一種以雄蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物快速繁殖【技術領域】，旨在提供一種以雄蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法。該種方法包括步驟：材料采取、愈傷誘導培養(yǎng)基配置、外植體接種及愈傷組織誘導、小植株再生、小植株的繼代培養(yǎng)、小植株的出瓶種植。本發(fā)明突出具有污染率低、愈傷誘導率高、愈傷團塊大、愈傷胚性好、再生能力強、增殖率高的特點，特別對于本發(fā)明以幼嫩花苞中帶花藥的花絲為外植體，污染率可降低為0，可獲得15%的胚性愈傷誘導率，愈傷團塊再生率100%，胚性高，總體上每個花苞所含的雄蕊（6個）可獲得60-120株小植株。
【專利說明】一種以雄蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明是關于植物快速繁殖【技術領域】，特別涉及一種以雄蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法。
【背景技術】
[0002]百合胚性愈傷組織再生體系相比其他再生體系如芽再生體系，具有最高的增殖率和擴繁率，對優(yōu)良種質的保存有重要意義。此外，百合胚性愈傷組織再生體系也是百合遺傳轉化體系的決定性基礎，進而影響百合的基因工程改良。
[0003]目前建立百合愈傷再生體系多以田間鱗莖的鱗片為外植體，其缺陷是鱗莖由于長期處于土壤環(huán)境中，攜帶病菌多，使組織培養(yǎng)消毒要求嚴格，污染率較高。此外，當需要建立野生百合種質的實驗室離體體系時，以鱗莖為外植體，只能采用花期后挖取種球，其突出的不足有二:首先，野生百合位置的確定和種類的辨認很大程度是依靠醒目的花器官及其特征，花期后野生百合地上部分已全部或部分枯萎，尤其是花器官的衰敗和花被片脫落使其種類難以辨認，易造成種質資源的混淆；其次，挖取種球等同于對野生資源完全的采集，對于珍稀瀕危種類更是難以回復的破壞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種污染率低、愈傷誘導率高、愈傷團塊大、愈傷胚性好、再生能力強、增殖率高，且對種質資源的破壞小的建立百合胚性愈傷再生體系的方法。為解決上述技術問題，本發(fā)明的解決方案是:
[0005]提供一種以雄蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法，包括以下步驟:
[0006]步驟一:材料采取:
[0007]在百合花期，取百合長0.5~2.0cm的(幼嫩)花蕾，置于封口袋中在4攝氏度的冰箱中冷藏I周后，再進行后續(xù)操作；
[0008]步驟二:愈傷誘導培養(yǎng)基配置:
[0009]愈傷誘導培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即采用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導培養(yǎng)基溶液，愈傷誘導培養(yǎng)基溶液中還含有 30g/L 的鹿糖、5g/L 瓊脂、0.25mg/L6_ 節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_ΒΑ)、0.25 ~1.5mg/L 的 2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D),愈傷誘導培養(yǎng)基溶液的pH值為5.8 ；
[0010]將配置好的愈傷誘導培養(yǎng)基溶液滅菌后，在超凈工作臺上進行分裝，即將愈傷誘導培養(yǎng)基溶液倒入(玻璃或塑料)培養(yǎng)皿中，待愈傷誘導培養(yǎng)基溶液凝固成愈傷誘導培養(yǎng)基后，用保鮮膜或錫紙將至少一個盛有愈傷誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿包裹好，放在無菌潔凈環(huán)境(如組培室)下存放；
[0011]步驟三:外植體接種及愈傷組織誘導:
[0012]將步驟一中處理后的花蕾，在添加了洗滌精的自來水中浸泡5~30min，再在流水下沖洗0.5~2h清洗干凈，然后在超凈工作臺上進行消毒接種；
[0013]消毒方法如下:用添加了 0.1%ν/ν吐溫的l%w/v的次氯酸鈉(NaClO)溶液，將清洗干凈的花蕾進行表面消毒8~15min，然后用無菌水沖洗3遍；
[0014]消毒后進行接種:用鑷子和解剖刀將花蕾分開，將帶花藥的花絲接種于盛有愈傷誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，以接觸培養(yǎng)基表面為準；將接種了外植體的培養(yǎng)基在25攝氏度、黑暗條件下培養(yǎng)16~40天，完成愈傷組織的誘導，出現(xiàn)愈傷組織團塊；
[0015]步驟四:小植株再生:
[0016]愈傷組織誘導后，將外植體連同愈傷組織團塊一起在超凈工作臺上轉接到柱形瓶中的新鮮愈傷誘導培養(yǎng)基上，在照度為ISOOlux、12h光照/12h黑暗的光照條件下，培養(yǎng)90~120天后，分化出大量小植株，平均每塊外植體分化出15~20棵小植株，在超凈工作臺上將小植株從愈傷組織團塊上分離下來，轉入繼代培養(yǎng)基；
[0017]小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周后(平均直徑達到1cm以上)，可進行步驟六中的出瓶種植，或者不出瓶，進行步驟五中的繼代以維持百合離體鱗莖再生體系，再進行步驟六中的出瓶種植；
