用于減少反芻動物甲烷生成的飼料組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于減少反芻動物中甲烷產(chǎn)生的方法，所述方法包括對所述反芻動物施用包含黃烷酮糖苷的飼料組合物。
【專利說明】用于減少反芻動物甲烷生成的飼料組合物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于減少反芻動物甲烷生成的新組合物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 甲烷、二氧化碳和氧化亞氮是具有溫室效應的主要氣體。
[0004] 甲烷（CH4)是溫室氣體，其大氣濃度在最近的世紀內(nèi)顯著地增加，并且是二氧化 碳之后地球變暖的最大潛在貢獻者。對流層效應甲烷水平的增加與人口的全球擴張緊密相 關(guān)。因此，認為約70%的甲烷發(fā)出與人類活動相關(guān)。廢物的陸地填充和農(nóng)業(yè)實踐生成甲烷 并且將其釋放在大氣中，其量因世界人口數(shù)量的增長而增加。
[0005] 反芻動物（包括牛（cattle)、水牛（buffalo)、綿羊和山羊）具有大前胃，其中發(fā) 生產(chǎn)生甲烷的發(fā)酵。瘤胃消化道由4個胃的隔室構(gòu)成：瘤胃、網(wǎng)胃、皺胃和重瓣胃。它們中 最大且最重要的是瘤胃。瘤胃作為發(fā)酵隔室起作用。它包含龐大的微生物群體，包括產(chǎn)生 甲烷的古細菌，它們分解植物材料。所述微生物通常稱作產(chǎn)甲烷菌。古細菌群體利用氫和 二氧化碳，即厭氧微生物發(fā)酵產(chǎn)物，生成用于生長的能量，從而產(chǎn)生作為終產(chǎn)物的甲烷。最 終，甲烷通過打嗝從瘤胃中放出。
[0006] 牛和綿羊產(chǎn)生甲烷代表了降低生產(chǎn)力的碳損耗途徑。如果通過甲烷合成損耗的能 量可以通過其它生化途徑被改道而通常至丙酸合成，則瘤胃發(fā)酵可以變得更為有效且可以 在動物體重增長或產(chǎn)奶改善方面反映出來。它對生產(chǎn)者而言是成本有效的且提供減少甲烷 放出至大氣中的有效工具。實際上，因為甲烷在大氣中的壽命是12年（而二氧化碳和氧化 亞氮的壽命分別是100年和120年），所以減少甲烷放出可以對環(huán)境具有越來越快速的影 響。
[0007] 過去使用反芻動物的研究已經(jīng)證實甲烷產(chǎn)生受膳食影響。通過增加結(jié)構(gòu)/非結(jié)構(gòu) (纖維質(zhì)/淀粉）性碳水化合物之比，甲烷放出增加。此外，將脂質(zhì)源添加到膳食中減少了 腸甲烷放出。盡管與甲烷減少平行，但是高脂肪補充比例減少了瘤胃微生物發(fā)酵、飼料攝入 和纖維可消化性。大量化學飼料添加劑例如抗生素（即離子載體）或殺蟲劑被導入反芻動 物營養(yǎng)物以促進生長，改善飼料利用率和減少甲烷產(chǎn)生。然而，對于動物產(chǎn)品中存在化學殘 留物和細菌對抗生素的耐藥性的發(fā)生的擔憂已經(jīng)刺激了尋找更為安全的天然替代品，它們 可以用于有機的畜牧場。
[0008] 已經(jīng)證實包含精油、單寧類、皂苷類、類黃酮和許多其它植物次級代謝產(chǎn)物的植物 或植物提取物改善瘤胃代謝祀向特異性類型的瘤胃微生物群體。Patraa A.K.和Saxenab J(2010)、Phytochemistry，71 (11-12) : 1198-222描述了植物次級代謝產(chǎn)物在抑制瘤胃中甲 烷生成中的應用。對比文件W02005000035涉及增強瘤胃發(fā)酵、特別是減少甲烷生成的方 法，由施用從新鮮紫花苜蓿中得到的可溶性紫花苜蓿提取物組成。
[0009] 因此，對于包含天然來源的化合物且有效地減少甲烷產(chǎn)生和安全地用于畜牧場的 可替代反芻動物飼料組合物存在需求。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明的作者目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過給反芻動物施用包含天然化合物的飼料組合 物，顯著地減少了甲烷放出。
[0012] 因此，在一個方面中，本發(fā)明涉及減少反芻動物中甲烷產(chǎn)生的方法，所述方法包括 通過口服給所述反芻動物施用包含黃烷酮糖苷的飼料組合物，所述黃烷酮糖苷選自新橙皮 苷、異柚皮苷、枸橘苷和橙皮苷或其混合物。
