病毒誘導的花葉滇山茶的葉色調控方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種病毒誘導的花葉滇山茶的葉色調控方法，屬于觀賞作物栽培【技術領域】。具體步驟為：（1）剪取病毒誘導的不同花葉滇山茶植株的葉片放入研缽中，加少量0.01M磷酸鹽緩沖液，研碎成汁液。然后用醫(yī)用注射器取少量汁液，注射接種至‘寶珠茶’滇山茶的葉片主脈中；最后根據接種后的葉片性狀，篩選攜帶病毒的溫和毒株和弱毒株的滇山茶植株；（2）將溫和毒株接種至滇山茶的普通植株，誘導花葉產生，增強觀賞性；或將弱毒株接種至滇山茶的普通植株，利用交叉保護原理，使其免受強毒株和溫和毒株的侵染而保持普通葉色。該方法操作簡單，可根據種植者的喜好，將普通滇山茶的葉色調控為花葉或維持普通葉色。
【專利說明】病毒誘導的花葉滇山茶的葉色調控方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種病毒誘導的花葉滇山茶的葉色調控方法，屬于觀賞作物栽培【技術領域】。
【背景技術】
[0002]彩葉植物因其具有葉色艷麗、觀賞期長、容易造景等優(yōu)勢而一直倍受人們喜愛，花葉植物是其重要組成部分。近年來，病毒誘導的花葉觀賞植物日益增多，然而，對于病毒誘導的花葉調控研究還十分薄弱，不利于病毒誘導的花葉觀賞植物的科學栽培與繁育。
[0003]滇山茶{Camellia reticulata Lindl.)屬山茶科常綠喬木,另ll名“云南山茶花”、“大茶花”，是中國特有種、國家二級重點保護植物、云南省八大名花之首、昆明市市花。至今，滇山茶已有1500多年的栽培歷史，先后被引種到世界各國，以樹體高大、花大繁茂、壽命長而馳名中外，素有“云南山茶甲天下”的美譽。滇山茶的栽培品種約123個，但彩葉品種并不多見。[0004]調查發(fā)現，滇山茶的部分名貴品種為病毒誘導的花葉品種，如‘一品紅’、‘昆明春’、‘大葉桂’、‘早桃紅’、‘花葉寶珠’、‘大瑪瑙’、‘張家茶’、‘瑪瑙紫袍’、‘銀粉牡丹’、‘獅
子頭’、‘紫袍’、‘節(jié)節(jié)高’等。病毒誘導的花葉是病毒入侵和寄主防御形成的一種平衡關系。一些觀賞價值較高的花葉植物正是由于病毒誘導所致，如‘Aureo-reticulata’金銀HLonicera忍冬黃脈花葉病毒(HVCMV)誘導)、‘Tompsonii’ 苘麻
iAeopArasii，芒麻花葉病毒(AbMV)誘導)、‘灑金’桃葉珊瑚japonica)、‘花葉’扶秦{Hibiscus rosa-sinensis)等?？梢?，病毒誘導的花葉植物可以被人們科學利用。
[0005]多年來，昆明、大理等地的普通種植者將病毒誘導的花葉滇山茶視為名貴品種，并在嫁接繁殖中，作為砧木或者接穗，不斷繁殖。但是，人們并不清楚花葉的產生是由于病毒誘導所致，更不清楚花葉的科學調控方法，從而可能帶來以下問題:(I)普通植株感染病毒弱毒株之后，可能不表現出任何花葉性狀，若將其視為普通植株，以攜帶病毒溫和毒株的花葉滇山茶植株作為砧木或者接穗進行嫁接繁殖，由于交叉保護(植物系統地感染某一病毒的株系后，可以免受同種病毒其它株系侵染的現象)的原因，將不能誘導花葉性狀的產生。
(2)若將攜帶病毒強毒株的花葉滇山茶植株作為砧木或者接穗進行嫁接繁殖，會使普通植株感染強病毒，可能使其生長發(fā)育受到較大影響，甚至引起病害。嫁接繁殖的感染率是比較高的:a將病毒誘導的品種用作砧木，而接穗是健康的枝條，砧木中的病毒很有可能傳播至健康的接穗中，從而使接穗出現花葉癥狀，若病毒特性對接穗來說是強毒株，則會表現出病害癥狀；b將病毒誘導的品種用作接穗，一般而言，是在接穗的花葉性狀表現穩(wěn)定且具有較高的視覺吸引力的前提下，以繁殖更多的花葉品種，不會引起病害。但若在繁殖過程中，接穗死亡，而在死亡之前，病毒已傳播至健康的砧木，此后砧木又發(fā)育出新的枝條，新枝條由于病毒的存在而呈現花葉性狀。若這種現象中，病毒特性對砧木來說是強毒株，則會表現出病害癥狀。