[0018]所述繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基中添加有4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基中還含有60g/L的蔗糖、4~8g/L瓊月旨、O ~0.2mg/L6-節(jié)氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0 ~0.2mg/L α -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA)，繼代培養(yǎng)基的pH值為5.8 ; ( α-萘乙酸不是必需的，但一定濃度的α-萘乙酸將有利于小植株根系生長，6-芐氨基腺嘌呤不是必需的，但一定濃度的6-芐氨基腺嘌呤將有利于小植株增殖)
[0019]步驟五:小植株的繼代培養(yǎng):
[0020]步驟四中的小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周后(平均直徑達到1cm以上)，不出瓶，進行繼代的方法是:小植株在繼代培養(yǎng)基上生長，基生根生長健壯，根部上端轉綠后，進行小植株的轉接；轉接方法是:在超凈工作臺上，將小植株取出，將其根全部切除，葉片也從基部切除，僅保留小鱗莖和少量鱗莖盤，將小鱗莖轉接到新鮮的繼代培養(yǎng)基上，繼續(xù)步驟四的培養(yǎng)；
[0021]步驟六:小植株的出瓶種植:
[0022]出瓶前進行低溫鍛煉，將組培容器中的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)的小植株，在I~5攝氏度、黑暗條件下進行30~50天的低溫處理；低溫處理后，將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，再將小植株放入網(wǎng)兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒15~30min,然后種入育苗專用介質(如Custom growing mix, Fafard)中，小植株種入育苗專用介質中的深度在I~2cm范圍內(nèi)，即小鱗莖頂端距土表一球高左右，進行栽培管理，即完成百合胚性愈傷再生體系的建立。
[0023]提供一種以雄蕊為外植體建立百合胚性愈傷遺傳轉化體系的方法，將步驟三中誘導獲得的愈傷組織團塊切下或用鑷子夾下來，作為遺傳轉化體系的受體，經(jīng)農(nóng)桿菌轉染或基因槍介導轉化，經(jīng)過篩選和鑒定，并在再生培養(yǎng)基上分化生根、煉苗、移栽獲得百合的轉基因植株；
[0024]再生培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升再生培養(yǎng)基添加4.43gMS粉，再生培養(yǎng)基中還含有30~60g/L的蔗糖、4~8g/L瓊脂、O~2.0mg/L α -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA),再生培養(yǎng)基的 pH 值為 5.8 ~6.0。
[0025]本發(fā)明提供的上述方法可以用于百合愈傷組織再生體系和遺傳轉化體系中，具體為:對上述方法獲得的愈傷組織進行繼代培養(yǎng)后分切成小塊，接種到相應繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)；用該愈傷組織在再生培養(yǎng)基上分化生根，煉苗、移栽即可獲得百合的組織培養(yǎng)植株；或將該愈傷組織作為遺傳轉化體系的受體，在再生培養(yǎng)基上分化生根，煉苗、移栽即可獲得百合的轉基因植株。
[0026]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0027]本發(fā)明以百合雄蕊為外植體，具有污染率低、材料易得的特點，其突出的優(yōu)勢在于體系高效率、外植體幼嫩、少病毒。對于野生百合的種質資源保存來說，在百合花期取得適量雄蕊用于建立實驗室愈傷再生體系，而不是花期后挖取種球，以雄蕊特點更容易確認野生百合的種類，并極大地減少了對野生種質資源的破壞。本發(fā)明還突出具有污染率低、愈傷誘導率高、愈傷團塊大、愈傷胚性好、再生能力強、增殖率高的特點，特別對于本發(fā)明以幼嫩花苞中帶花藥的花絲為外植體，污染率可降低為0，可獲得15%的胚性愈傷誘導率，愈傷團塊再生率100%，胚性高，總體上每個花苞所含的雄蕊(6個)可獲得60-120株小植株。
【具體實施方式】
[0028]下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細描述:
[0029]一種以雄蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法，包括以下步驟:
[0030]步驟一:材料采取:
[0031]在百合花期，取百合長0.5~2.0cm的幼嫩花蕾，置于封口袋中在4攝氏度的冰箱中冷藏I周后，再進行后續(xù)操作。
[0032]步驟二:愈傷誘導培養(yǎng)基配置:
