應答水稻黑條矮縮病毒侵染的osa-miR396d及其應用制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種應答水稻黑條矮縮病毒侵染的osa-miR396d及其應用。本發(fā)明還保護序列1所示RNA在抑制生長調節(jié)因子基因表達中的應用；所述生長調節(jié)因子如序列表的序列2所示。有望通過應用水稻中的osa-miR396d基因獲得抗病毒的植株，造福于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
【專利說明】應答水稻黑條矮縮病毒侵染的osa-miR396d及其應用制作方法
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種應答水稻黑條矮縮病毒侵染的OSa-miR396d及其應用。
【背景技術】: [0002]水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus,水稻黑條矮縮病毒)，是水稻上一種危害嚴重的病毒病，隸屬于植物呼腸孤病毒科斐濟病毒屬(Fijivirus),主要由灰飛虱以持久性不經(jīng)卵的方式傳播。病毒粒體球狀，主要由灰飛虱傳播，田間癥狀前期主要表現(xiàn)為植矮縮，葉片濃綠，后期在葉片、葉鞘及莖桿上出現(xiàn)蠟滴狀突起，而后形成黑條，對水稻的產(chǎn)量影響很大，重病田甚至可導致無產(chǎn)量。該病毒除侵染水稻外，還可侵染玉米(玉米粗縮病)、小麥(小麥綠矮)及多種禾本科雜草。上世紀60年代在江浙一帶流行，90年代在我國多處玉米和水稻產(chǎn)區(qū)再度爆發(fā)流行，造成了嚴重損失，近年來更有日漸嚴重的趨勢，2008年僅江蘇省發(fā)病面積就達400萬畝，致使當?shù)氐乃旧a(chǎn)損失嚴重。
[0003]在水稻黑條矮縮病毒侵染植株后，植物調控網(wǎng)絡中許多基因或蛋白都會對產(chǎn)生應答，表達發(fā)生變化從而影響植物多種生理途徑而影響到植株的生長。miRNA是一類長度約為20-24nt的內源單鏈非編碼小分子RNA，在生物體中廣泛存在(Voinnet O =Origin,biogenesis, and activity of plant microRNAs.Cell2009,136:669-687.)。近年來大量研究表明，miRNA參與調控植物生長發(fā)育以及應答生物和非生物脅迫等許多重要生物學過程(Baulcombe D.2004.RNA silencing in plants.Nature431:356-63)。目前的植物應答水稻黑條矮縮病毒侵染的相關研究主要集中病毒的病原形態(tài)、寄主癥狀、傳毒介體及傳播特性等方面，還很少涉及到植物小分子RNA特別是miRNA領域。植物中是否存在著應答水稻黑條矮縮病毒侵染的miRNA，這些miRNA的作用是什么，目前還沒有明確的答案。尋找和鑒定植物體內應答水稻黑條矮縮病毒侵染的miRNA，對于解析植物應答水稻黑條矮縮病毒侵染的分子機制具有重要意義。

【發(fā)明內容】
:
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種應答水稻黑條矮縮病毒侵染的osa_miR396d及其應用。
[0005]本發(fā)明所示osa_miR396d的序列如下(5，一 3’):
[0006]UCCACAGGCUUUCUUGAACUG
[0007](序列表的序列I)。
[0008]本發(fā)明還保護序列I所示RNA在抑制生長調節(jié)因子基因(0s06g02560)表達中的應用；所述生長調節(jié)因子如序列表的序列2所示。所述生長調節(jié)因子基因可如序列表的序列2自5’末端第I至1071位核苷酸所示。
[0009]本發(fā)明還保護序列I所示RNA在促進生長調節(jié)因子基因(0s06g02560)的mRNA降解中的應用；所述生長調節(jié)因子如序列表的序列2所示。所述生長調節(jié)因子基因可如序列表的序列2自5’末端第I至1071位核苷酸所示。序列表的序列I所示的RNA可用于水稻種質改良。