[0006]為了克服病毒誘導的花葉滇山茶在今后的繁育中可能出現的以上問題，本發(fā)明提出了一套系統而科學的關于病毒誘導的花葉滇山茶的葉色調控方法。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明提供一種關于病毒誘導的花葉滇山茶的葉色調控方法，可根據種植者的喜好，將普通滇山茶的葉色調控為花葉或維持普通綠葉，具體步驟如下:
1、根據病毒誘導的花葉滇山茶植株的病毒汁液注射接種至普通綠葉滇山茶后的生物學性狀，篩選攜帶病毒溫和毒株和弱毒株的滇山茶植株；
首先剪取病毒誘導的花葉滇山茶的1-5片花葉葉片放入研缽中，加5-15mL的0.01 M磷酸鹽緩沖液，研碎成汁液，靜置10-30分鐘，然后用醫(yī)用注射器取l_5mL上清液，注射接種至普通綠葉滇山茶的葉片主脈中；
攜帶病毒溫和毒株和弱毒株的滇山茶植株篩選，是在接種后的20-60天，出現花葉性狀且花葉的比例低于植株葉片總數的20%,且在之后持續(xù)一年的觀測中，花葉性狀具有良好的視覺吸引力(觀賞性)、具有良好的穩(wěn)定性(遇到霜凍、干旱等現象之后，綠葉保持正常的前提下，花葉也表現正常，未出葉片枯萎等癥狀)的視為攜帶病毒溫和毒株的滇山茶植株；若在接種后的20-60天，出現的花葉性狀在之后持續(xù)一年的觀測中，視覺吸引力(觀賞性)較差，或者不夠穩(wěn)定(如遇到霜凍、干旱等現象之后，綠葉保持正常的前提下，花葉表現出葉片枯萎等癥狀)，則認為病毒的毒性較強，打破了病毒與植株之間的平衡，視為強毒株，應及時銷毀，以免造成植物病害的人為傳播。60天后不出現明顯的花葉現象的視為攜帶病毒弱毒株的滇山茶植株。
[0008]2、若種植者希望`得到花葉滇山茶，可將攜帶溫和毒株的滇山茶花葉葉片汁液注射接種至滇山茶的普通植株葉片主脈中，誘導花葉產生；或者采用貼皮法；
3、若種植者希望普通滇山茶保持普通葉色，可將攜帶弱毒株的滇山茶葉片汁液注射接種至滇山茶的普通植株葉片主脈中，或者采用貼皮法；利用交叉保護原理，使其免受強毒株和溫和毒株的侵染，保持普通葉色。
[0009]貼皮法的具體操作如下:從普通滇山茶植株枝條離端部3-5 cm處剝掉寬度3_5mm、長度為10-15 mm的樹皮,然后從攜帶溫和毒株的滇山茶植株(或者攜帶弱毒株的滇山茶植株)的花葉枝條上端處剝取寬度3-5 mm、長度為10-15 mm的樹皮，最后將從攜帶溫和毒株的滇山茶植株(或者攜帶弱毒株的滇山茶植株)的花葉枝條剝取的樹皮貼合到普通滇山茶植株枝條的樹皮剝離處，樹皮貼合的方向和剝取時的方向一致，并用嫁接塑料條包扎，普通滇山茶植株上部枝條出現花葉性狀后，去除包扎，誘導花葉產生(或者利用交叉保護原理，使其免受強毒株和溫和毒株的侵染，保持普通葉色)。
[0010]本發(fā)明方法中，病毒誘導的花葉滇山茶的葉片識別性狀為:枝條端部的部分葉片(不超過葉片植株葉片總數的40%)為花斑葉(圖1-A)或黃化葉(圖1-B)，其中花斑葉呈現出大小及形狀不規(guī)則的淺黃色斑駁，斑駁中還有不同程度的深綠、淺綠或黃綠色綠島組織，黃化葉則呈現出比較均一的淺黃色。目前，昆明、大理等滇山茶主要栽培區(qū)的常見病毒誘導的花葉品種有‘一品紅’、‘昆明春’、‘大葉桂’ ‘早桃紅’、‘花葉寶珠’、‘大瑪瑙’、‘張家茶’、‘瑪瑙紫袍’、‘銀粉牡丹’、‘獅子頭’、‘紫袍’、‘節(jié)節(jié)高’。