[0033]愈傷誘導培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即采用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導培養(yǎng)基溶液，愈傷誘導培養(yǎng)基溶液中還含有 30g/L 的鹿糖、5g/L 瓊脂、0.25mg/L6-節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_ΒΑ)、0.25 ~
1.5mg/L 的 2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D);愈傷誘導培養(yǎng)基溶液的pH值為5.8。
[0034]將配置好的愈傷誘導培養(yǎng)基溶液滅菌后，在超凈工作臺上進行分裝，即將愈傷誘導培養(yǎng)基溶液倒入玻璃或塑料的培養(yǎng)皿中，待愈傷誘導培養(yǎng)基溶液凝固成愈傷誘導培養(yǎng)基后，用保鮮膜或錫紙將至少一個盛有愈傷誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿包裹好，放在組培室或其他無菌潔凈環(huán)境下存放。
[0035]步驟三:外植體接種及愈傷組織誘導:
[0036]將步驟一中處理后的花蕾，在添加了洗滌精的自來水中浸泡5~30min，再在流水下沖洗0.5~2h清洗干凈，然后在超凈工作臺上進行消毒接種；
[0037]消毒方法如下:用添加了 0.1%ν/ν吐溫的l%w/v的次氯酸鈉(NaClO)溶液，將清洗干凈的花蕾進行表面消毒8~15min，然后用無菌水沖洗3遍；
[0038]消毒后進行接種:用鑷子和解剖刀將花蕾分開，將帶花藥的花絲接種于盛有愈傷誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，以接觸培養(yǎng)基表面為準；將接種了外植體的培養(yǎng)基在25攝氏度、黑暗條件下培養(yǎng)16~40 天，完成愈傷組織的誘導，出現(xiàn)愈傷組織團塊。[0039]步驟四:小植株再生:
[0040]愈傷組織誘導后，將雄蕊外植體連同愈傷組織團塊一起在超凈工作臺上轉接到柱形瓶中的新鮮愈傷誘導培養(yǎng)基上，在照度為18001uX、12h光照/12h黑暗的光照條件下，培養(yǎng)90-120天后，分化出大量小植株，平均每塊外植體分化出15-20棵小植株，在超凈工作臺上將小植株從愈傷組織團塊上分離下來，轉入繼代培養(yǎng)基；
[0041 ] 小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周后，平均直徑達到Icm以上，可進行步驟六中的出瓶種植，或者不出瓶，進行步驟五中的繼代以維持百合離體鱗莖再生體系，再進行步驟六中的出瓶種植。
[0042]所述繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基中添加有4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基中還含有60g/L的蔗糖、4~8g/L瓊月旨、O ~0.2mg/L6-節(jié)氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0 ~0.2mg/L α -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA)，繼代培養(yǎng)基的pH值為5.8。其中，α-萘乙酸不是必需的，但一定濃度的萘乙酸將有利于小植株根系生長，6-芐氨基腺嘌呤不是必需的，但一定濃度的6-芐氨基腺嘌呤將有利于小植株增殖。
[0043]步驟五:小植株的繼代培養(yǎng):
[0044]步驟四中的小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周后，平均直徑達到Icm以上，不出瓶，進行繼代的方法是:小植株在繼代培養(yǎng)基上生長，基生根生長健壯，根部上端轉綠后，進行小植株的轉接；轉接方法是:在超凈工作臺上，將小植株取出，將其根全部切除，葉片也從基部切除，僅保留小鱗莖和少量鱗莖盤，將小鱗莖轉接到新配置的繼代培養(yǎng)基上，繼續(xù)步驟四的培養(yǎng)。
[0045]步驟六:小植株的出瓶種植:`[0046]出瓶前進行低溫鍛煉，將組培容器中的小植株在I~5攝氏度、黑暗條件下進行30~50天的低溫處理；低溫處理后，將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，再將小植株放入網(wǎng)兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒15~30min，然后種入育苗專用介質(如Custom growing mix, Fafard)中，小植株種入育苗基質中的深度在I~2cm范圍內(nèi)，即小鱗莖頂端距土表一球高左右，進行栽培管理，即完成百合胚性愈傷再生體系的建立。
[0047]下面的實施例可以使本專業(yè)的專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0048]實施例1以東方百合‘索邦’雄蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系
[0049](I)花蕾期取0.5m長的百合幼嫩花苞，在封口袋中冷藏于4攝氏度冰箱中，冷藏一周后取出進行處理。
