一種抗寒香蕉種質(zhì)的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于香蕉愈傷組織輻射誘變育種領(lǐng)域，具體涉及一種抗寒香蕉種質(zhì)的篩選方法，利用該方法能高效快速篩選香蕉抗寒突變種質(zhì)。發(fā)明包括香蕉未成熟雄花愈傷組織的輻射處理、愈傷組織低溫篩選、分化芽低溫篩選、香蕉幼苗低溫篩選、香蕉抗寒生根苗馴化及移栽等內(nèi)容組成。本方法由于采用了三次低溫篩選技術(shù)，尤其是在香蕉雄花誘導(dǎo)的愈傷組織時(shí)期就開始采用低溫篩選技術(shù)，極大的提高了抗寒突變種質(zhì)的篩選效率，縮短了培育香蕉抗寒品種的周期。
【專利說明】一種抗寒香蕉種質(zhì)的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于香蕉愈傷組織輻射誘變育種領(lǐng)域，具體涉及一種抗寒香蕉種質(zhì)的篩選方法。
技術(shù)背景
[0002]香蕉是典型的熱帶亞熱帶果樹，廣泛分布于熱帶和南亞熱帶地區(qū)。我國(guó)是世界香蕉主產(chǎn)國(guó)之一，種植區(qū)域分布于廣東、海南、廣西、福建、云南及臺(tái)灣等省區(qū)。近年來由于氣候條件的變化，我國(guó)廣東、廣西、云南等省的香蕉種植經(jīng)常遭受寒害威脅，造成大面積減產(chǎn)和絕收，給廣大香蕉果農(nóng)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。雖然生產(chǎn)上針對(duì)寒害建立了一些預(yù)防措施，但是對(duì)于較嚴(yán)重的寒害，其預(yù)防效果還是不理想，因此選育香蕉抗寒品種是解決香蕉寒害問題的根本出路。目前栽培的香蕉大部分是三倍體，單性結(jié)實(shí)，具有高度的不育性，無法通過常規(guī)雜交選育抗寒新品種，因此利用6tlCo- Y射線輻射誘變香蕉，培育香蕉突變體，從突變體中篩選具有抗寒突變的新種質(zhì)，再培育獲得新品種是香蕉抗寒育種的重要途徑之一。
[0003]目前國(guó)內(nèi)外對(duì)香蕉輻射誘變進(jìn)行抗寒育種研究報(bào)道文獻(xiàn)較少，在輻射誘變材料的選擇上主要采用香蕉吸芽、香蕉組培芽或者香蕉幼苗，其方法主要缺點(diǎn)在于需要處理的突變材料多，篩選周期長(zhǎng)、效率低。本發(fā)明一種抗寒香蕉種質(zhì)的篩選方法選取香蕉未成熟雄花愈傷組織為輻射突變材料，采用愈傷組織低溫篩選、分化芽低溫篩選、香蕉幼苗低溫篩選的三次低溫篩選技術(shù)，提高了抗寒突變種質(zhì)的篩選效率，縮短了培育香蕉抗寒品種的周期。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]一種抗寒香蕉種質(zhì)的篩選方法的
【發(fā)明內(nèi)容】
包括香蕉未成熟雄花愈傷組織的輻射處理、愈傷組織低溫篩選、分化芽低溫篩選、香蕉幼苗低溫篩選、香蕉抗寒生根苗馴化及移栽等內(nèi)容組成。
[0005](I)香蕉未成熟雄花愈傷組織的輻射處理
[0006]香蕉未成熟雄花誘導(dǎo)的愈傷組織經(jīng)6tlCo- Y射線輻射處理，愈傷組織輻射吸收劑量為 60-70Gy。
[0007](2)愈傷組織低溫篩選
[0008]經(jīng)過輻射處理的愈傷組織轉(zhuǎn)入人工氣候箱進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，設(shè)置人工氣候箱溫度為14°C、10°C二個(gè)溫度梯度，采用先高溫后低溫的原則，每個(gè)溫度處理時(shí)間周期為10天，進(jìn)行低溫篩選。在10°C低溫篩選階段結(jié)束后逐步恢復(fù)溫度至26°C，選擇經(jīng)過低溫篩選后成活的愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)。愈傷組織繼代培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L 鹿糖+5.5g/L 瓊脂 pH = 5.3 的固體培養(yǎng)基,每 10 天更換一次培養(yǎng)基。