[0011]本發(fā)明方法中，為了證明注射處理之后葉片中病毒的存在，進而解釋溫和毒株誘導的花葉產生或弱毒株交叉保護對綠葉的保持，可采用超薄切片觀測進行驗證:取花葉癥狀明顯的滇山茶的新鮮葉片，切成0.5cm X Icm的小塊，用體積百分比濃度為3.5%戊二醛溶液前固定，質量百分比濃度為1%鋨酸溶液后固定，經酒精、丙酮逐級梯度脫水，再用環(huán)氧樹脂618滲透、包埋，之后半薄切片，光鏡定位，修塊，使用Leica-R型超薄切片機進行切片，經檸檬酸鉛-醋酸鈾雙染色后，在JEM-1Ol I透射電鏡下進行觀察，本發(fā)明中，常見的花葉品種中的病毒為粒體結構，直徑為30-50nm，因此，若能在注射處理后滇山茶中利用超薄切片法觀測到上述形態(tài)的病毒，則可證實病毒的存在對溫和毒株誘導的花葉產生或弱毒株交叉保護對綠葉的保持。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)勢在于:(I)有助于人們認識到曾經被忽視的病毒誘導的花葉滇山茶的花葉現象，誘導花葉性狀產生的植物病毒存在強毒株、溫和毒株和弱毒株之分；(2)在技術上，本發(fā)明可以通過比較直觀的方法，將病毒的強毒株、溫和毒株和弱毒株區(qū)分開來；
(3)帶來的有益效果是:將攜帶強毒株的植株銷毀，避免不必要的人為擴散，從而引起更大的病害發(fā)生；將溫和毒株用來侵染正常植株，誘導花葉性狀穩(wěn)定、觀賞性增加的花葉植株；將弱毒株用來保護正常植株，使綠葉植株不受溫和毒株和強毒株的侵染，從而保持綠葉狀態(tài)。該發(fā)明操作簡單，可根據種植者的喜好，將普通滇山茶的葉色調控為花葉或維持普通綠葉，對于病毒誘導的花葉滇山茶的科學栽培與繁育來說，極為適用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是花葉滇山茶的花斑葉和黃花葉示意圖；圖中A是花斑葉；B是黃化葉；
圖2是本發(fā)明中‘花葉寶珠’滇山茶的病毒形態(tài)電鏡圖；
圖3是本發(fā)明中注射處理后‘花葉寶珠’滇山茶的病毒形態(tài)電鏡圖；
圖4是本發(fā)明中‘一品紅’滇山茶的病毒形態(tài)電鏡圖；
圖5是本發(fā)明中‘寶珠茶’滇山茶感染病毒強毒株的病毒形態(tài)電鏡圖；
圖6是本發(fā)明中‘早桃紅’滇山茶的病毒形態(tài)電鏡圖。
【具體實施方式】
[0014]下面通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不局限于所述內容，實施例中使用試劑如無特殊說明，均為常規(guī)市售或按常規(guī)方法配制的試劑。
[0015]實施例1:
剪取病毒誘導的花葉滇山茶品種‘花葉寶珠’的3片花葉葉片放入研缽中，加IOmL的
0.01 M磷酸鹽緩沖液，研碎成汁液，靜置20分鐘，然后用醫(yī)用注射器取3mL上清液，注射接種至‘寶珠茶’滇山茶的葉片主脈中。36天后，經注射接種的‘寶珠茶’滇山茶上部枝條出現花葉性狀，花葉的比例低于植株葉片總數的20%,且在之后持續(xù)一年的觀測中，花葉性狀具有較高的視覺吸引力，且遇到霜凍和干旱時表現正常，則最初使用的病毒誘導的花葉滇山茶品種‘花葉寶珠’被視為攜帶溫和毒株的滇山茶植株。
[0016]因種植者甲更喜歡花葉滇山茶，所以將攜帶溫和毒株的‘花葉寶珠’葉片汁液注射接種至普通滇山茶一‘寶珠茶’葉片主脈中，48天后，誘導花葉產生(B卩‘花葉寶珠’)，從而增強觀賞性。
[0017]本實施例中，通過超薄切片法，利用透射電鏡觀測了攜帶溫和毒株的‘花葉寶珠’滇山茶葉片中的病毒形態(tài)(圖2)，結果顯示:花葉中的病毒為粒體結構，直徑為30-50nm，可能為雀麥花葉病毒科或黃癥病毒科的病毒(ssRNA)。