[0050](2)將花苞在添加了洗滌精的自來水中浸泡30min，在流水下沖洗75min，清洗干凈后，在超凈工作臺上用添加了 0.1%ν/ν吐溫的l%w/v次氯酸鈉溶液，進行表面消毒8min，然后用無菌水沖洗3遍。用鑷子和解剖刀將花蕾分開，將帶花藥的花絲接種于盛有愈傷誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，以接觸培養(yǎng)基表面為準；將接種了外植體的培養(yǎng)基在25攝氏度、完全黑暗條件下培養(yǎng)40天開始出現(xiàn)愈傷組織，污染率為O。不同培養(yǎng)基可參考表1的配方，不同培養(yǎng)基誘導率不同，愈傷誘導率15%。
[0051]愈傷誘導培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即米用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導培養(yǎng)基溶液，愈傷誘導培養(yǎng)基溶液中還含有30g/L 的鹿糖、5g/L 瓊脂、0.25mg/L6-節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、1.5mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D);愈傷誘導培養(yǎng)基溶液的pH值為5.8。
[0052]愈傷團塊若在愈傷誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)130天后直徑最大可達2.38mm。其中，愈傷團塊大小以游標卡尺測量，由于愈傷團塊近球形或長寬相等，故以其直徑作為愈傷團塊大小衡量標準，并伴隨著小植株的分化。
[0053](3)愈傷組織誘導后，將雄蕊外植體連同愈傷組織團塊一起在超凈工作臺上轉接到柱形瓶中的新鮮愈傷誘導培養(yǎng)基上，在照度為ISOOlux、12h光照/12h黑暗的光照條件下培養(yǎng)90天，平均每塊外植體可分化出15棵小植株，將小植株從外植體上分切下來，轉接到新鮮的繼代培養(yǎng)基上。
[0054]繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基添加4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基中還含有60g/L的蔗糖、8g/L瓊脂，繼代培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0055](4)步驟(3)中的小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周，鱗莖平均直徑達到Icm以上，小植株直接進行出瓶種植。將繼代培養(yǎng)基上的小植株置于5攝氏度黑暗條件下進行低溫處理40天；將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，再將小植株放入網(wǎng)兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒15min，然后種入育苗專用介質(Customgrowing mix, Fafard)中，小植株種入育苗基質中的深度在lcm,進行栽培管理。小植株生長健壯，存活率100%。該體系增殖效率達到1:60，即平均每個花蕾所含的雄蕊(6個)最終產(chǎn)生15棵小植株。
[0056]實施例2以東方百合‘索邦’雄蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系
`[0057](I)花蕾期取1.5cm長的百合幼嫩花苞，封在口袋中冷藏于4攝氏度冰箱冷藏一周后，再進行后續(xù)操作。
[0058](2)將花苞在添加了洗滌精的自來水中浸泡18min，在流水下沖洗30min，清洗干凈后，在超凈工作臺上用添加了 0.1% (v/v)吐溫的l%(w/v)次氯酸鈉溶液進行表面消毒lOmin，然后用無菌水沖洗3遍。用鑷子和解剖刀將花蕾分開，將帶花藥的花絲接種于盛有愈傷誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，以接觸培養(yǎng)基表面為準；將接種了外植體的培養(yǎng)基在25攝氏度、完全黑暗條件下培養(yǎng)25天開始出現(xiàn)愈傷組織，污染率為O。
[0059]愈傷誘導培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即米用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導培養(yǎng)基溶液，愈傷誘導培養(yǎng)基溶液中還含有30g/L 的鹿糖、5g/L 瓊脂、0.25mg/L6-節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.5mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D);愈傷誘導培養(yǎng)基溶液的pH值為5.8。
[0060]愈傷團塊若在愈傷誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)130天后直徑最大可達3.13mm。其中，愈傷團塊大小以游標卡尺測量，由于愈傷團塊近球形或長寬相等，故以其直徑作為愈傷團塊大小衡量標準，并伴隨著小植株的分化。
[0061](3)愈傷組織誘導后，將雄蕊外植體連同愈傷組織團塊一起在超凈工作臺上轉接到柱形瓶中的新鮮愈傷誘導培養(yǎng)基上，在照度為ISOOlux、12h光照/12h黑暗的光照條件下培養(yǎng)110天，平均每塊外植體可分化出18棵小植株，將小植株從外植體上分切下來，轉接到新鮮的繼代培養(yǎng)基上。