[0010]本發(fā)明采用先進的Solexa高通量測序技術結合生物信息學分析、實時定量PCR、5 ‘RACE等多種生物學手段，首次從基因組水平鑒定到應答水稻黑條矮縮病毒侵染的osa-miR396d,并且證實該miRNA在植物體內調控的靶基因。水稻黑條矮縮病毒侵染脅迫下，osa-miR396d表達上調抑制了該生長調節(jié)因子表達，實際上起到了延緩生長發(fā)育的效果，有利于植株適應水稻黑條矮縮病毒侵染脅迫。本發(fā)明將osa_miR396d的表達變化、革巴基因的表達變化以及靶基因功能聯(lián)系起來，發(fā)現(xiàn)水稻黑條矮縮病毒侵染脅迫下應答水稻黑條矮縮病毒侵染的osa-miR396d主要是調控生長調節(jié)因子的表達使水稻幼苗適應病毒脅迫。已有研究表明植物生長調節(jié)因子能影響細胞分化和葉片發(fā)育等(Horiguchi G,Ferjani A,Fujikura U， Tsukaya H Coordination of cell proliferation and cell expansion inthe control of leaf size in Arabidopsis thaliana.J Plant Res2006119:37-42.)。植物應對外界脅迫條件的有效免疫策略之一是調控生長發(fā)育進程，這一措施不僅可以增加能量儲備以更好地抵御脅迫，以減少病毒向新生組織擴散。(Jonathan D.G.Jones, JefferyL.Dangl, The plant immune system.Nature, 2006444:323-328)
[0011]本發(fā)明揭示了應答水稻黑條矮縮病毒侵染的osa-miR396d在植物受病原菌脅迫中所起的重要作用。將osa-miR396d基因轉入水稻中過量表達或將osa-miR396d基因缺失，就可能獲得在抗病毒侵染能力方面有明顯變化的轉基因植株，并有望通過改造獲得對病毒脅迫有較強耐受性的植株，造福于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0012]圖1為Northern雜交檢測不同濃度水稻黑條矮縮病毒侵染處理的水稻幼苗中osa-miR396d 的表達。
[0013]圖2為osa-miR396d的的靶基因5’ RACE驗證；序列上方的箭頭表示發(fā)生切割的位點，數(shù)值表示該切點處發(fā)生切割的克隆數(shù)與克隆總數(shù)比值。
[0014]圖3為實時定量RT-PCR檢測靶基因的表達；誤差桿表示相對標準偏差。
【具體實施方式】:
[0015]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。
[0016]以下實施例中所用水稻品種為秈稻品種9311 (Oryza sativaL.ssp indicacv.93-11)，水稻種子購自國家農(nóng)作物種質保存中心(中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所)。這兩種水稻品種已經(jīng)完成基因組測序工作。
[0017]實施例1、osa-miR396d響應病毒侵染的發(fā)現(xiàn)
[0018]一、水稻植株接種水稻黑條矮縮病毒處理
[0019]水稻種子經(jīng)25°C浸泡24h，然后催芽萌發(fā)24h。萌發(fā)后將水稻種植在25°C培養(yǎng)箱中條件設定為:溫度28°C /2 VC (白天16h/夜晚8h)，光照強度400 μ mo I/m2 *s，相對濕度70%，由營養(yǎng)土提供水稻生長所需的全部營養(yǎng)。待水稻幼苗長到4葉期，用帶有水稻黑條矮縮病毒的灰飛虱接種處理，以無毒灰飛虱接種的水稻幼苗作為對照；2天后將灰飛虱趕出，將接種幼苗移栽至溫室(25°C )，待3周后病株呈現(xiàn)矮縮癥狀時取樣。
[0020]二、osa_miR396d 的發(fā)現(xiàn)
[0021]1、RNA 提取
[0022]將水稻樣品在液氮中研磨,用TRIZOL試劑盒(Invitrogen)提取總RNA,操作步驟按TRIZOL試劑盒自帶的說明書進行。使用Nanodrop2000c (Thermo)分光光度計測定提取的RNA在260nm(0D260)和280nm(0D280)波長的吸光度值以及RNA的純度和濃度。質量合格RNA的0D260/0D280的比值在1.8-2.0之間，且經(jīng)電泳檢測條帶清晰，無明顯降解和DNA污染。
[0023]2、小RNA文庫的構建
