一種荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1及其應(yīng)用，屬于生物基因領(lǐng)域。本發(fā)明通過設(shè)計LcMYB1片段、RACE片段和全長引物，擴(kuò)增并測序獲得LcMYB1基因的核苷酸序列，通過翻譯為氨基酸序列并分析基因的結(jié)構(gòu)。從LcMYB1的氨基酸結(jié)構(gòu)上分析LcMYB1可能具有調(diào)控荔枝果皮花色素苷生物合成的功能，然后通過轉(zhuǎn)化煙草證實(shí)LcMYB1具有調(diào)控花色素苷生物合成的功能。為LcMYB1在改進(jìn)植物色素積累方面應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】—種荔枝R2R3-MYB基因LcMYBI及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物基因領(lǐng)域，特別涉及一種荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl及其應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]大部分花卉和果蔬顏色的表現(xiàn)主要是由于積累了花色素苷，花色素苷的含量是決定花卉和果蔬品質(zhì)的一個重要方面。由于花色素苷的抗氧化性使得更多人喜歡紅色到紫色的蔬菜和水果?；ㄉ剀粘四芙o蔬菜、花卉、水果帶來豐富鮮艷的顏色，還具有對生物和非生物的脅迫給植物帶來傷害的保護(hù)作用，比如:紫外線照射、冷脅迫、干旱脅迫反應(yīng)等(Castellarin et al.2007;Ubi et al.2006;Zhang et al.2012)。最近國內(nèi)外的研究表明，花色素苷合成代謝的調(diào)控是在轉(zhuǎn)錄水平上，主要通過調(diào)控花色素苷合成代謝過程中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，從而使合成代謝過程中的酶的合成受到影響(Allan et al.，2008)。目前已經(jīng)被公認(rèn)的有三類調(diào)節(jié)花色素苷合成的轉(zhuǎn)錄因子，分別是R2R3-MYB、bHLH (basicHlix-Loop-Hlix)和WD40，它們相互作用共同調(diào)節(jié)著花色素苷的生物合成。
[0003]植物的MYB轉(zhuǎn)錄因子是一個非常大的家族，它們調(diào)控著植物的次生代謝過程。MYB類轉(zhuǎn)錄因子以其結(jié)構(gòu)上都有一段保守的DNA結(jié)合區(qū)結(jié)構(gòu)域而得名。以DBD (DNA BindingDomain)最為保守,一般包含1-3個不完全重復(fù)序列R (Repeat),每個重復(fù)片段R由51-52個保守的氨基酸殘基和間隔序列組成。在R3區(qū)域包含有一個典型的結(jié)構(gòu)域[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R，被稱為bHLH Motif，它是能與bHLH—類蛋白相互作用的區(qū)域；(:端有一個motif6的結(jié)構(gòu)域[R/K]Px[P/A/R]xx[F/Y] (Takos et al.2006; Zimmermann et al.2004)。擬南芥中至少有154個MYB組成龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族，這個家族由25個亞族組成。這些轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控次生代謝，控制細(xì)胞形態(tài)，介導(dǎo)病原抗性，應(yīng)答激素信號等方面有十分重要的作用，參與擬南芥花色素苷生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控的PAPl和PAP2屬于第6亞族(Dubos et al.2010)。近來研究顯示參與花色素苷合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的MYB主要屬于R2R3-MYB類。
[0004]自Paz-Ares等(1987)從單子葉植物玉米中克隆出與色素合成相關(guān)的ZmCl基因以來，大量MYB類基因從各種植物中得以分離鑒定。參與調(diào)控的MYB大多數(shù)屬于正調(diào)節(jié)因子，也有少數(shù)具有抑制作用。在煙草中超量表達(dá)PAPl能使整株煙草積累花色苷，從而呈現(xiàn)出紫色煙草；而超表達(dá)FaMYBl能抑制花色素苷的積累，AtMYBL2突變后擬南芥幼苗積累大量花色素苷(Aharoni et al.2001;Dubos et al.2008 ;Malone et al.2009)。目前已經(jīng)從多種植物中克隆到與花色素苷合成調(diào)控相關(guān)的MYBs。草本植物研究最深入，玉米(Zeamays) Zm P (Chopra et al.1996)、矮牽牛(Petunia hybrida) AN2 和 PH4 (Quattrocchioet al.1999; Quattrocchio et al.2006)、擬南芥(Arabidopsis thaliana) PAPl 和 PAP2(Borevitz et al.2000)、金魚草(Antirrhinum majus)R0SEAl、R0SEA2 和 VENOSA(Schwinnet al.2006) 和龍膽(Gentiana triflora) GtMYB3 (Nakatsuka et al.2008)等都被克隆和功能鑒定。
