蘋果矮化砧木莖段繼代培養(yǎng)返童綠枝扦插繁殖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了蘋果矮化砧木莖段繼代培養(yǎng)返童綠枝扦插繁殖的方法。該方法包括使離體的成年期蘋果矮化砧木莖尖分生組織在繼代培養(yǎng)基中長成植株，得到成年期蘋果矮化砧木莖尖分生組織初代組培苗，取所述初代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，得到第1代組培苗，取所述第1代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中連續(xù)進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)直到返童，得到返童組培苗；將所述返童組培苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)得到返童組培苗的生根植株，將所述返童組培苗的生根植株移栽到大田，得到采穗母株，取所述采穗母株上的嫩梢作為插穗，用生根劑處理所述插穗得到處理后插穗，將所述處理后插穗插入基質(zhì)中培養(yǎng)得到扦插生根苗。
【專利說明】蘋果矮化砧木莖段繼代培養(yǎng)返童綠枝扦插繁殖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種通過莖段繼代培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)蘋果矮化砧木綠枝扦插繁殖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蘋果無性系矮化砧木的繁殖方式主要有嫁接、壓條和組培。壓條是蘋果無性系矮化砧木的常用無性繁殖方式。雖然綠枝扦插的繁殖系數(shù)明顯高于壓條，且繁育周期短。但蘋果矮化砧木扦插生根難，需要特殊技術(shù)處理，因而未能在生產(chǎn)苗圃中廣泛應(yīng)用。
[0003]“一種SH系蘋果矮化砧木無性繁殖的方法”(申請(qǐng)?zhí)?201310074272.1)發(fā)明了一種將SH系蘋果矮化砧木埋干促發(fā)新枝，再將新枝在拱棚中扦插生根的無性繁殖方法，生根率達(dá)80%以上?！耙环N蘋果矮化砧木自根苗繁育技術(shù)”(申請(qǐng)?zhí)?201310039320.3)，發(fā)明了一種蘋果矮化砧木溫床培育蘋果矮化砧木嫩枝、嫩枝扦插前處理技術(shù)、營養(yǎng)缽直接扦插技術(shù)、間歇性噴霧控制技術(shù)、煉苗移栽的自根苗繁育技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)蘋果矮化砧木和其它難生根木本植物的工廠化扦插育苗，并可實(shí)現(xiàn)當(dāng)年扦插，當(dāng)年達(dá)到嫁接粗度的育苗要求?！耙环N中石占I號(hào)的繁殖方法”(申請(qǐng)?zhí)?201210001119.1),發(fā)明了一種從中站I號(hào)童期樹的枝條上剪取插穗，基部浸蘸2000ppm-4000ppm的IBA溶液，扦插到穴盤中進(jìn)行培養(yǎng)的繁殖方法，具有繁殖系數(shù)高、繁育周期短、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。
[0004]誘導(dǎo)莖發(fā)生不定根是木本植物扦插成功的關(guān)鍵。隨著供體植株年齡的增長，插穗形成不定根的能力顯著下降。3年生卡羅萊納州鼠李(Carolina Buckthorm)插穗生根率為88%，遠(yuǎn)高于成年期樹(36年生)插穗17%(Graves，2002)。童期北美紅杉插穗生根率100%，成年期30%(Li et al，1 992)。因此，通過誘導(dǎo)插穗返童可以提高插穗生根能力。將成年期芽連續(xù)嫁接到幼年期站'木可以誘導(dǎo)返童(Delargy and Wright, 1979; Husen, 2008b; Husenand Pal, 2003; Huang et al.，1992)。外施用赤霉素(GA3)或在培養(yǎng)基里添加GA3能顯著提高甜樓桃(Prunus avium)生根能力，GA3可能誘導(dǎo)甜樓桃返童(Ford et al.，2002)。
[0005]miR156基因介導(dǎo)開花植物營養(yǎng)階段向生殖階段轉(zhuǎn)變，童期階段miR156基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于成年期階段(Poethig2009;Wu et al.，2009;Wang et al., 2011 ;Huijserand Schmid2011)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種通過誘導(dǎo)成年期蘋果矮化砧木返童來實(shí)現(xiàn)蘋果矮化砧木綠枝扦插繁殖的方法。
[0007]本發(fā)明所提供的蘋果矮化砧木扦插繁殖方法，包括使離體的成年期蘋果矮化砧木莖尖分生組織在繼代培養(yǎng)基中長成植株，得到成年期蘋果矮化砧木莖尖分生組織初代組培苗，取所述初代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，得到第I代組培苗，取所述第I代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中連續(xù)進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)直到返童，得到返童組培苗；將所述返童組培苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)得到返童組培苗的生根植株，將所述返童組培苗的生根植株移栽到大田，得到采穗母株，取所述采穗母株上的嫩梢作為插穗，用生根劑處理所述插穗得到處理后插穗，將所述處理后插穗插入基質(zhì)中培養(yǎng)得到扦插生根苗。
[0008]上述方法中，所述基質(zhì)可為河沙。
[0009]上述方法中，所述得到返童組培苗的方法為取所述第I代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中連續(xù)進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)直到第N代，得到第N代組培苗，所述第N代組培苗即為所述返童組培苗，所述N為大于等于18小于等于21的任一個(gè)自然數(shù)。
