?；?、磺酰胺或硫?；?；X是0、NH、NR或S;n是0、1、2、3、4、5、6、 7、8或9 ;R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7各自獨立地為H、烷基、經取代的烷基、烯基、經取代的烯基、 炔基、經取代的炔基、芳基、經取代的芳基、雜芳基、經取代的雜芳基、雜環(huán)、經取代的雜環(huán)、 環(huán)烷基、經取代的環(huán)烷基、烷氧基、經取代的烷氧基、硫代烷基、經取代的硫代烷基、羥基、鹵 素、氨基、酰胺基、羧基、-C(0)H、?；?、氧基?；?、氨基甲酸酯基、磺?；?、磺酰胺或硫?；?； (E) 具有結構##STR001c##的化合物
或其在殺蟲上可接受的鹽或立體異構體，其中X是0、NH、NR或S;n是0、1、2、3、4、5、6、 7、8或9成、1?2、1?3、1?4各自獨立地為H、烷基、經取代的烷基、烯基、經取代的烯基、炔基、經取 代的炔基、芳基、經取代的芳基、雜芳基、經取代的雜芳基、雜環(huán)、經取代的雜環(huán)、環(huán)烷基、經 取代的環(huán)烷基、烷氧基、經取代的烷氧基、硫代烷基、經取代的硫代烷基、羥基、齒素、氨基、 酰胺基、羧基、-C(O)H、?；⒀趸；被姿狨セ?、磺酰基、磺酰胺或硫酰基。
12. 根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述化合物是（E)-4-苯基丁-3-烯-2-酮、亞芐 基苯乙酬、（E) (2-輕苯基）丁 條酬、（3E，5E) 苯基己-3, 5-二條酬、（2E， 4E) -1，5-二苯基戊-2,4-二烯-1-酮、（E) -1- (2-羥苯基）戊-1-烯-3-酮、（E) -3- (2-羥苯 基）-1-苯基丙-2-烯-1-酮、(E) -1- (2-羥苯基）-5-甲基己-1-烯-3-酮、(E) -3- (4-羥苯 基）-1-苯基丙-2-烯-1-酮、(E) -1- (4-羥苯基）-5-甲基己-1-烯-3-酮、(E) -4- (3-羥苯 基）丁-3-烯-2-酮、(E)-4-(2-羥苯基）丁-3-烯-2-酮、2-(2'-苯基-2-氧代乙氧基） 苯甲醛、（E)-4-(2-羥苯基）-3-甲基丁-3-烯-2-酮、（E)-I-苯基戊-2-烯-1-酮、（3E， 7Z)-癸-3, 7-二烯-2-酮、(E) -4- (3-羥苯基）丁 -3-烯-2-酮、（1E，4E) -1，5-雙（3-羥苯 基）戊-1，4-二烯-3-酮、（E) -1，4-二苯基丁 -2-烯-1-酮、（E) -1- (4-羥苯基）-4-苯基 丁 -2-烯-1-酮、（1E，4E) -1，5-雙（3-羥苯基）-2-甲基戊-1，4-二烯-3-酮、（E) -3- (3-羥 苯基）-1-苯基丙-2-烯-1-酮、(E) -1-苯基戊-1-烯-3-酮、(E) -4- (4-羥苯基）-3-甲基 丁 -3-烯-2-酮、（E)-5-甲基-1-苯基己-1-烯-3-酮、2-溴-1-苯基乙酮、（E)-1-(3-羥 苯基）-5-甲基己-1 -烯-3-酮、（E) -4- (4-羥苯基）丁 -3-烯-2-酮、3-羥基苯甲醛、4-羥 基苯甲醛、2-羥基苯甲醛、苯甲醛、Y-十二內酯、Y-辛內酯、2-辛酮、2-庚酮、2-十一烷 酮、順-4-庚烯醛、4-甲基-2-戊酮、異丁醛、（E)-4-苯基丁-2-烯醛、（E)-4-(4-羥苯基） 丁-2-烯醛、（E)-4-(3-羥苯基）丁-2-烯醛、（E)-4-(2-羥苯基）丁-2-烯醛、3-苯丙 醛、3-(4-羥苯基）丙醛、3-(3-羥苯基）丙醛、3-(2-羥苯基）丙醛、2-苯乙醛、2-(4-羥苯 基）乙醛、2-(3-羥苯基）乙醛、2-(2-羥苯基）乙醛、肉桂醛、（E)-3-(4-羥苯基）丙烯醛、 (E) _3_ (3_輕苯基）丙條酸、（E) _3_ (2_輕苯基）丙條酸、（2E，4E) _5_苯基戊_2,4_二條 醛、（2￡，4￡)-5-(4-羥苯基）戊-2,4-二烯醛、（2￡，4￡)-5-(3-羥苯基）戊-2,4-二烯醛、 (2E，4E)-5-(2-羥苯基）戊_2,4_二烯醛、戊-2-酮、己-2-酮、3-甲基庚-2-酮、3-甲基 辛-2-酮、3-甲基壬-2-酮和其立體異構體。
13. -種自黃桿菌菌株獲得聚酮化合物的方法，其包含： (i) 將根據(jù)權利要求1所述的菌株培養(yǎng)足以獲得所述化合物的一段時間，以及 (ii) 從所述培養(yǎng)物的上清液中分離在步驟（a)中產生的所述化合物。
14. 一種種子，其包含根據(jù)權利要求4所述的組合。
15. -種以下至少一者用于調節(jié)所述害蟲侵擾和/或植物生長的用途： (a)衍生自根據(jù)權利要求1所述的菌株的實質上純的培養(yǎng)物、全細胞培養(yǎng)液、細胞碎 片、濾液、上清液和/或提取物，或衍生自所述純培養(yǎng)物、全細胞培養(yǎng)液、細胞碎片、濾液、上 清液和/或提取物的代謝物； (b) 根據(jù)權利要求4所述的組合； (c) 具有以下性質的化合物：（1)具有約150-195的分子量，如通過液相色譜法/質 譜法LC/MS所測定；（2)具有S7. 60、7. 52、6. 83、6. 68、2. 74、1. 14 的1HNMR值，且具有 203. 96、161. 90、145. 11、131. 78、131. 78、127. 28、123. 83、117. 24、117. 24、34. 52、8. 89 的 13CNMR值；（3)在反相C-18HPLC(菲羅門公司，Luna5yC18(2) 100A，100X4. 60mm)柱上 具有約8-14分鐘的高壓液相色譜HPLC滯留時間，所述柱使用水：乙腈（CH3CN)梯度溶劑 系統(tǒng)（0-20min;90-0 % 含水CH3CN, 20-24min; 100 %CH3CN, 24-27min;0-90 % 含水CH3CN, 27-30min;90%含水CH3CN)在0. 5mL/min流動速率和210nm的UV檢測下；（4)可自黃桿菌 物種獲得，且（5)是聚酮和任選地以下至少一者：(b)第二物質，其中所述第二物質是化學 或生物殺蟲劑、生長促進劑，或（c)載劑、稀釋劑、表面活性劑、載劑、表面活性劑或佐劑。
【文檔編號】A01N31/08GK104508116SQ201380014385
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年3月13日 優(yōu)先權日:2012年3月13日
【發(fā)明者】安娜·露西婭·科爾多瓦-科雷洛斯, 拉特納卡·阿索爾卡, 瑪麗亞·科伊武寧, 瑪格麗特·羅德里格斯, 邢麗娟, 帕梅拉·馬羅內 申請人:馬羅內生物創(chuàng)新公司