[0005]果實(shí)的花色素苷生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控近年來成為了園藝科學(xué)家的研究熱點(diǎn)。最近大量的果樹果實(shí)花色素苷生物合成調(diào)控的機(jī)理逐漸被闡明，研究主要集中在人們喜愛食用的蘋果、葡萄、桃、梨等，因?yàn)楣r艷的果實(shí)能更加吸引人們的眼球，受到消費(fèi)者的喜愛。調(diào)控果實(shí)花色素苷生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子主要為R2R3-MYB類。葡萄根據(jù)其花色素苷的積累與否分為紅葡萄和白葡萄，而其顏色差異的分子機(jī)理就在于MYB基因上游的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的存在與否(Kobayashi et al.2002; Kobayashi et al.2004)。蘋果花色素苷合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究得比較早，同時也取得了很多成果。當(dāng)套袋的蘋果去套后，花色素苷會迅速合成，同時在這個過程中MdMYBl的表達(dá)會大量增加。轉(zhuǎn)MdMYBl的擬南芥和轉(zhuǎn)基因侵染的葡萄懸浮細(xì)胞也積累花色素苷，說明蘋果果皮的花色素苷積累受到MdMYBl的調(diào)節(jié)(Takos et al.2006)。大多數(shù)蘋果果肉是不積累花色素苷的，但是有少量種質(zhì)資源蘋果果肉是紅色的，研究表明果肉花色素苷的積累同樣受到MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，而與果皮的調(diào)控因子MdMYBl不同，果肉的花色素苷生物合成的調(diào)控受到MdMYBlO調(diào)控(Espley etal.2007)。此外還在蘋果(MalusXdomestica)中克隆到了 MdMYBA(Ban et al.2007)，在梨(Pyrus pyrifolia)中克隆到了 PyMYBlCKFeng et al.2010),葡萄(Vitis Vifera 和 VitisIabruscana)中克隆到了 VvMYBA、VvMYBAl、VlMYBl_3、VvMYB5a、VvMYB5b 和 V1MYBA1 (Azumaet al.2008;Cutanda-Perez et al.2009;Deluc et al.2006;Deluc et al.2008;Kobayashiet al.2002; Walker et al.2007),在山竹(Garcinia mangostana L.)中克隆到了 GmMYBlO(Palapol et al.2009),在楊梅(Myrica rubra)中克隆到了 MrMYBl (Niu et al.2010)等調(diào)控果實(shí)花色素苷生物合成的MYB類轉(zhuǎn)錄因子。
[0006]蒸枝(Litchi chinensis)果實(shí)成熟時果面表現(xiàn)出的紅色是花色素苷積累的結(jié)果。利用液相色譜測定荔枝果皮中的花色素苷，研究結(jié)果顯示荔枝果皮中主要含有花青素-3-蕓香糖苷，此外還有少量的花色素-3葡萄糖苷和錦葵色素-3-乙酰葡萄糖苷(Leeand Wickerl991)?！瓸rewster’蒸枝果皮發(fā)育過程中綠色的蒸枝果皮中主要是錦葵色素-3-乙酰葡萄糖苷，而成熟的荔枝果皮主要是花青素-3-蕓香糖苷(75%)，也有一定含量的花青素-3-葡萄糖苷(17%)和錦葵色素-3-乙酰葡萄糖苷(Rivera-L0pez et al.1999)。
[0007]王惠聰?shù)?2002)在研究‘妃子笑’荔枝著色不良原因時發(fā)現(xiàn)，果實(shí)成熟采收時‘妃子笑’果皮的葉綠素含量是‘糯米糍’的兩倍多，認(rèn)為由葉綠素降解過慢而阻延了花色素苷的合成可能是影響‘妃子笑’果實(shí)著色的因素之一。此后進(jìn)一步研究了酶的活性與果皮花色素苷積累之間的關(guān)系，初步確定了荔枝果皮花色素苷的合成與UFGT酶活性有著較大的相關(guān)性，而與PAL、CH1、DFR等酶活性沒有直接的相關(guān)性(王惠聰?shù)龋?004)。對荔枝果皮花色素苷生物合成代謝基因的研究起步較晚。近來荔枝果皮花色素苷生物合成代謝相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因已經(jīng)克隆并進(jìn)行了 系統(tǒng)的表達(dá)研究，結(jié)果顯示LcUFGT的表達(dá)與花色素苷含呈成正相關(guān)，在所有的代謝結(jié)構(gòu)基因中LcUFGT在起著更重要的作用(Wei et al.2011;Zhao etal.2012)。而對于荔枝花色素苷合成代謝相關(guān)的調(diào)控基因尚無報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl的核苷酸序列。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供上述荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl的氨基酸序列。
[0010]本發(fā)明的再一目的在于提供上述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl，其核苷酸序列如下所示:
[0012]|ATG[ tcgcatttacttggtgcaagtgcatatagtgccacatctgcggagggttacataggagttcga