[0010]上述方法中，所述蘋果矮化砧木可為中砧I號(hào)、M9或M26。在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述蘋果矮化砧木為中砧I號(hào)，N為大于等于18小于等于21的任一個(gè)自然數(shù)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述蘋果矮化砧木為M9，N為21。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述蘋果矮化砧木為M26，N為21。
[0011]上述方法中，取所述第I代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中連續(xù)進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)直到第N代，得到第N代組培苗的方法可為取所述第I代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第2代組培苗，取所述第2代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第3代組培苗，取所述第3代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第4代組培苗，取所述第4代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第5代組培苗，取所述第5代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第6代組培苗，取所述第6代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第7代組培苗，取所述第7代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第8代組培苗，取所述第8代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第9代組培苗，取所述第9代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第10代組培苗，取所述第10代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第11代組培苗，取所述第11代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第12代組培苗，取`所述第12代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第13代組培苗，取所述第13代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第14代組培苗，取所述第14代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第15代組培苗，取所述第15代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第16代組培苗，取所述第16代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第17代組培苗，取所述第17代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第18代組培苗。
[0012]上述方法中，得到第N代組培苗的方法可為取所述第18代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第19代組培苗。
[0013]上述方法中，得到第N代組培苗的方法可為取所述第19代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第20代組培苗。
[0014]上述方法中，得到第N代組培苗的方法可為取所述第20代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)，得到第21代組培苗。
[0015]上述方法中，所述繼代培養(yǎng)基可為在MS培養(yǎng)基中加入BA和IBA得到的固體培養(yǎng)基，所述繼代培養(yǎng)基中BA的濃度為0.2mg/L，所述繼代培養(yǎng)基中IBA的濃度為0.5mg/L。
[0016]上述方法中，上述所有莖段均至少帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉。
[0017]上述方法中，所述繼代培養(yǎng)的條件為每天的光照周期為16小時(shí)光照8小時(shí)黑暗，光強(qiáng)為2000Lx，光照時(shí)溫度為24-25°C，黑暗時(shí)溫度18°C。
[0018]上述方法中，所述生根培養(yǎng)基可為在1/2MS培養(yǎng)基中加入IBA得到的固體培養(yǎng)基，所述生根培養(yǎng)基中IBA的濃度為0.5mg/L。
[0019]上述方法中，所述生根培養(yǎng)的條件可為每天的光照周期為16小時(shí)光照8小時(shí)黑暗，光強(qiáng)為2000Lx，光照時(shí)溫度為24-25°C，黑暗時(shí)溫度18°C。
[0020]上述方法中，所述生根劑的溶劑為水，溶質(zhì)可為IBA和H2O2 ;所述生根劑中，IBA的濃度為3000mg/L，H2O2的濃度為50mM。
[0021]上述方法中，所述用生根劑處理所述插穗可為將所述插穗浸蘸所述生根劑，浸蘸深度為2.0cm，浸蘸時(shí)間為I分鐘。
[0022]本發(fā)明通過蘋果矮化砧木的成年期枝條莖尖分生組織的繼代培養(yǎng)使蘋果矮化砧木成年期材料返童，恢復(fù)蘋果矮化砧木扦插生根能力，將在我國蘋果矮化密植栽培中得到廣泛應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為中砧I號(hào)成年期枝條葉片和連續(xù)繼代過程中第0、3、6、9、12、15和18代的葉片形態(tài)變化。
[0024]圖2為中砧I號(hào)連續(xù)繼代過程中miR156基因相對(duì)表達(dá)量變化。
[0025]圖3為蘋果砧木返童(R)、童期(J)和成年期(A)插穗生根能力比較。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。河沙購自北京昌平區(qū)陽坊鎮(zhèn)。實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)均為北京。