[0009](3)愈傷組織的分化培養(yǎng)
[0010]經(jīng)過低溫篩選后成活的愈傷組織接種于MS+4.0mg/L BA+0.5mg/L NAA+30g/L鹿糖+5.5g/L瓊脂pH = 5.8的分化固體培養(yǎng)基上。在26°C，光強(qiáng)度為15001x條件下培養(yǎng)，每天光培養(yǎng)12小時(shí)，黑暗培養(yǎng)12小時(shí)。每10天更換一次分化固體培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)20-30天產(chǎn)生分化芽。[0011](4)分化芽低溫篩選
[0012]分化芽轉(zhuǎn)入人工氣候箱，設(shè)置人工氣候箱光強(qiáng)度為15001x，每天光培養(yǎng)12小時(shí)，黑暗培養(yǎng)12小時(shí)，設(shè)置人工氣候箱溫度為14°C、10°C、7°C三個(gè)溫度梯度，采用先高溫后低溫的原則，每個(gè)溫度處理時(shí)間周期為14天，進(jìn)行低溫篩選。在TC低溫篩選階段結(jié)束后逐步恢復(fù)溫度至26°C，選擇經(jīng)過低溫篩選后成活的分化芽，在26°C培養(yǎng)21天，分化芽生長(zhǎng)成香蕉幼苗。
[0013](5)香蕉幼苗低溫篩選
[0014]將香蕉幼苗轉(zhuǎn)入人工氣候箱。設(shè)置人工氣候箱光強(qiáng)度為17001x,每天光培養(yǎng)18小時(shí)，黑暗培養(yǎng)6小時(shí)，設(shè)置人工氣候箱溫度為14°C、10°C、7°C、4°C四個(gè)溫度梯度，采用先高溫后低溫的原則，每個(gè)溫度處理時(shí)間周期為10天，進(jìn)行香蕉幼苗低溫篩選。在4°C低溫篩選階段結(jié)束后逐步恢復(fù)溫度至26°C，選擇經(jīng)過低溫篩選后成活的香蕉幼苗，將香蕉幼苗接種于MS+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊5.5g/L pH = 5.8的生根培養(yǎng)基上，連續(xù)培養(yǎng)30天，誘導(dǎo)出較高質(zhì)量的根系，成為香蕉抗寒生根苗。
[0015](6)香蕉抗寒生根苗馴化及移栽
[0016]香蕉抗寒生根苗經(jīng)2-3天的自然光煉苗后，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽于營(yíng)養(yǎng)袋中，在大棚育苗2-3個(gè)月，再移栽入大田定植，做為抗寒香蕉種質(zhì)保存。
【具體實(shí)施方式】
[0017]本發(fā)明將結(jié)合下面的實(shí)例做進(jìn)一步詳述。
[0018]I 材料
[0019]中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所香蕉生物技術(shù)研究組提供香蕉未成熟雄花愈傷組織。
[0020]2香蕉未成熟雄花愈傷組織輻射誘變處理
[0021]香蕉未成熟雄花愈傷組織經(jīng)6tlCo-Y射線輻射處理，愈傷組織輻射吸收劑量為60-70Gy，輻射處理由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所完成。
[0022]3愈傷組織低溫篩選
[0023]經(jīng)過輻射處理的愈傷組織轉(zhuǎn)入人工氣候箱進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。設(shè)置人工氣候箱溫度為14°C、10°C二個(gè)溫度梯度，采用先高溫后低溫的原則，每個(gè)溫度處理時(shí)間周期為10天，進(jìn)行低溫篩選。在10°C低溫篩選階段結(jié)束后逐步恢復(fù)溫度至26°C，選擇經(jīng)低溫篩選成活的愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)。愈傷組織繼代培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L鹿糖+5.5g/L瓊脂pH = 5.3的固體培養(yǎng)基,每10天更換一次培養(yǎng)基。