AAAGGTGCATGGACCGAAGGAGAAGATAATCTTCTGAAGAAATGTGTTGAAATTTATGGCGAACAAAAATGGCATCA
AGTTCCTGTTAGAGCAGGGCTAAATCGATGTCGGAAAAGCTGTAGATTGAGATGGCTGAATTATCTGAAGCCAAATA
TCAAAAGAGGAGAGTTCATGGAAGATGAAGTTGATCTGATTTTGAGGCTGCATAAACTGTTGGGGAATAGATGGTCA
TTGATTGCTGGTAGGCTTCCTGGAAGAACAGCTAATGATATCAAGAACTATTGGAACACCCATTTACGCAAAAAGGC
TGTTGCTTCAAAGCAAGAATCGAAAACAATGACAAGTACTACTACTACTCAAAGCACACAAAAAATCAATGTAATAA
AACCTCAACCTCGAACCTTCGCCAAAAAAACATCTGAATGGGTCAATACCAAAATCACCATGGAGGAAAACAGCAGA
GACCATTTAGGGCATCCAAATCTTTGCAAGGCATCACCATCTACTTCATTGGATACACCAGATAATAATGAAATGAT
CATGTGGTGGGAGAGGCTGTTAGAGAGTGGTCAATTTGAGCTAGAAACTCAAAATTCTATGGGATGGTCAGAGAGGC
CTACCATGTCCAACTTTTGGGCTGAAATATCACCTCTGAGAACAATGTGTGCAGGTAGTACTGGTTTTGAAGTGAAC
CAGAACTGCTTGGACAAACATCATGACTTGGATTTCGATGCGACCCTTTGGAATCTTCTAAGTATAGAAGAAGACAA
TGCAAAG -|taa
[0013] 其中，框中的ATG和TAA分別為LcMYBI核苷酸序列的起始密碼子和終止密碼子。
[0014]上述荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl，其氨基酸序列如下所示:
[0015]MSHLLGASAYSATSAEGYIGVRKGAWTEGEDNLLKKCVEIYGEQKWHQVPVRAGLNRCRKSCRLRWLNYLKPNIKRGEFMEDEVDLILRLHKLLGNRWSLIAGRLPGRTANDIKNYWNTHLRKKAVASKQESKTMTSTTTTQSTQKINVIKPQPRTFAKKTSEWVNTKITMEENSRDHLGHPNLCKASPSTSLDTPDNNEMIMWWERLLESGQFELETQNSMGWSERPTMSNFWAEISPLRTMCAGSTGFEVNQNCLDKHHDLDFDATLWNLLSIEEDNAK
[0016]上述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl的應(yīng)用，主要在提高植物的花色素苷積累方面應(yīng)用。
[0017]上述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl的應(yīng)用，主要在提高轉(zhuǎn)基因植物的花色素苷積
累方面應(yīng)用。
[0018]所述的轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選為轉(zhuǎn)入LcMYBl基因的植物，更優(yōu)選為轉(zhuǎn)入LcMYBl基因的煙草。
[0019]所述的轉(zhuǎn)入LcMYBl基因，優(yōu)選為通過將LcMYBl連接到pBI121載體上，獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105菌株感受態(tài)細(xì)胞；完成轉(zhuǎn)入LcMYBl基因。
[0020]所述的轉(zhuǎn)化優(yōu)選為凍溶法轉(zhuǎn)化方式。
[0021]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0022]1.本發(fā)明獲得一種荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl的核苷酸序列，并對其氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征和物種比對進(jìn)行分析。
[0023]2.本發(fā)明從LcMYBl的氨基酸結(jié)構(gòu)上分析LcMYBl可能具有調(diào)控荔枝果皮花色素苷生物合成的功能，然后通過轉(zhuǎn)化煙草證實(shí)LcMYBl具有調(diào)控花色素苷生物合成的功能。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是LcMYBl克隆過程電泳圖。其中，M，DNA Marker (條帶大小分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp) ;A，LcMYBl 片段；B，LcMYB13 ' RACE 片段；C，LcMYB15 ; RACE 片段；D，LcMYBl 全長。[0025]圖2是LcMYBl推導(dǎo)的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)分析。其中，圖中所用到的序列基因名稱和 GenBank 登錄號為:AtPAP2 (AAG42002)，MdMYBlO (DQ267896)，MrMYBl (GQ340767)，GmMYBlO(FJ197137)，VvMYBAl(BAD18977)，VvMYBA2 (DQ886419)。
[0026]圖3是LcMYBl的氨基酸序列與其他植物的MYB蛋白的進(jìn)化分析。
[0027]圖4是LcMYBl在‘糯米糍’荔枝不同時期組織或部位表達(dá)。