[0062]繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基添加4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基中還含有60g/L的蔗糖、6g/L瓊脂、0.1mg/L6-節(jié)氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.lmg/L α _ 蔡乙酸(1-Naphthaleneaceticacid, NAA),繼代培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0063](4)步驟(3)中的小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周，鱗莖平均直徑達到Icm以上，小植株直接進行出瓶種植。將繼代培養(yǎng)基上的小植株置于4攝氏度黑暗條件下進行低溫處理50天；將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，再將小植株放入網(wǎng)兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒25min，然后種入育苗專用介質(Customgrowing mix, Fafard)中，小植株種入育苗基質中的深度在1.5cm,進行栽培管理。小植株生長健壯，存活率100%。該體系增殖效率達到1:108，即平均每個花蕾所含的雄蕊(6個)最終產(chǎn)生108棵小植株。
[0064]實施例3以東方百合‘索邦’雄蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系
[0065](I)花蕾期取2cm長的百合幼嫩花苞，封在口袋中冷藏于4攝氏度冰箱，冷藏一周后取出外植體進行處理。
[0066](2)將花苞在添加了洗滌精的自來水中浸泡5min，在流水下沖洗120min，清洗干凈后，在超凈工作臺上用添加了 0.1% (v/v)吐溫的1% (w/v)次氯酸鈉溶液進行表面消毒15min，然后用無菌水沖洗3遍。用鑷子和解剖刀將花蕾分開，將帶花藥的花絲接種于盛有愈傷誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，以接觸培養(yǎng)基表面為準；將接種了外植體的培養(yǎng)基在25攝氏度、完全黑暗條件下培養(yǎng)16天開始出現(xiàn)愈傷組織，污染率為O。不同培養(yǎng)基可參考表1的配方，不同培養(yǎng)基誘導率不同，愈傷誘導率15.0%。
[0067]愈傷誘導培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即米用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導培養(yǎng)基溶液，愈傷誘導培養(yǎng)基溶液中還含有30g/L 的鹿糖、5g/L瓊脂、0.25mg/L6_節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.25mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D);愈傷誘導培養(yǎng)基溶液的pH值為5.8。
[0068]愈傷團塊若在愈傷誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)130天后，直徑最大可達3.9mm。其中，愈傷團塊大小以游標卡尺測量，由于愈傷團塊近球形或長寬相等，故以其直徑作為愈傷團塊大小衡量標準，并伴隨著小植株的分化。
[0069](3)愈傷組織誘導后，將雄蕊外植體連同愈傷組織團塊一起在超凈工作臺上轉接到柱形瓶中的新鮮愈傷誘導培養(yǎng)基上，在照度為ISOOlux、12h光照/12h黑暗的光照條件下培養(yǎng)120天，平均每塊外植體可分化出20棵小植株，將小植株從外植體上分切下來，轉接到新鮮的繼代培養(yǎng)基上。
[0070]繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoogj 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基添加4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoogj 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基添加4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基中還含有60g/L的蔗糖、4g/L 瓊脂、0.2mg/L6-節(jié)氨基腺卩票呤(6-benzyladenine，6_ΒΑ)、0.2mg/L α -萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid，ΝΑΑ)，繼代培養(yǎng)基的 pH 值為 5.8。[0071](4)步驟(3)中的小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周，鱗莖平均直徑達到Icm以上，小植株直接進行出瓶種植。將繼代培養(yǎng)基上的小植株置于I攝氏度黑暗條件下進行低溫處理30天；將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，再將小植株放入網(wǎng)兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒30min，然后種入育苗專用介質(Customgrowing mix, Fafard)中，小植株種入育苗基質中的深度在2cm,進行栽培管理。小植株生長健壯，存活率100%。該體系增殖效率達到1:120，即平均每個花蕾所含的雄蕊(6個)最終產(chǎn)生120棵小植株。