[0024]4愈傷組織的分化培養(yǎng)
[0025]經(jīng)過低溫篩選成活的愈傷組織接種于MS+4.0mg/L BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+5.5g/L瓊脂pH =5.8的固體培養(yǎng)基上。在溫度26°C，光強(qiáng)度15001x條件下培養(yǎng)，每天光培養(yǎng)12小時(shí)，黑暗培養(yǎng)12小時(shí)。每10天更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)20-30天，至產(chǎn)生分化芽。[0026]5分化芽低溫篩選[0027]分化芽轉(zhuǎn)入人工氣候箱。設(shè)置人工氣候箱光強(qiáng)度為15001x，每天光培養(yǎng)12小時(shí)，黑暗培養(yǎng)12小時(shí)，設(shè)置人工氣候箱溫度為14°C、10°C、7°C三個(gè)溫度梯度，采用先高溫后低溫的原則，每個(gè)溫度處理時(shí)間周期為14天，進(jìn)行低溫篩選。在TC低溫篩選階段結(jié)束后逐步恢復(fù)溫度至26°C，選擇經(jīng)低溫篩選后成活的分化芽，在26°C培養(yǎng)21天，分化芽生長(zhǎng)成香蕉幼苗。
[0028]6香蕉幼苗低溫篩選
[0029]將香蕉幼苗轉(zhuǎn)入人工氣候箱。設(shè)置人工氣候箱光強(qiáng)度為17001x,每天光培養(yǎng)18小時(shí)，黑暗培養(yǎng)6小時(shí)，設(shè)置人工氣候箱溫度為14°C、10°C、7°C、4°C四個(gè)溫度梯度，采用先高溫后低溫的原則，每個(gè)溫度處理時(shí)間周期為10天，進(jìn)行香蕉幼苗低溫篩選處理。在4°C低溫篩選階段結(jié)束后逐步恢復(fù)溫度至26°C，選擇經(jīng)低溫篩選后成活的香蕉幼苗，將香蕉幼苗苗接種于MS+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L pH = 5.8的培養(yǎng)基上，連續(xù)培養(yǎng)30天至誘導(dǎo)出較高質(zhì)量的根系，成為香蕉抗寒生根苗。
[0030]7香蕉抗寒生根苗馴化及移栽
[0031 ] 香蕉抗寒生根苗經(jīng)2-3天的自然光煉苗后，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽于營(yíng)養(yǎng)袋中，在大棚育苗2-3個(gè)月。
[0032]8香蕉抗寒生根苗移栽后性狀觀察和生理生化指標(biāo)測(cè)定
[0033]①移栽成活率統(tǒng)計(jì)
[0034]香蕉抗寒生根苗移栽于營(yíng)養(yǎng)袋中2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)移栽成活率為51.47%，沒經(jīng)歷低溫篩選的對(duì)照香蕉苗移栽成活率為98.67%，說明經(jīng)過低溫篩選的植株較難適應(yīng)常溫介質(zhì)并恢復(fù)生長(zhǎng)。
[0035]②株高與葉片數(shù)測(cè)定
[0036]株高與葉片數(shù)是描述香蕉幼苗生長(zhǎng)速度快慢的重要指標(biāo)。香蕉抗寒苗移栽2個(gè)月后測(cè)量平均株高為9.60厘米，平均葉片數(shù)為7.83片。沒經(jīng)歷低溫篩選的對(duì)照香蕉苗移栽2個(gè)月后測(cè)量平均株高為20.10厘米，平均葉片數(shù)為9.33片，說明篩選出的抗寒苗生長(zhǎng)速度較慢。
[0037]③抗寒苗低溫脅迫生理生化指標(biāo)的測(cè)定