[0018]本實施例中，為了證明注射處理之后花葉的產生是由病毒誘導所致，采用超薄切片利用透射電鏡觀測了注射處理之后獲得的‘花葉寶珠’滇山茶葉片中的病毒形態(tài)(圖3)，結果顯示:花葉中的病毒為粒體結構，直徑為30-50nm，與攜帶溫和毒株的‘花葉寶珠’滇山茶葉片中的病毒形態(tài)一致，證實了本實施例中的花葉發(fā)生由通過注射傳播的病毒誘導所致。
[0019]實施例2:
剪取病毒誘導的花葉滇山茶品種‘一品紅’的3片花葉葉片放入研缽中，加12mL的0.01M磷酸鹽緩沖液，研碎成汁液，靜置25分鐘，然后用醫(yī)用注射器取3mL上清液，注射接種至‘寶珠茶’滇山茶的葉片主脈中。45天后，經注射接種‘寶珠茶’滇山茶出現的花葉性狀在之后持續(xù)一年的觀測中，視覺吸引力(觀賞性)較差，且遇霜凍、干旱時，綠葉保持正常的前提下，花葉表現出葉片枯萎等癥狀，則病毒誘導的花葉滇山茶品種‘一品紅’所攜帶的病毒的毒性較強，對‘寶珠茶’滇山茶來說屬于強毒株，不能形成植株與病毒之間的平衡，則應及時銷毀，避免不必要的人為擴散，從而引起更大的病害發(fā)生。
[0020]本實施例中，通過超薄切片法，利用透射電鏡觀測了攜帶強毒株的‘一品紅’滇山茶葉片中的病毒形態(tài)(圖4)，結果顯示:花葉中的病毒為粒體結構，直徑40-50nm，且單位視野中的病毒數較多。
[0021]本實施例中，為了證明注射‘寶珠茶’滇山茶后，花葉產生并有枯萎表現是由強病毒感染所致，采用超薄切片利用透射電鏡觀測了注射處理之后獲得的花葉中的病毒形態(tài)(圖5)，結果顯示:花葉中的病毒為粒體結構，直徑為40-50nm，且單位視野中的病毒數較多，與攜帶強毒株的‘一品紅’滇山茶葉片中的病毒形態(tài)一致，證實了本實施例中的花葉發(fā)生由通過注射傳播的強毒株感染所致。
`[0022]實施例3:
剪取病毒誘導的花葉滇山茶品種‘早桃紅’的5片花葉葉片放入研缽中，加IOmL的0.01M磷酸鹽緩沖液，研碎成汁液，靜置30分鐘，然后用醫(yī)用注射器取5mL上清液，注射接種至‘寶珠茶’滇山茶的葉片主脈中。55天后，經注射接種‘寶珠茶’滇山茶未出現明顯的花葉性狀，且在之后持續(xù)一年的觀測中，花葉性狀具有較高的視覺吸引力，且遇到霜凍和干旱時表現正常，則病毒誘導的花葉滇山茶品種‘早桃紅’被視為攜帶弱毒株的滇山茶植株。
[0023]因種植者丙更喜歡普通滇山茶維持普通綠葉，所以將攜帶弱毒株的‘早桃紅’葉片汁液注射接種至普通滇山茶一‘大桃紅’葉片主脈中，利用交叉保護原理，使其免受強毒株和溫和毒株的侵染而保持普通葉色。
[0024]在注射處理后一年的觀測中，‘大桃紅’的葉片始終保持綠色，且通過注射實施例1中‘花葉寶珠’滇山茶攜帶的溫和毒株和實施例2中‘一品紅’攜帶的強毒株后，大桃紅’的葉片仍然保持綠色，說明本實施例中弱毒株交叉保護獲得成功。
[0025]本實施例中，通過超薄切片法，利用透射電鏡觀測了攜帶弱毒株的‘早桃紅’滇山茶葉片中的病毒形態(tài)，但由于病毒的濃度較低，暫未觀測到病毒。
[0026]本實施例中，為了證明注射處理之后，‘大桃紅’葉片中有病毒弱毒株的存在,采用超薄切片利用透射電鏡觀測了注射處理之后獲得的‘大桃紅’滇山茶葉片中的病毒形態(tài)(圖6)，結果顯示:花葉中的病毒為粒體結構，直徑為50-100nm，單位視野觀測到的病毒數較少，說明病毒的濃度較低。
[0027]實施例4:
剪取病毒誘導的花葉滇山茶品種‘瑪瑙紫袍’的I片花葉葉片放入研缽中，加5mL的