[0072]實施例4以東方百合‘索邦’雄蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系
[0073](I)花蕾期取2cm長的百合幼嫩花苞，封在口袋中冷藏于4攝氏度冰箱，冷藏一周后取出外植體進行處理。
[0074](2)將花苞在添加了洗滌精的自來水中浸泡5min，在流水下沖洗120min，清洗干凈后，在超凈工作臺上用添加了 0.1% (v/v)吐溫的1% (w/v)次氯酸鈉溶液進行表面消毒15min，然后用無菌水沖洗3遍。用鑷子和解剖刀將花蕾分開，將帶花藥的花絲接種于盛有愈傷誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，以接觸培養(yǎng)基表面為準；將接種了外植體的培養(yǎng)基在25攝氏度、完全黑暗條件下培養(yǎng)16天開始出現(xiàn)愈傷組織，污染率為O。不同培養(yǎng)基可參考表1的配方，不同培養(yǎng)基誘導率不同，愈傷誘導率15.0%。
[0075]愈傷誘導培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即米用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導培養(yǎng)基溶液，愈傷誘導培養(yǎng)基溶液中還含有30g/L 的鹿糖、5g/L瓊脂、0.25mg/L6_節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.25mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D);愈傷誘導培養(yǎng)基溶液的pH值為5.8。
[0076]愈傷團塊若在愈傷誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)130天后，直徑最大可達3.9mm。其中，愈傷團塊大小以游標卡尺測量，由于愈傷團塊近球形或長寬相等，故以其直徑作為愈傷團塊大小衡量標準，并伴隨著小植株的分化。
[0077](3)愈傷組織誘導后，將雄蕊外植體連同愈傷組織團塊一起在超凈工作臺上轉接到柱形瓶中的新鮮愈傷誘導培養(yǎng)基上，在照度為ISOOlux、12h光照/12h黑暗的光照條件下培養(yǎng)120天，平均每塊外植體可分化出20棵小植株，將小植株從外植體上分切下來，轉接到新鮮的繼代培養(yǎng)基上。
[0078]繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基添加4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基添加4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基中還含有60g/L的蔗糖、4g/L 瓊月旨、0.2mg/L6-節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.2mg/L α -萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA),繼代培養(yǎng)基的 pH 值為 5.8。
[0079](4)步驟(3)中的小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周，鱗莖平均直徑達到Icm以上，小植株不出瓶，繼續(xù)維持百合離體鱗莖再生體系，進行繼代的方法是:小植株在繼代培養(yǎng)基上生長，基生根生長健壯，根部上端轉綠后，進行小植株的轉接；轉接方法是:在超凈工作臺上，將小植株取出，將其根全部切除，葉片也從基部切除，僅保留小鱗莖和少量鱗莖盤，將小鱗莖轉接到按步驟(3)配置的新鮮的繼代培養(yǎng)基上；
[0080](5)步驟(4)中的小鱗莖在繼代培養(yǎng)基上再生出小植株，對再生出的小植株進行出瓶種植。將繼代培養(yǎng)基上的小植株置于I攝氏度黑暗條件下進行低溫處理30天；將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，再將小植株放入網(wǎng)3?中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒30min,然后種入育苗專用介質(Custom growingmix, Fafard)中，小植株種入育苗基質中的深度在2cm，進行栽培管理。小植株生長健壯，存活率100%。該體系增殖效率達到1:120，即平均每個花蕾所含的雄蕊(6個)最終產(chǎn)生120棵小植株。