[0013] 在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述組合物是包含新橙皮苷和枸橘苷的混合 物。在一個更具體的實施方案中，所述混合物還包含柚皮苷。在一個優(yōu)選的實施方案中，所 述混合物是天然植物提取物。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述植物是柑橘屬植物提取物。
[0014] 在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述組合物還包含載體。在一個優(yōu)選的實施 方案中，所述載體是海泡石。
[0015] 在一個具體的實施方案中，所述組合物是混合物，其包含25 - 55% wt.的柚皮苷、 10% - 20% wt.的新橙皮苷、1 % - 5% wt.的枸橘苷和足量至100% wt.的載體。在一個 優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含40 - 50% wt.的柚皮苷、11 一 15% wt.的新橙皮苷、 3 - 5%的枸橘苷和足量至100% wt.的載體。
[0016] 在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述反芻動物是小牛（calf)、母牛（cow)、水 牛、綿羊、鹿或山羊。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述反芻動物是小牛。
[0017] 在一個具體的實施方案中，將本發(fā)明的組合物以50 - lOOOmg/Kg DM濃度的固體 形式加入到飼料中。在一個優(yōu)選的實施方案中，以200 - 500mg/Kg DM的濃度加入所述組 合物。
[0018] 附圖簡述
[0019] 圖1表示生物氣和甲烷產(chǎn)生的分布圖。平均值使用應用未補充定量（對照品）或 補充不同類型的類黃酮得到的"體外"模擬系統(tǒng)中的劑量。
[0020] 發(fā)明詳述
[0021] 如上所述，本發(fā)明的作者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過給反芻動物施用包含類黃酮、特別是黃烷 酮糖苷類的飼料組合物，顯著地減少了甲烷放出。
[0022] 因此，在一個方面中，本發(fā)明涉及用于減少反芻動物中甲烷產(chǎn)生的方法，所述方法 包括通過口服給所述反芻動物施用包含黃烷酮糖苷的飼料組合物，所述黃烷酮糖苷選自新 橙皮苷、異柚皮苷、枸橘苷和橙皮苷或其混合物。
[0023] 本文所用的術(shù)語"反芻動物"是指任意反芻亞目（Ruminantia)的偶蹄哺乳動物。 所述哺乳動物咀嚼反芻食物并且具有4個隔室的胃，其中之一是瘤胃。該類型包括鹿、羚 羊、水牛、牛、綿羊、胳馬它和山羊。
[0024] 本文所用的術(shù)語"類黃酮"是指一類在花瓣上產(chǎn)生黃色或紅色/藍色色素沉著的 水溶性植物色素。術(shù)語"黃烷酮類"是指一種類型的類黃酮。黃烷酮類一般地被7位上的 二糖糖基化，得到"黃烷酮糖苷類"。
[0025] 正如下列實施例中所示，發(fā)明人已經(jīng)令人意外地發(fā)現(xiàn)，通過給反芻動物施用本發(fā) 明的飼料組合物顯著地減少了甲烷放出。
[0026] 可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法測定反芻動物的甲烷產(chǎn)量。例如，六氟化硫（SF6) 示蹤法是一種技術(shù)，其能夠使用圍繞在母牛頸部的連續(xù)對呼氣采樣的抽成真空的金屬氣體 采樣罐測定來自母牛個體的甲烷。其它方法包括開路呼吸室，它們是密封的，和氣候控制 室，其中居留單個母牛，從而允許分析該動物產(chǎn)生的所有氣體。
[0027] 還可以通過紅外光譜法、氣相色譜法、質(zhì)譜法和可調(diào)諧的激光二極管技術(shù)、基于飼 料特征的發(fā)酵平衡的附件技術(shù)（例如呼吸測熱法）預測方程、同位素示蹤物技術(shù)等測定放 出的甲烷。