[0024]將質量檢驗合格的水稻幼苗總RNA用于構建小RNA文庫。經(jīng)水稻黑條矮縮病毒侵染處理的水稻樣品及對照提取的RNA取30 μ g用于構建小RNA文庫。對照樣品提取的RNA取30 μ g,用于構建水稻幼苗對照小RNA文庫。小RNA文庫的構建按照Illumina SamplePreparation Protocol文庫構建方法進行,構建好的文庫采用Solexa高通量測序(北京百邁客生物公司)，獲得高質量的18-30nt的小RNA序列(兩個小RNA文庫均獲得了八百多萬條序列)。
[0025]3、兩個小RNA文庫中應答水稻黑條矮縮病毒侵染的miRNA的鑒定
[0026]參考之前國外文獻對高通量測序數(shù)據(jù)分析的成功方法(Jones-Rhoades M W,Bartel D P.Computational identification of plant miRNAs and their targets,including a stress-1 nduced miRNA.Mol.Cell, 2004,14:787-799.),建立一套計算機分析方法用來發(fā)現(xiàn)和鑒定測序數(shù)據(jù)中的水稻miRNA。①將獲得的兩個小RNA文庫中的原始序列通過計算機方法去掉3 ‘接頭，并過濾掉序列長度在18nt以下的序列；②通過SOAP程序(Li R, Li Y, Kristiansen K, Wang J.SOAP:short oligonucleotidealignment program.Bioinformatics,2008, 24:713-714.)將序列與水稻 93-11 基因組(http://rice.genomics, org.cn/rice/)進行匹配,保留能與基因組完全匹配的序列，進行后續(xù)分析
將與基因組匹配的序列與國際權威的miRNA數(shù)據(jù)庫miRBase (http://microma.sanger.ac.uk/sequences/)中公布的水稻miRNA成熟序列及前體序列進行BLAST,從而發(fā)現(xiàn)哪些序列來自于已知的水稻miRNA。
[0027]由于高通量測序能給出每個miRNA的測序次數(shù)，通過比較水稻黑條矮縮病毒侵染的水稻病株小RNA文庫和對照小RNA文庫中miRNA的測序數(shù)(測序數(shù)已經(jīng)根據(jù)小RNA文庫測序總數(shù)進行了標準化)，可以從中發(fā)現(xiàn)兩個庫中測序數(shù)相差較大的miRNA，這部分miRNA可能就是應答水稻黑條矮縮病毒侵染的miRNA。基于此方法，比較了兩個小RNA文庫中miRNA的測序數(shù)，并采用以下兩個限制條件來提高發(fā)現(xiàn)應答水稻黑條矮縮病毒侵染的miRNA的成功率:①miRNA在水稻黑條矮縮病毒侵染處理小RNA文庫或對照小RNA文庫中測序數(shù)要大于100，從而可以保證比較的可靠性miRNA在水稻黑條矮縮病毒侵染處理小RNA文庫和對照小RNA文庫中測序數(shù)相對差異要大于30%。發(fā)現(xiàn)有9個miRNA家族的測序數(shù)存在顯著差異，可能是應答水稻黑條矮縮病毒侵染的miRNA家族，其中一個為osa_miR396d。
[0028]osa-miR396d 的序列如下(5’ — 3’ ):UCCACAGGCUUUCUUGAACUG (序列 I)。
[0029]水稻黑條矮縮病毒侵染處理小RNA文庫的測序次數(shù)為322，對照小RNA文庫(Q對照)的測序次數(shù)為2061，相對差異【(QH202/Q對照-1) X 100%】為+640%。
[0030]三、miRNANorthern 雜交
[0031]為了進一步驗證osa_miR396d具有應答水稻黑條矮縮病毒侵染的表達模式，采用miRNA Northern雜交檢測水稻黑條矮縮病毒侵染之后病株體內(3天、5天、7天、9天后)miRNA的表達情況。
[0032]1、制備探針
[0033]檢測osa-miR396d 的探針(5，一 3’)的序列:CAGTTCAAGAAAGCCTGTGGA。
[0034]米用T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)對上述序列末端磷酸基團進行同位素(Y-32P ATP)標記,得到探針用于Northern雜交。
[0035]2、miRNA Northern 雜交