[0081]最后，需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有很多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容中直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應`認為是本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種以雄蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一:材料采取: 在百合花期，取百合長0.5~2.0cm的花蕾，置于封口袋中在4攝氏度的冰箱中冷藏I周后，再進行后續(xù)操作； 步驟二:愈傷誘導培養(yǎng)基配置: 愈傷誘導培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即米用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導培養(yǎng)基溶液，愈傷誘導培養(yǎng)基溶液中還含有30g/L的鹿糖、5g/L 瓊脂、0.25mg/L6_ 節(jié)氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_ΒΑ)、0.25 ~1.5mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4_D),愈傷誘導培養(yǎng)基溶液的pH值為 5.8 ; 將配置好的愈傷誘導培養(yǎng)基溶液滅菌后，在超凈工作臺上進行分裝，即將愈傷誘導培養(yǎng)基溶液倒入培養(yǎng)皿中，待愈傷誘導培養(yǎng)基溶液凝固成愈傷誘導培養(yǎng)基后，用保鮮膜或錫紙將至少一個盛有愈傷誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿包裹好，放在無菌潔凈環(huán)境下存放； 步驟三:外植體接種及愈傷組織誘導: 將步驟一中處理后的花蕾，在添加了洗滌精的自來水中浸泡5~30min，再在流水下沖洗0.5~2h清洗干凈，然后在超凈工作臺上進行消毒接種； 消毒方法如下:用添加了 0.1%ν/ν吐溫的l%w/v的次氯酸鈉(NaClO)溶液，將清洗干凈的花蕾進行表面消毒8~15min，然后用無菌水沖洗3遍； 消毒后進行接種:用鑷子和解剖刀將花蕾分開，將帶花藥的花絲接種于盛有愈傷誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，以接觸培養(yǎng)基表面為準；將接種了外植體的培養(yǎng)基在25攝氏度、黑暗條件下培養(yǎng)16~40天，完成愈傷組織的誘導，出現(xiàn)愈傷組織團塊； 步驟四:小植株再生: 愈傷組織誘導后，將外植體連同愈傷組織團塊一起在超凈工作臺上轉接到柱形瓶中的新鮮愈傷誘導培養(yǎng)基上，在照度為18001ux、12h光照/12h黑暗的光照條件下，培養(yǎng)90~120天后，分化出大量小植株，平均每塊外植體分化出15~20棵小植株，在超凈工作臺上將小植株從愈傷組織團塊上分離下來，轉入繼代培養(yǎng)基； 小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周后，可進行步驟六中的出瓶種植，或者不出瓶，進行步驟五中的繼代以維持百合離體鱗莖再生體系，再進行步驟六中的出瓶種植； 所述繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基中添加有4.43gMS粉，繼代培養(yǎng)基中還含有60g/L的蔗糖、4~8g/L瓊月旨、O ~0.2mg/L6-節(jié)氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0 ~0.2mg/L α -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA),繼代培養(yǎng)基的 pH 值為 5.8 ； 步驟五:小植株的繼代培養(yǎng): 步驟四中的小植株在繼代培養(yǎng)基上生長4周后，不出瓶，進行繼代的方法是:小植株在繼代培養(yǎng)基上生長，基生根生長健壯，根部上端轉綠后，進行小植株的轉接；轉接方法是:在超凈工作臺上，將小植株取出，將其根全部切除，葉片也從基部切除，僅保留小鱗莖和少量鱗莖盤，將小鱗莖轉接到新鮮的繼代培養(yǎng)基上，繼續(xù)步驟四的培養(yǎng)； 步驟六:小植株的出瓶種植:出瓶前進行低溫鍛煉，將組培容器中的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)的小植株，在I~5攝氏度、黑暗條件下進行30~50天的低溫處理；低溫處理后，將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，再將小植株放入網(wǎng)兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒15~30min，然后種入育苗專用介質(如Custom growing mix, Fafard)中，小植株種入育苗專用介質中的深度在I~2cm范圍內(nèi)，即小鱗莖頂端距土表一球高左右，進行栽培管理，即完成百合胚性愈傷再生體 系的建立。
【文檔編號】A01H4/00GK103798142SQ201410040873
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月28日 優(yōu)先權日:2014年1月28日
【發(fā)明者】張琳, 夏宜平, 沈柏春, 魏素芬 申請人:杭州市園林綠化股份有限公司