[0028] 此外，可以在"體外"測定甲烷產(chǎn)量。在這種情況中，從動物中采集瘤胃流體并且 在厭氧條件下使用溫育培養(yǎng)基溫育。
[0029] 在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述組合物是包含新橙皮苷和枸橘苷的混合 物。在一個更具體的實施方案中，所述混合物包含新橙皮苷、枸橘苷和柚皮苷。在本發(fā)明 另一個具體的實施方案中，所述混合物是天然植物提取物的形式。在一個優(yōu)選的實施方案 中，所述植物提取物是柑橘屬植物提取物且更優(yōu)選苦橙（bitter orange)植物提取物，所述 提取物包含不同的類黃酮，特別是黃烷酮類糖苷類。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述植物提 取物包含新橙皮苷、枸橘苷和柚皮苷的混合物。正如下列實施例中所示，所述植物提取物是 天然植物提取物，其包含約20% wt.的柚皮苷和40% wt.的苦橙提取物（25 - 27 %柚皮 苷；11 一 13%新橙皮苷和3 - 5%枸橘苷）。在具體情況中，所述天然植物提取物是商購的 (Bioflavex?)。
[0030] 因此，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明組合物的黃烷酮類可以得自植物，更具體地，得自柑橘 屬植物。
[0031] 本發(fā)明組合物中的所有成分是天然來源的且易于得到的產(chǎn)物。此外，如果該組合 物是混合物形式，所述混合物易于操作且可以根據(jù)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員公知的工業(yè)化配制方法 制備。
[0032] 本文所用的術(shù)語"柑橘（citrus) "是指柑橘屬植物。所述柑橘屬植物的實例包括 文旦（Citrus maxima)(柚）、枸橡（Citrus medica)(枸橡）、桔（Citrus reticulate)(橘 子）、酸橙（Citrus aurantium)(苦橙）、波斯青朽1 (Citrus latifolia)(波斯青朽1)、朽1檬 (Citrus Iimon)(朽1 樣）、葡萄柚（Citrus paradisi)(葡萄柚）、甜澄（Citrus sinensis) (甜橙）、積（Citrus trifoliata)(積）等。
[0033] 用于從植物中分離類黃酮的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。在具體的情況中，可以由 本領(lǐng)域技術(shù)人員通過提取、過濾、濃縮、沉淀、凈化和最終干燥這樣的常規(guī)方法從磨碎的柑 橘類果實（尤其是酸橙）中得到苦橙提取物。提取過程可以在二元醇/水系統(tǒng)中進行，其 中所述醇選自甲醇、乙醇、丙醇等。優(yōu)選使用甲醇。作為可替代的非限制性實例，用300ml 甲醇提取50g干燥的苦橙。離心該混懸液以分離殘余物，并且真空濃縮母液至最終體積為 50ml。在5天過程中在室溫下靜置得到的液體，過濾以分離不溶物，再次通過硅藻土床過 濾，并且噴霧干燥。
[0034] 在一個具體的實施方案中，所述黃烷酮可以得自柑橘類植物的果實。例如，柚皮苷 是得自一些檸檬的果實例如葡萄柚和苦橙（酸橙）果皮的糖基化的黃烷酮。它還在果實的 果肉和植物的葉、花和種子中被發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明用于分離類黃酮的示例性、非限制性方法是， 例如描述在對比文件US2421063A和US2421062A中的那些方法，其中描述了從植物材料中 回收柚皮苷的方法，此外，可以根據(jù)對比文件US2442110A、US2348215A和US2400693A中所 述的方法得到橙皮苷。同樣，可以柑橘對比文件US3375242A中所述的方法得到新橙皮苷。 US3375242A描述了用于生產(chǎn)新橙皮苷的方法，其中使柚皮苷與異香草醛反應，產(chǎn)生新橙皮 苷查耳酮。然后使該查耳酮環(huán)化，得到新橙皮苷。
[0035] 另夕卜，易于得到本發(fā)明組合物的黃烷酮類，因為它們是商購的。例如，正 如本發(fā)明附帶的實施例中所示，異柚皮苷、neoeritrocin和枸橘苷購自IND0FINE Chemical Company, Inc(USA)。此外，如上所述，本發(fā)明所述的天然植物提取物是商購的 (Bioflavex?)。