[0038]香蕉抗寒生根苗移栽于營(yíng)養(yǎng)袋中3個(gè)月后,放置于人工氣候箱,設(shè)置人工氣候箱光強(qiáng)度為17001x，每天光培養(yǎng)18小時(shí)，黑暗培養(yǎng)6小時(shí)，設(shè)置人工氣候箱溫度為7°C，低溫脅迫2天。測(cè)定過氧化物酶(P0D)、過氧化氫酶(CAT)以及丙二醛(MDA)含量。結(jié)果表明香蕉抗寒苗植株過氧化物酶(POD)酶活力是對(duì)照組1.4倍；香蕉抗寒苗植株過氧化氫酶(CAT)酶活力是對(duì)照組1.78倍；香蕉抗寒苗植株丙二醛(MDA)含量?jī)H為對(duì)照組32.3%，表明香蕉抗寒苗植株具有較強(qiáng)的抗寒能力。
【權(quán)利要求】
1.一種抗寒香蕉種質(zhì)的篩選方法，其特征包括以下步驟: 1)、香蕉未成熟雄花愈傷組織的輻射處理 香蕉未成熟雄花誘導(dǎo)的愈傷組織經(jīng)6tlCo- Y射線輻射處理，愈傷組織輻射吸收劑量為60-70Gy ； 2)、愈傷組織低溫篩選 經(jīng)過輻射處理的愈傷組織轉(zhuǎn)入人工氣候箱進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，設(shè)置人工氣候箱溫度為14°C、10°C二個(gè)溫度梯度，采用先高溫后低溫的原則，每個(gè)溫度處理時(shí)間周期為10天，進(jìn)行低溫篩選，在10°C低溫篩選階段結(jié)束后逐步恢復(fù)溫度至26°C，選擇經(jīng)過低溫篩選后成活的愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)； 3)、愈傷組織的分化培養(yǎng) 經(jīng)過低溫篩選后成活的愈傷組織接種于分化固體培養(yǎng)基上，連續(xù)培養(yǎng)20-30天產(chǎn)生分化芽； 4)、分化芽低溫篩選 分化芽轉(zhuǎn)入人工氣候箱，設(shè)置人工氣候箱光強(qiáng)度為15001x，每天光培養(yǎng)12小時(shí)，黑暗培養(yǎng)12小時(shí)，設(shè)置人工氣候箱溫度為14°C、10°C、7°C三個(gè)溫度梯度，采用先高溫后低溫的原則，每個(gè)溫度處理時(shí)間周期為14天，進(jìn)行低溫篩選，在TC低溫篩選階段結(jié)束后逐步恢復(fù)溫度至26°C，選擇經(jīng)過低溫篩選后成活的分化芽，在26°C培養(yǎng)21天，分化芽生長(zhǎng)成香蕉幼苗； 5)、香蕉幼苗低溫篩選 將香蕉幼苗轉(zhuǎn)入人工氣候箱，設(shè)置人`工氣候箱光強(qiáng)度為17001x,每天光培養(yǎng)18小時(shí)，黑暗培養(yǎng)6小時(shí)，設(shè)置人工氣候箱溫度為14°C、10°C、7°C、4°C四個(gè)溫度梯度，采用先高溫后低溫的原則，每個(gè)溫度處理時(shí)間周期為10天，進(jìn)行香蕉幼苗低溫篩選，在4°C低溫篩選階段結(jié)束后逐步恢復(fù)溫度至26°C，選擇經(jīng)過低溫篩選后成活的香蕉幼苗，將香蕉幼苗接種于生根培養(yǎng)基上，連續(xù)培養(yǎng)30天，誘導(dǎo)出較高質(zhì)量的根系，成為香蕉抗寒生根苗； 6)、香蕉抗寒生根苗馴化及移栽 香蕉抗寒生根苗經(jīng)2-3天的自然光煉苗后，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽于營(yíng)養(yǎng)袋中，在大棚育苗2-3個(gè)月，再移栽入大田定植，做為抗寒香蕉種質(zhì)保存。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103651149SQ201410006666
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2014年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月8日
【發(fā)明者】張建斌, 徐碧玉, 金志強(qiáng), 賈彩紅, 劉菊華, 王安邦, 王卓, 苗紅霞, 王甲水 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所