[0028]圖5是‘糯米糍’荔枝發(fā)育階段LcMYBl的表達(dá)分析。
[0029]圖6是煙草中超表達(dá)LcMYBl。其中，A-E為轉(zhuǎn)化過程，F(xiàn)和G為煉苗后葉片積累花色素苷。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0031]實(shí)施例1
[0032]1.荔枝果皮選取
[0033] 分發(fā)明的荔枝選取‘糯米糍’荔枝，所用‘糯米糍’荔枝果皮、果肉、葉片、莖取自采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)長崗山果園。‘糯米糍’發(fā)育階段樣品在花后52天、59天、62天、66天和73天采樣。果皮用0.9cm 口徑的打孔器取果皮圓片，裝入錫紙袋迅速用液氮速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室凍存于_80°C冰箱，用于果皮花色素苷含量測定、基因克隆及基因表達(dá)分析?！疵佐佟笾ぁ⒐?、葉片、莖取自采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)長崗山果園。
[0034]2.荔枝果皮RNA的提取及檢測
[0035]荔枝果皮RNA的提取采用北京Tiandz基因公司RNAOUT(具體方法參照說明書)。用DNase I (TaKaRa)消化DNA，具體方法參照說明書。RNA的濃度測定和純度分析:取1.0y IRNA溶液稀釋至100.0 μ L，用核酸蛋白檢測儀測定260、280和320nm的光吸收值，并計算260nm/280nm比值。當(dāng)0D26(l/0D28(l的比值介于1.80~2.00時，RNA樣品可用于下一步試驗(yàn)?？俁NA樣品濃度按下列公式計算:RNA濃度=0D26(l*40ng μ 1^*100。為進(jìn)一步評價總RNA的完整性，取2.0 μ L總RNA進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0036]3.cDNA第一鏈的合成和初始模板均一化
[0037]利用SMART? RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)合成 cDNA 用于 RACE 片段克隆。用于表達(dá)的每個樣品均取2.0 μ g總RNA,利用MLV-Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen公司)合成cDNA第一鏈,具體操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。
[0038]4.引物設(shè)計
[0039]根據(jù)引物設(shè)計的基本原則,用Primer Premier5.0設(shè)計出引物,委托上海生物工程有限公司合成。LcMYBl片段、RACE片段、全長和Rea-time PCR擴(kuò)增所用引物見表1。
[0040]表1LcMYBI 片段、RACE 片段、全長和 Real-time PCR 引物
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl，其特征在于具體核苷酸序列如SED NO ID:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl，其特征在于=LcMYBl的氨基酸序列如SED NO ID:2所示。
3.權(quán)利要求1或2所述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl的應(yīng)用，其特征在于在提高植物的花色素苷積累方面應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl的應(yīng)用，其特征在于:所述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl應(yīng)用在提高轉(zhuǎn)基因植物的花色素苷積累方面應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl的應(yīng)用，其特征在于:所述的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)入LcMYBl基因的植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl的應(yīng)用，其特征在于:所述的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)入LcMYBl基因的煙草。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl的應(yīng)用，其特征在于:所述的轉(zhuǎn)入LcMYBl基因?yàn)橥ㄟ^將LcMYBl連接到pBI121載體上，獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105菌株感受態(tài)細(xì)胞；完成轉(zhuǎn)入LcMYBl基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYBl的應(yīng)用，其特征在于:所述的轉(zhuǎn)化為凍溶法轉(zhuǎn)化方式。`
【文檔編號】A01H5/00GK103725693SQ201410010821
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】胡桂兵, 賴彪, 王惠聰, 秦永華, 黃旭明, 張春陽 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)