[0036]Northern雜交中，每個泳道上樣量為301t g低分子量RNA，T6基因作為內參，與miRNA在同一張膜上檢測。T6基因的探針序列為:TATGCGTGTCATCCTTGCGCAG。
[0037](I)分別提取步驟一制備的各水稻樣品的總RNA。
[0038](2)采用 Park 等報道的 PEG8000/NaCl 沉淀法(Park ff, Li J, Song R, MessingJ,Chen X.CARPEL FACTORY,a Dicer homolog, and HENl, a novel protein,act inmicroRNAmetabolism in Arabidopsis thaliana.CTrr.Biol., 2002,12:1484-1495.)從總 RNA 中富集低分子量RNA (有利于提高miRNA的檢測能力)。
[0039](3) miRNA Northern 雜交
[0040]①富集的低分子量RNA溶于DEPC水，再加入等體積的2 X RNA上樣緩沖液(95%甲酰胺，18mM EDTA,0.1 %溴酚藍和0.1 %二甲苯青)，混合后95°C變性5min，得到RNA樣品。
[0041]②RNA樣品用15%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后用電轉移裝置(BIO-RAD)轉移到 Hybond N+ 尼龍膜(Amersham Biosciences)上。
[0042]③轉移有RNA樣品的尼龍膜經(jīng)6XSSC溶液短暫漂洗，紫外交聯(lián)(Stratagene) 5min,再80°C烘烤2h,使RNA完全固定在尼龍膜上。
[0043]④將轉移了 RNA的尼龍膜放入雜交管中，加入5ml TLTRAhyb-Oligo雜交液(Ambion)在雜交爐中42°C預雜交2h，然后加入探針，混勻，42°C雜交過夜。
[0044]⑤雜交結束后，小心倒出雜交液，加入含0.5% SDS的2XSSC溶液，42°C洗滌三次，每次IOmin。
[0045]⑥洗膜結束后，將膜用保鮮膜包裹，平整壓于X光片下，附加增感屏，-70°C曝光I周。
[0046]⑦曝光結束后，沖洗X光片，進行光密度掃描，以對照組的雜交信號為1，計算各個處理組雜交信號的相對強度。
[0047]結果見圖1。Northern雜交結果和測序數(shù)據(jù)很吻合，osa_miR396d水稻黑條矮縮病毒侵染后表達上調。
[0048]實施例2、應答水稻黑條矮縮病毒侵染的miRNA的靶基因預測與驗證
[0049]由于植物miRNA與靶基因mRNA近乎完全互補，因此可以通過生物信息學方法預測osa-miR396d的祀基因。使用psRNATarget程序在水稻全長cDNA庫中尋找能與miRNA序列近乎完全互補的 cDNA 或基因 http://plantgrn.noble.0rg/psRNATarget/,即為 miRNA 的靶標；參數(shù)設置為=Patscan程序參數(shù)為默認設置，允許最大錯配數(shù)為3個，miRNA的第10和11位堿基不允許有錯配，以同源性最高的已知功能基因進行注釋。
[0050]預測結果見表1。
[0051]表1.0sa-miR396d的革巴基因及功能
[0052]
【權利要求】
1.一種應答水稻黑條矮縮病病毒侵染的osa-miR396d，序列表的序列I所示的RNA在抑制生長調節(jié)因子基因表達中的應用；所述生長調節(jié)因子如序列表的序列2所示。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于:所述生長調節(jié)因子基因如序列表的序列2自5’末端第I至1071位核苷酸所示。
3.序列I所示RNA在促進生長調節(jié)因子基因的mRNA降解中的應用；所述生長調節(jié)因子如序列表的序列2自5’末端第I至1071位核苷酸所示。
4.序列表的 序列I所示的RNA在水稻種質改良中的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK103695430SQ201410001245
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2014年1月3日 優(yōu)先權日:2014年1月3日
【發(fā)明者】蘭瑩, 周彤, 周益軍, 李艷舞, 杜琳琳, 孫楓 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院