0.01 M磷酸鹽緩沖液，研碎成汁液，靜置15分鐘，然后用醫(yī)用注射器取3mL上清液，注射接種至‘寶珠茶’滇山茶的葉片主脈中。48天后，經注射接種的‘寶珠茶’滇山茶上部枝條出現花葉性狀，花葉的比例低于植株葉片總數的20%，且在之后持續(xù)一年的觀測中，花葉性狀具有較高的視覺吸引力，且遇到霜凍和干旱時表現正常，則最初使用的病毒誘導的花葉滇山茶品種‘瑪瑙紫袍’被視為攜帶溫和毒株的滇山茶植株。
[0028]因種植者甲喜歡花葉滇山茶，采用貼皮法誘導花葉，用經高壓滅菌(溫度120°C，壓強=0.2 MPa，時間20 min)處理過的手術刀從普通滇山茶品種‘大銀紅’植株上部枝條離端部5cm處剝掉寬度5_ (方向與枝條方向垂直)、長度為15_ (方向與枝條方向一致)的樹皮；用經高壓滅菌處理過的手術刀和鑷子從攜帶溫和毒株的‘瑪瑙紫袍’植株上部花葉枝條剝取樹皮，樹皮的大小規(guī)格與從普通滇山茶植株上部枝條剝掉的樹皮大小規(guī)格完全相同、方向一致；用經高壓滅菌處理的鑷子夾取從攜帶溫和毒株的‘瑪瑙紫袍’植株上部花葉枝條剝取樹皮，保持上下方向不變，貼合到‘大銀紅’滇山茶植株上部枝條的樹皮剝離處，然后，用嫁接塑料條將貼合的樹皮包扎好；貼皮處理后第28天，‘大銀紅’滇山茶植株上部枝條出現花葉現象，誘導花葉產生(即‘花葉大銀紅’)，從而增強觀賞性，樹皮貼合處愈合，拆掉嫁接塑料條的包 扎。
【權利要求】
1.一種病毒誘導的花葉滇山茶的葉色調控方法，其特征在于按如下步驟進行: (1)剪取病毒誘導的花葉滇山茶的1-5片花葉葉片放入研缽中，加5-15mL的0.01 M磷酸鹽緩沖液，研碎成汁液，靜置10-30分鐘，然后用醫(yī)用注射器取l_5mL上清液，注射接種至普通綠葉滇山茶的葉片主脈中； (2)在接種后的20-60天，普通綠葉滇山茶出現花葉的比例低于植株葉片總數的20%，且花葉性狀在之后持續(xù)一年的觀測中表現出較高的視覺吸引力和性狀穩(wěn)定性，則視最初使用的病毒誘導的花葉滇山茶為攜帶病毒溫和毒株的滇山茶植株，60天后不出現明顯的花葉現象的，則視最初使用的病毒誘導的花葉滇山茶為攜帶病毒弱毒株的滇山茶植株； (3)若種植者要培育花葉滇山茶，將攜帶溫和毒株的滇山茶植株的溫和毒株接種至普通滇山茶植株中，誘導花葉產生；若種植者要保持普通滇山茶的普通葉色，將攜帶弱毒株的滇山茶植株的弱毒株接種至普通滇山茶植株中，利用交叉保護原理，使其免受強毒株和溫和毒株的侵染，保持普通葉色。
2.根據權利要求1所述病毒誘導的花葉滇山茶的葉色調控方法，其特征在于:步驟(3)中溫和毒株或弱毒株接種至普通滇山茶植株中是指將攜帶溫和毒株的滇山茶植株的花葉葉片汁液或將攜帶弱毒株的滇山茶植株的花葉葉片汁液注射接種至普通滇山茶的植株葉片主脈中，誘導花葉產生或保持普通葉色。
3.根據權利要求1所述病毒誘導的花葉滇山茶的葉色調控方法，其特征在于:步驟(3)中溫和毒株或弱毒株接種至普通滇山茶植株中是采用貼皮法，具體操作為若種植者要誘導花葉滇山茶，從普通滇山茶植株枝條離端部3-5 cm處剝掉寬度3-5 _、長度為10-15 mm的樹皮，然后從攜帶溫和毒株的滇山茶植株的花葉枝條上端處剝取寬度3-5 mm、長度為10-15mm的樹皮，最后將從攜帶溫和毒株的滇山茶植株的花葉枝條剝取的樹皮貼合到普通滇山茶植株枝條的 樹皮剝離處，樹皮貼合的方向和剝取時的方向一致，并用嫁接塑料條包扎，普通滇山茶植株上部枝條出現花葉性狀后，去除包扎，誘導花葉產生；若種植者要保持普通滇山茶的普通葉色，使用上述貼皮方法，利用交叉保護原理，使其免受強毒株和溫和毒株的侵染，保持普通葉色。
【文檔編號】A01G1/06GK103828613SQ201410096858
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月17日 優(yōu)先權日:2014年3月17日
【發(fā)明者】鄭偉, 徐曉丹, 常青 申請人:昆明理工大學