[0036] 在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述組合物是混合物，其包含25 - 55% wt?的柚皮苷、10%-20% wt.的新橙皮苷、wt?的枸橘苷和足量至100% wt?的 載體。在一個更具體的實施方案中，所述組合物包含40 - 50% wt.的柚皮苷、11 一 15% wt.的新橙皮苷、3 - 5%的枸橘苷和足量至100% wt.的載體。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案，所述組合物包含載體。在一個具體的實施 方案中，所述載體是海泡石。海泡石是沉淀來源的天然存在的粘土礦物。它是不可溶脹的、 輕質(zhì)的、多孔性的粘土，其具有大的比表面積。在化學上，海泡石是含水硅酸鎂，其顆粒各自 具有針狀形態(tài)。這種粘土的高表面積和多孔性說明了它對于液體的顯著的吸收力。這些特 性使得它成為廣泛應用的有價值的材料，例如寵物垃圾、動物飼料添加劑、載體、吸收劑、助 懸和觸變添加劑和增稠劑。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明的方法，當給動物飼喂本發(fā)明包含天然來源的類黃酮的組合物時，減 少了反芻動物中的甲烷放出/產(chǎn)生。飼喂效率在飼養(yǎng)業(yè)中具有經(jīng)濟關(guān)聯(lián)。已知抑制反芻 動物中甲烷生成的化合物導致瘤胃發(fā)酵轉(zhuǎn)移至產(chǎn)生更期望的脂肪酸分布，從而增加丙酸而 不是乙酸的比例，由此瘤胃富有活力的發(fā)酵變得更有效（參見美國專利號US3, 745, 221 ; US3, 615, 649 ;和US3, 862, 333)。因此，本發(fā)明的另一個目的在于提供用于抑制反芻動物中 甲烷生成的方法，其對增加飼料利用效率的瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生有益效果。正如下列實施 例中所示，本發(fā)明的組合物降低了產(chǎn)生的甲烷水平并且轉(zhuǎn)變成有利于丙酸的揮發(fā)性脂肪酸 產(chǎn)生。
[0039] 用于測定揮發(fā)性脂肪酸的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。典型地，使用色譜方法，例如 HPLC或帶有火焰離子化檢測的氣相色譜法。
[0040] 飼喂方式不限于任意具體的方式且可以在化合物飼料上添加頂肥得到本發(fā)明的 飼料組合物，或在將本發(fā)明的飼料組合物與化合物飼料混合后飼喂。此外，對于飼喂的量沒 有限制，只要有效地減少甲烷生成，同時營養(yǎng)平衡不受不良影響。
[0041] 因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，將所述組合物以固體形式添加到飼料 中。在一個具體的實施方案中，以50 - lOOOmg/Kg DM(干物質(zhì)）的濃度添加所述組合物。 在一個更具體的實施方案中，以200 - 500mg/Kg DM濃度的固體形式添加所述組合物。 [0042] 本發(fā)明的組合物可以包含其它飼料成分，例如維生素、酶、無機鹽、谷物粉、包含蛋 白質(zhì)的成分、包含碳水化合物的成分、小麥粗粉和/或麥麩。
[0043] 本發(fā)明的飼料組合物的形狀不限于任意具體形式且可以是任意常規(guī)的飼料組合 物形式，例如粉末和顆粒。此外，可以根據(jù)用于生產(chǎn)化合物飼料和飼料補充劑的一般使用的 方法生產(chǎn)所述飼料組合物。
[0044] 在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述反芻動物是小牛、母牛、水牛、綿羊、鹿、 駱駝或山羊。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述反芻動物是小牛。
[0045] 現(xiàn)在參照下列實施例更詳細地描述本發(fā)明，這些實施例決不以預以限定本發(fā)明的 范圍。 實施例
[0046] 材料和方法