[0027]蘋果矮化砧木中砧I號(hào)是中國農(nóng)業(yè)大學(xué)歷時(shí)25年從小金海棠(Malusxiaojinensis Cheng et Jiang)中選出的耐缺鐵優(yōu)良種質(zhì),具有耐鹽堿、耐熱、耐旱、耐?勞、抗寒(_45°C)、抗白粉病、固地性好等特性(韓振海等，蘋果砧木新品種中砧I號(hào)。農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2013，21 (7): 879-882)。該砧木新品種已經(jīng)于2009年12月30日由北京市林木品種審定委員會(huì)審定為林木良種，良種編號(hào)為京S-SV-MX-015-2009，此信息可從2010年I月16日發(fā)布的《2009年北京市林木品種審定公告》上查詢，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0028]M9和M26是英國東茂林試驗(yàn)站選育出的優(yōu)良蘋果矮化砧木，作為蘋果砧木能使樹體矮化，早結(jié)果，早豐產(chǎn)，提高果實(shí)品質(zhì)，大幅度增加單位面積產(chǎn)量(宣景宏，2001 ;王貴平等，2012)，M9和M26公眾可以從果樹苗圃購買。
[0029]實(shí)施例1、通過誘導(dǎo)成年期蘋果矮化砧木返童來實(shí)現(xiàn)蘋果矮化砧木綠枝扦插繁殖的方法
[0030]1,2012年3月初，剪取蘋果矮化砧木中砧I號(hào)成年期(樹齡10年)樹冠枝條、M9成年期樹冠枝條、M26成年期樹冠枝條催芽，選取飽滿的芽體作為外植體。
[0031]2、外植體用自來水沖洗30分鐘，75%的醫(yī)用酒精消毒30秒，無菌水清洗3遍，再用
0.1%的升汞消毒6分鐘，無菌水清洗3遍，之后用滅過菌濾紙將外植體表面水浙干，得到初代(記為O代)外植體。
[0032]3、外植體繼代培養(yǎng)
[0033]在無菌條件下用解剖刀剝?nèi)〕醮庵搀w的莖尖分生組織接入繼代培養(yǎng)基(MS+0.2mg/L BA+0.5mg/L IBA)，進(jìn)行繼代培養(yǎng)四周，長成無根植株，該植株即為成年期蘋果矮化砧木莖尖分生組織初代(記為O代)無根組培苗；取蘋果矮化砧木莖尖分生組織初代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第I代無根組培苗，取第I代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第2代無根組培苗，取第2代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第3代無根組培苗，取所述第3代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第4代無根組培苗，取所述第4代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第5代無根組培苗，取所述第5代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第6代無根組培苗，取所述第6代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第7代無根組培苗，取所述第7代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第8代無根組培苗，取所述第8代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第9代無根組培苗，取所述第9代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第10代無根組培苗，取所述第10代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第11代無根組培苗，取所述第11代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第12代無根組培苗，取所述第12代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第13代無根組培苗，取所述第13代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第14代無根組培苗，取所述第14代無根組培苗的莖段(帶`一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第15代無根組培苗，取所述第15代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第16代無根組培苗，取所述第16代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第17代無根組培苗，取所述第17代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第18代無根組培苗，取所述第18代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第19代無根組培苗，取所述第19代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第20代無根組培苗，取所述第20代無根組培苗的莖段(帶一個(gè)芽和一片營養(yǎng)葉)在上述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的繼代培養(yǎng)四周，得到第21代無根組培苗。
[0034]其中，每個(gè)繼代周期為4周，上述繼代培養(yǎng)的條件均為每天的光照周期為16小時(shí)光照8小時(shí)黑暗，光強(qiáng)為2000Lx，光照時(shí)溫度為24-25°C，黑暗時(shí)溫度18°C。期間觀察葉片形態(tài)變化，取生長正常的嫩葉測定miR156基因的相對(duì)表達(dá)量。[0035]miR156基因相對(duì)表達(dá)量的檢測方法如下:
[0036](I) miR156基因的提取及檢測
[0037]1)0.5g樣品轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨樣品，期間不斷加入液氮，直至研磨至粉末狀；
[0038]2)向研缽中加入2ml RNAiso for Small RNA，將粉末狀樣品完全覆蓋，室溫靜置，待樣品完全融化繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀；
[0039]3)勻漿液轉(zhuǎn)入離心管，室溫靜置5min。之后12000g4°C離心5min，小心吸取上清液，轉(zhuǎn)入新離心管中；
[0040]4)上清液中加入400ul氯仿，蓋緊離心管管蓋，用手劇烈震蕩15s，待溶液充分乳化后，室溫靜置5min。之后12000g4°C離心15min ；
[0041]5)小心取出離心管，吸取上清至另一新離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒充分混勻，室溫靜置lOmin。之后12000g4°C離心IOmin ；