[0047] 使用基于 Theodorou M K 等人（1994)Animal Feed Science and Technology, 48(3)，p. 185-197 ;Mauricio，R. M?等人（1999)Animal Feed Science and Technology 79, 321-330所述的實驗方案，設計按照相同實驗方案的兩種試驗以研究不同 的純類黃酮對瘤胃的影響。
[0048] 由半自動壓力計測定氣體產(chǎn)量，預先計算壓力水平與產(chǎn)生的氣體體積之間的相關(guān) 性。
[0049] 將接受主要由濃縮物組成（90:10)的混合定量的瘤胃插套管的小牛用作瘤胃的 流體供體；飼料組成如表1中所示。采集接種物并且通過雙層外科手術(shù)用紗布過濾，且保 存在恒溫罐中。一式三份用預加熱的瓶（39°C )施用類黃酮（表2)+600mg濃縮物（表1) 和作為底物的60mg大麥麥桿并且維持在厭氧條件下。類黃酮異柚皮苷、neoeritrocin、枸 橘昔購自IND0FINE Chemical Company, Inc(USA)。將IOml瘤胃流體和40ml溫育培養(yǎng)基 力口入至丨J瓶中(McDougall, EI (1948) Studies on ruminant saliva. I. The composition and output of sheep's saliva. Biochem J. 43 (I) 99-109) 〇 一旦瓶充滿且施加厭氧條件，貝丨J密 封瓶并且在熱水浴中啟動溫育過程。在2、4、6、8、12、24、36和48小時進行壓力讀取。一式 三份，分兩組或兩批溫育每種樣品。
[0050] 表1?濃縮物的化學組成（％ )
[0051]
【權(quán)利要求】
1. 用于減少反芻動物中甲烷產(chǎn)生的方法，包括通過口服給所述反芻動物施用包含黃烷 酮糖苷的飼料組合物，所述黃烷酮糖苷選自新橙皮苷、異柚皮苷、枸橘苷和橙皮苷或其混合 物。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述飼料組合物是包含新橙皮苷和枸橘苷的混合物。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述混合物還包含柚皮苷。
4. 權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述混合物是天然植物提取物。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中所述植物提取物是柑橘屬植物提取物。
6. 權(quán)利要求1-5任一項的方法，其中所述組合物還包含載體。
7. 權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中所述組合物是混合物，其包含25-55% wt.的柚皮 苷、105^-20% wt.的新橙皮苷、wt.的枸橘苷和足量至100% wt.的載體。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述組合物包含40-50% wt.的柚皮苷、11-15% wt.的新 橙皮苷、3-5%的枸橘苷和足量至100% wt.的載體。
9. 權(quán)利要求6-8任一項的方法，其中所述載體是海泡石。
10. 權(quán)利要求1-9任一項的方法，其中所述反芻動物是小牛、母牛、水牛、綿羊、鹿、駱駝 或山羊。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述反芻動物是小牛。
12. 權(quán)利要求1-11任一項的方法，其中將所述組合物以固體形式加入到飼料中，其濃 度為50-1000mg/Kg干物質(zhì)。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中將所述組合物以固體形式加入到飼料中，其濃度為 200-500mg/Kg 干物質(zhì)。
【文檔編號】A23K1/16GK104244730SQ201380020455
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月19日
【發(fā)明者】J·巴爾塞爾斯特雷斯, F·J·克雷斯波蒙特羅 申請人:因特奎姆私人控股公司