[0042]6)棄上清，75%乙醇Iml清洗沉淀2次，最后吸盡上清保留沉淀；
[0043]7)室溫干燥5min，加入適量DEPC水溶解沉淀；
[0044]8)取2ulRNA提取樣品，加入IOX loading buffer混勻后，用含EB3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測小分子RNA的完整性；
[0045]9)使用微量紫外分光光度計(jì)檢測小分子RNA的濃度及純度；
[0046](2)利用莖環(huán)引物的RT-PCR`
[0047]RT反應(yīng)體積為20ul，在0.2ml PCR管中先加入RNA1.5ug，RT引物(莖環(huán)引物)Iul和dNTPs (10mmol/l) lul，用DEPC水補(bǔ)足至14ul，混勻65°C變性5min，立即放入冰水混合物中冷卻，然后加入反轉(zhuǎn)錄酶AMV (5U/ul)lul,Buffer(5X)4ul和RNase抑制劑Iul，通過160C 30min;20°C 30s, 42°C 30s, 50°C ls，60 個(gè)循環(huán)；85°C IOmin 完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。對(duì)于內(nèi)參5.8s rRNA的反轉(zhuǎn)錄即將上述中RT引物換成5.8s rRNA本身的RT引物，其它體系及反轉(zhuǎn)錄條件不變。
[0048]反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后取lul cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體積為10ul，含Iul正義PCR引物，Iul反義PCR引物，5ul Premix Taq，用DEPC水補(bǔ)足至IOul0 PCR反應(yīng)程序?yàn)?MV 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 45s30個(gè)循環(huán)；72°C 7min。用含EB的3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0049]RT-PCR的引物如表1。
[0050]表1.RT-PCR中的引物序列(5' —3')
[0051]
【權(quán)利要求】
1.蘋果矮化砧木扦插繁殖方法，包括使離體的成年期蘋果矮化砧木莖尖分生組織在繼代培養(yǎng)基中長成植株，得到成年期蘋果矮化砧木莖尖分生組織初代組培苗，取所述初代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，得到第I代組培苗，取所述第I代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中連續(xù)進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)直到返童，得到返童組培苗；將所述返童組培苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)得到返童組培苗的生根植株，將所述返童組培苗的生根植株移栽到大田，得到采穗母株，取所述采穗母株上的嫩梢作為插穗，用生根劑處理所述插穗得到處理后插穗，將所述處理后插穗插入基質(zhì)中培養(yǎng)得到扦插生根苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘋果矮化砧木扦插繁殖方法，其特征在于:所述得到返童組培苗的方法為取所述第I代組培苗的莖段在所述繼代培養(yǎng)基中連續(xù)進(jìn)行所述繼代培養(yǎng)直到第N代，得到第N代組培苗，所述第N代組培苗即為所述返童組培苗，所述N為大于等于18小于等于21的任一個(gè)自然數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蘋果矮化砧木扦插繁殖方法，其特征在于:所述繼代培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基中加入BA和IBA得到的固體培養(yǎng)基，所述繼代培養(yǎng)基中BA的濃度為0.2mg/L，所述繼代培養(yǎng)基中IBA的濃度為0.5mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的蘋果矮化砧木扦插繁殖方法，其特征在于:所述繼代培養(yǎng)的條件為每天的光照周期為16小時(shí)光照8小時(shí)黑暗，光強(qiáng)為2000LX，光照時(shí)溫度為24-25°C，黑暗時(shí)溫度18°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的蘋果矮化砧木扦插繁殖方法，其特征在于:所述生根培養(yǎng)基為在1/2MS培養(yǎng)基中加入IBA得到的固體培養(yǎng)基，所述生根培養(yǎng)基中IBA的濃度為 0.5mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一所述的蘋果矮化砧木扦插繁殖方法，其特征在于:所述生根培養(yǎng)的條件為每天的光照周期為16小時(shí)光照8小時(shí)黑暗，光強(qiáng)為2000LX，光照時(shí)溫度為24-25°C，黑暗時(shí)溫度18°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一所述的蘋果矮化砧木扦插繁殖方法，其特征在于:所述生根劑的溶劑為水，溶質(zhì)為IBA和H2`O2 ;所述生根劑中，IBA的濃度為3000mg/L，H202的濃度為 50mM。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一所述的蘋果矮化砧木扦插繁殖方法，其特征在于:所述用生根劑處理所述插穗為將所述插穗浸蘸所述生根劑，浸蘸深度為2.0cm，浸蘸時(shí)間為I分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一所述的蘋果矮化砧木扦插繁殖方法，其特征在于:所述蘋果矮化砧木為中砧I號(hào)、M9或M26。
【文檔編號(hào)】A01G1/00GK103814725SQ201410062191
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
【發(fā)明者】韓振海, 肖祖飛, 張艷珍, 吉娜, 張新忠, 王憶, 吳婷, 許雪峰 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)